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De procéder au lavage vaginal, coloration au cristal violet et l'évaluation cytologique vaginal pour Souris cycle œstral Staging identification

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Summary

Ici, nous décrivons comment identifier le stade de la reproduction murin (proestrus, oestrus, metestrus ou diestrus) par simple, non invasive collecte et l'évaluation cytologique des échantillons frottis vaginaux. En outre, nous décrivons comment la cytologie vaginale reflète les taux circulants hormonaux qui sous-tendent la transition dans le cycle de reproduction murin.

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McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

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Abstract

Un moyen rapide d'évaluer le statut reproducteur chez les rongeurs n'est pas seulement utile dans l'étude des troubles de la reproduction, mais est également nécessaire pour la production de nouveaux modèles de souris de la maladie et des enquêtes sur la régulation hormonale de la dégénérescence des tissus (ou régénération) après l'épreuve pathologique. Le murin de reproduction (ou oestrus) cycle est divisé en 4 étapes: pro-œstrus, oestrus, metestrus et diœstrus. Fluctuations définies dans les taux circulants des stéroïdes ovariens 17-β-estradiol et de progestérone, les gonadotrophines lutéinisante et folliculo hormones stimulantes, et la transition hormone prolactine lutéotrope signal à travers ces étapes de la reproduction. Les changements dans la typologie de cellules dans le canal vaginal murin tenir compte de ces événements endocriniens sous-jacents. Évaluation journalière de la proportion relative des cellules épithéliales nucléées, cornées cellules épithéliales squameuses, et les leucocytes présents dans les frottis vaginaux peuvent être utilisées pour identifier oestral murinstades. Le degré d'invasivité, cependant, employées dans la collecte de ces échantillons peuvent modifier le statut de la reproduction et provoquer une réponse inflammatoire qui peut confondre l'évaluation cytologique du frottis. Ici, nous décrivons un simple, non invasive protocole qui peut être utilisé pour déterminer le stade du cycle oestral d'une souris femelle sans altérer son cycle de reproduction. Nous détaillons comment faire la différence entre les quatre étapes du cycle œstral par la collecte et l'analyse de la typologie cellulaire prédominant dans les frottis vaginaux et nous montrons comment ces changements peuvent être interprétés en ce qui concerne le statut endocrinien.

Protocol

1. Réactifs Préparation

  1. Pour un lavage vaginal stérile, autoclave eau bidistillée (ddH 2 O) et conserver dans un contenant hermétique à la température ambiante jusqu'au moment de servir.
  2. Pour l'évaluation cytologique, ajouter 0,1 g de poudre de cristal violet à 100 ml de ddH 2 O. Mélangez bien. Cristal violet tache (0,1%) peut être conservé dans un récipient hermétique à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire.

2. Collecte des cellules vaginales (lavage vaginal)

  1. Monter une ampoule de latex sur la fin d'une pointe stérile 200 ul et d'établir environ 100 ul d'eau stérile ddH 2 O en utilisant les graduations sur le bout de ligne directrice volume.
  2. Soulevez la souris hors de sa cage et la placer sur la trémie cage (couvercle) avec son arrière-train / arrière vers vous.
  3. Saisir fermement la queue et élever l'extrémité arrière. La souris sera désormais seulement ses pattes avant saisie de la trémie. A ce stade, la souris peut uriner. Si c'est le cas, Attendez jusqu'à l'arrêt de la miction. Faut-il urine gauche à l'entrée du canal vaginal, vous pouvez rincer l'ouverture avec un excès de O 2 en utilisant ddH une pointe distincte (c'est à dire pas le bout de votre prélèvement de l'échantillon).
  4. Placer l'extrémité de la ddH 2 O-remplie pointe à l'ouverture du canal vaginal en prenant soin de ne pas pénétrer dans l'orifice vaginal comme (et du col) peut induire une stimulation pseudogestation chez le rat 1,2. Des rapports récents suggèrent souris sont moins sensibles à cet effet néanmoins des précautions doivent être prises pour minimiser le degré d'envahissement dans les analyses répétées 3.
  5. Enfoncer doucement l'ampoule pour expulser quart-moitié du volume d'eau (~ 25-50 pi) à l'ouverture de canal vaginal. Le liquide spontanément aspirer dans le canal sans pointe d'insertion. Relâcher lentement la pression exercée sur l'ampoule. Le liquide se replier dans la pointe. Évitez de libération de pression trop rapidement pour prévenir l'aspiration de liquidedans l'ampoule. Un conseil filtrée peut être utile à cet effet.
  6. Répétez les étapes précédentes fois 4-5, en utilisant le même embout, ampoule, et fluide pour obtenir un nombre suffisant de cellules dans un seul échantillon.
  7. Placez le fluide sur lame de verre, et de permettre le frottis sécher complètement à température ambiante. Une fois sec, ces frottis oestrus peut être teinté immédiatement ou stockées et colorées à une date ultérieure.

3. La coloration cytologique l'aide de Crystal Violet * 4

  1. Placer la lame à sec dans un bocal Coplin (ou un autre récipient coloration comparable) contenant le cristal violet coloration pendant 1 min.
  2. Enlever à un deuxième pot Coplin contenant ddH 2 O. Laver la lame avec ddH 2 O pendant 1 min. Répéter.
  3. Retirer l'excédent ddH 2 O à partir des bords de la lame avec un tissu d'essuie-glace légers, en évitant le contact avec le frottis coloré.
  4. Pipeter environ 15 ul de glycérol sur le dessus du frottis et le couvercleglisser. Alternativement, d'autres réactifs histologiques de montage peut être utilisé pour obtenir un plus permanent, non diffusant tache.

* La méthode de coloration décrite ici est la procédure la plus simple qui peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire. D'autres méthodes peuvent fournir des détails supplémentaires. Par exemple, en utilisant une coloration de Papanicolaou, la maturité des cellules épithéliales nucléées peuvent être distingués avec des cellules colorées turquoise moins matures et plus cellules matures rose ou orange-colorés. Ces différences peuvent être utilisés pour organiser proestrus tôt ou tard 4.

4. Cytologie vaginale

  1. Examiner le frottis au microscope optique pour déterminer les types cellulaires présents. L'examen microscopique doit être effectué immédiatement après la coloration comme le cristal violet va diffuser à partir des cellules au cours du temps lors de l'utilisation du glycérol pour recouvrement. Microphotographies doivent être prises au moment de l'analyse pour documenter la cytologie.
  2. Commençons par examiner le entire frottis à un faible grossissement. Sélectionnez une zone représentative et passer à un plus fort grossissement. Vous verrez cornified cellules épithéliales squameuses, leucocytes et / ou nucléées cellules épithéliales (résultats représentatifs, figure 1A-C). Le rapport présente des cellules vous permettra de déterminer le stade oestrus de votre souris au moment du prélèvement des échantillons (résultats représentatifs, figure 1D-G) et son statut hormonal immédiat (discussion, figure 2).

5. Les résultats représentatifs

Cytologie: Trois types de cellules primaires peuvent être détectés dans des échantillons de frottis vaginaux: (1) nucléés cellules épithéliales (Figure 1A), (2) cornified cellules épithéliales squameuses (figure 1B), et (3) des leucocytes (figure 1C). Nucléées cellules épithéliales ont un cytoplasme légèrement teinté, plus sombre teinté membrane plasmique, et un noyau ovale ( (figure 1B). Leucocytes polynucléaires peuvent être distinguées des cellules épithéliales par leur forme irrégulière, sombre et teinté noyaux polymorphes, et de petite taille (figure 1C, flèches noires). En cas de contamination d'urine être présents dans le frottis, cristaux d'acide urique sont facilement détectés par leurs structures cristallines différentes à tous les types de cellules attendus (figure 3). Si cela se produit, et la détection obscure de type cellulaire prédominant, le frottis doit être jeté et ne pas utiliser pour des fins de mise en scène.

Mise en scène: Le rapport relatif des types cellulaires observées dans les frottis peut être utilisée pour identifier le stade du cycle oestral de votre souris sur le jour du prélèvement de l'échantillon (figure 1D-G). Pendant proestrus, les cellules sont presque exclusivementdes grappes de ronde, bien formée nucléées cellules épithéliales (figure 1D, cellule représentant a indiqué par la flèche blanche). Au cours de l'oestrus, les cellules sont principalement cornified cellules épithéliales squameuses, présents dans les amas denses (figure 1E, cellule représentant a indiqué par flèche). Pendant metestrus, petits leucocytes colorés en foncé prédominent (figure 1F, cellule représentant a indiqué par la flèche noire). Cornified cellules épithéliales squameuses peuvent être observés, souvent en fragments, (figure 1F, cellule représentant a indiqué par flèche noire). Pendant diestrus, rares cornées cellules épithéliales squameuses peuvent encore être présentes (figure 1G, cellule représentant a indiqué par flèche noire), mais les leucocytes continuent de prédominer (figure 1G, cellule représentant a indiqué par la flèche noire). Metestrus peut être distingué de dioestrus par l'apparition de cellules épithéliales nucléées dans dioestrus ( g> Figure 1G, cellule représentant a indiqué par la flèche blanche).

Figure 1
Figure 1. L'évaluation cytologique des frottis vaginaux peuvent être utilisés pour identifier stade oestrus Trois principaux types cellulaires sont détectées dans des échantillons de frottis vaginaux:. (A) nucléées, les cellules épithéliales (B) cornées squameuses cellules épithéliales, et (C) des leucocytes. Le rapport de ces types de cellules présents dans le frottis peut être utilisée pour identifier les souris (D) proestrus, (E) l'oestrus, (F) metestrus, ou (G) tel que décrit dans dioestrus résultats représentatifs. Têtes de flèches noires en E, F et G à représentatives point de cornées cellules épithéliales squameuses. Les flèches noires en C, F et du point G à leykocytes représentatives. Les flèches blanches dans D et G représentant culminant nucléation des cellules épithéliales.

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Figure 2. Cytologie sur frottis vaginal reflète les événements endocriniens sous-jacents. Détails sont également fournis dans le rapport. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Cristaux d'acide urique peuvent être présentes ci-dessous coloration au cristal violet d'urine contaminés par des échantillons. (A) Les cristaux sont transparents et peuvent être de tailles différentes (flèches et de la région en boîte agrandies en (B)). Pas de cellules sont présentes dans ce domaine. Devrait urique contamination cristal d'acide dans les champs utilisés pour la coloration cytologique être présent, il peut être difficile d'identifier avec précision les types cellulaires présents et le frottis doit être jeté. Barres d'échelle = 50 um.

Discussion

Ces changements dans la typologie cellules sont indicatifs d'événements endocriniens sous-jacents. La phase de proestrus du cycle oestral correspond à la phase folliculaire humain du cycle menstruel et 5 est défini par une augmentation pré-ovulatoire en circulation β-17-estradiol 6, ainsi que d'une petite poussée en prolactine 7 (Figure 2, Proestrus, panneau de gauche). L'augmentation de la 17-β-estradiol stimule indirectement gonadolibérine hormone de neurones dans l'hypothalamus et le septum qui, à leur tour, activent les cellules sensibles dans l'hypophyse antérieure pour libérer l'hormone lutéinisante et hormone folliculo-stimulante dans la circulation 8,9 (figure 2 , Proestrus, panneau de gauche). Dans les frottis vaginaux prélevés sur des animaux dans proestrus, les cellules sont presque exclusivement des ovales nucléées cellules épithéliales (figure 1D, figure 2, Proestrus, panneau de droite). Le pic de folliculo-stimulante hormune ovulation et les niveaux des signaux d'entrée en oestrus 10,11. Au cours de l'oestrus, 17-β-estradiol et de prolactine baisse des niveaux de pointe 6,7 (Figure 2, oestrus, panneau de gauche). Frottis vaginaux sont caractérisées par une détection quasi exclusif de cornées irrégulières cellules épithéliales squameuses souvent en touffes (figure 1E, figure 2, oestrus, panneau de droite). Entrée en metestrus coïncide avec une hausse continue des taux d'hormones progestérone 6 et correspond au début de la phase lutéale humaine 12 (figure 2, metestrus, panneau de gauche). Comme les niveaux de progestérone commence à augmenter et il ya une petite abattée en 17-β-estradiol en réponse à l'activation du corps jaune 6,13,14 (Figure 2, metestrus, panneau de gauche). Les types cellulaires présents dans les frottis vaginaux au cours de cette étape sont fragmentés, cornées cellules épithéliales et les leucocytes sombres petites tachés (Figure 1F, figure 2, metestrus, panneau de droite). Enfin, l'entrée en diestrus chez la souris se produit et les taux circulants de progestérone pic 6, correspondant à la phase lutéale tardive de l'homme 12. Régression du corps jaune entraîne une baisse brutale de la progestérone 15,16 (figure 2, Diestrus, panneau de gauche). Leucocytes prédominent dans les frottis au cours diestrus. La fréquence des cornées cellules épithéliales est réduite et nucléées cellules épithéliales commencent à être détectée juste avant la transition à proestrus (figure 1G, figure 2, Diestrus, panneau de droite).

En résumé, ce protocole simple, la routine peut être utilisée pour estimer les fluctuations hormonales quotidiennes et d'établir stade oestrus chez les souris expérimentales, sans modifier le statut reproducteur si les précautions suivantes sont prises. L'échantillonnage doit être effectué au plus une fois par jour en utilisant le protocole non invasif described ici par rapport à la pénétration répétée du canal vaginal, aspiration, et une agitation. Ceci peut provoquer une irritation vaginale, résultant en une réponse inflammatoire résultant 17 dans les leucocytes et les autres types de cellules d'être présents dans les frottis qui peuvent confondre évaluation cytologique. En outre, même dans les colonies logées les femmes, il est normal de voir diestrus longues et des stades différents d'oestrus chez la souris que l'induction et de 18 anestrous et cette identification est utile dans l'interprétation de l'impact hormonal de la reproduction, le sexe et l'étude des maladies. La variabilité dans la longueur du cycle est également mis en place avec l'âge et par les différences de logements dans les colonies (individu ou un groupe-logement) des femelles 7,19-21. Femelles hébergées chez la femelle-seulement les colonies peuvent cesser de vélo et entrer dans un état ​​de longue diestrus 18,22,23 bien que le vélo peut être rétablie par l'exposition à des cages prétraitées avec de l'urine mâle à obtenir le cyclisme 24,25. Ainsi, pour établir individualongueurs de cycle l pour une souris donnée, il est recommandé que les évaluations non invasives décrites ici sont effectuées chaque jour, avec soin, jusqu'à ce que deux cycles complets sont respectées.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les directives et règlements établis par l'Université d'Ottawa Comité des soins des animaux et le Conseil canadien de protection des animaux.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Marc Leonard de Carleton Immersive Media Studio pour une assistance technique experte dans la production et le montage vidéo et le Dr Martin Bertrand de Carleton Immersive Media Laboratory régénération Studio / Neural à l'aide du modèle visuel. Les auteurs tiennent à remercier le conseil d'expert du Dr Marilyn Keaney et tout son personnel dévoué de l'Université de protection des animaux d'Ottawa et les Services vétérinaires. Ce travail a été financé par l'Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC, MOP 62826) pour SALB, l'Institut du vieillissement des IRSC et l'Initiative stratégique de formation en recherche en santé / Programme de formation des IRSC en Lipidomique neurodégénératives (96121 TGF) à SALB et SF, Fondation canadienne pour l'innovation à SF, Ontario Innovation Trust à SF, et Autodesk recherche à SF. ACM reçoit une Banting et Best IRSC bourse de doctorat. NV reçoit une bourse de recherche post-professionnelle de l'Institut du vieillissement des IRSC et de formation dans Lipidomique neurodégénératives.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

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