Author Produced

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Burada, basit, non-invaziv toplama ve vaginal smear örneklerinin sitolojik değerlendirmesi ile fare üreme (Proestrus, kızgınlık, metestrus veya diestrus) aşamasında nasıl belirleneceği açıklanmaktadır. Biz daha vajinal sitoloji fare üreme döngüsü boyunca geçiş yatan hormonal seviyeleri dolaşımdaki nasıl yansıttığını açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemirgenlerde üreme durumunu değerlendirmede hızlı bir araç değil sadece üreme disfonksiyon çalışmada yararlıdır ama aynı zamanda patolojik karşılaştırmadan sonra doku dejenerasyonu hormonal regülasyonu (veya rejenerasyon) içine yeni fare hastalık modelleri ve soruşturmaların üretimi için gereklidir. Proestrus, kızgınlık, metestrus ve diestrus: fare üreme (veya östrus) döngüsü 4 aşamadan ayrılmıştır. Over steroid 17-β-östradiol ve progesteron seviyelerini dolaşan Tanımlı dalgalanmalar, gonadotropinler luteinizan ve uyarıcı hormonlar folikül ve bu üreme aşamaları luteotropic prolaktin hormonu sinyal geçişi. Murin vajinal kanal içinde hücre tipolojisi değişiklikler bu temel endokrin olayları yansıtmaktadır. Çekirdekli epitel hücreleri, boynuzsu yassı epitel hücreleri, ve vajinal smear içinde mevcut lökositlerin göreli oran günlük değerlendirme mürin estrojen belirlemek için kullanılabiliraşamaları. Invazivlik derecesi, ancak bu örneklerin üreme durumunu değiştirmez ve smear sitolojik değerlendirilmesi bulandırabilir inflamatuar bir yanıt ortaya çıkarmak olabilir toplayarak istihdam. Burada, biz onu üreme döngüsü değiştirmeden bir kadın fare östrus siklusunun evresini belirlemek için kullanılabilecek basit, non-invaziv protokol açıklar. Biz nasıl dört vajinal smear baskın hücre tipolojisinin toplanması ve analizi ile östrus siklusunun evreleri ve bu değişikliklerin endokrin durumuna göre yorumlanabilir göstermek ayırt ayrıntı.

Protocol

1. Hazırlanması Reaktifler

  1. Gerekinceye kadar steril vajinal lavaj için, oda sıcaklığında, sıkıca kapatılmış bir kap içinde çifte damıtılmış su (GKD 2 O) ve depo otoklava.
  2. Sitolojik değerlendirme için GKD 2 O. 100 ml kristal viyole toz 0.1 g ekleyebilir İyice karıştırın. Gerekinceye kadar kristal mor leke (% 0.1), oda sıcaklığında, sıkıca kapatılmış bir kap içinde muhafaza edilebilir.

2. Toplama Vajinal Hücreler (Vajinal Lavaj)

  1. Steril 200 ul ucu ucuna bir lateks ampul yerleştirin ve steril GKD 2 O bir ses kılavuz olarak ucu tonlamalarını kullanarak yaklaşık 100 ul hazırlar.
  2. Onu kafes fare dışarı kaldırın ve kendinize doğru onu arka / arka ucu ile kafes hazne (kapaklı) onu yerleştirmek.
  3. Sıkıca kuyruk kavrayın ve arka uç yükseltmek. Şimdi fare hazne kavrayarak sadece onu ön pençeleri var olacaktır. Bu noktada, fare idrara. Öyleyse, Idrara çıkma durana kadar bekleyin. Orada vajinal kanal girişinde sol idrar olmalı, ayrı bir ucu (yani, sizin örnek toplama ucu) kullanarak fazla GKD 2 O ile açılış durulama isteyebilirsiniz.
  4. Vajinal (ve servikal) stimülasyon sıçanlarda 1,2 pseudopregnancy uyarabilir olarak orifis nüfuz edemez özen vajinal kanalın açılışında GKD 2 O dolu ucu sonu yerleştirin. Son raporlar fareler yine bakım tekrarlanan analizler 3 invazivlik derecesini en aza indirmek için alınması gereken bu etkiyi daha az duyarlı olduğunu düşündürmektedir.
  5. Yavaşça vajinal kanalın açılışında su (~ 25-50 ul) hacminin yarısına dörtte sınırdışı ampulü bastırın. Sıvı kendiliğinden ucu ekleme olmadan kanal içine aspire olacaktır. Yavaşça ampul üzerine uyguladığı basınca bırakın. Sıvı ucu geri çekilecek. Sıvı aspirasyonu önlemek için çok hızlı bir şekilde serbest basınç kaçınınampul takın. Filtre edilmiş uç bu amaç için yararlı olabilir.
  6. Tek bir örnek bir hücre elde etmek için yeterli sayıda aynı ucu, ampul, ve sıvı ile bir önceki adımda 4-5 kez tekrarlayın.
  7. Cam slayt üzerine sıvı yerleştirin ve yayma tamamen oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, bu östrus lekeler hemen lekeli veya saklanan ve daha sonraki bir tarihte lekeli olabilir.

3. Kristal Violet kullanarak Sitolojik Boyama * 4

  1. Kristal viyole 1 dakika leke içeren bir Coplin kavanoz (veya diğer benzer boyanma damar) içinde kuru slayt yerleştirin.
  2. GKD 2 O. içeren ikinci Coplin kavanoz çıkarın 1 dakika GKD 2 O ile slayt yıkayın. Tekrarlayın.
  3. Lekeli smear ile temas kaçınarak, hafif vergili doku silecek ile slayt kenarlarından aşırı GKD 2 O çıkarın.
  4. Yayma ve kapak üstüne gliserol Pipet yaklaşık 15 ulslip. Alternatif olarak, diğer histolojik montaj reaktifler, bir daha kalıcı olmayan, leke difüzyon elde etmek için kullanılabilir.

Burada anlatılan * boyama yöntemi, herhangi bir laboratuvar yapılabilir basit bir işlemdir. Diğer yöntemler ek ayrıntıları sağlayabilir. Örneğin, Papanicolaou yöntemiyle, çekirdekli epitel hücrelerinin vadesi olgun hücrelere lekeli turkuaz ve daha olgun hücreler pembe ya da turuncu-lekeli ile ayırt edilebilir. Bu farklılıklar, erken ya da geç Proestrus hazırlamak için de kullanılabilir. 4

4. Vajinal Sitoloji

  1. Hücre tipleri mevcut belirlemek için ışık mikroskobunda smear inceleyin. Mikroskop incelemesi için coverslipping gliserol kullanıldığı zaman kristal viyole saat boyunca hücrelerin dağılacaktır olarak lekeleme hemen sonra yapılmalıdır. Fotomikrografı sitoloji belgelemek için analiz sırasında alınmalıdır.
  2. Entir inceleyerek başlayındüşük büyütmede e smear. Temsili bir alan seçin ve daha yüksek bir büyütme taşımak. Eğer (temsili sonuçlar, Şekil 1A-C) yassı epitel hücreleri, lökositler, ve / veya çekirdekli epitel hücreleri boynuzsu görür. Hücrelerin mevcut oran, numune toplama zamanı (temsilcisi sonuçlar, Şekil 1D-G) ve onun derhal hormonal durumu (tartışma, Şekil 2) fare östrus evresini belirlemek için izin verir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Sitoloji: Üç birincil hücre tipleri vaginal smear örneklerinde tespit edilebilir: (1) çekirdekli epitel hücreleri (Şekil 1A), (2) skuamöz epitel hücreleri (Şekil 1B), ve (3) lökosit (Şekil 1C) Boynuzsu. Çekirdekli epitel hücreleri hafifçe lekeli sitoplazma, koyu lekeli plazma zarı ve oval nükleus var ( (Şekil 1B) yoksundur. Polimorfonükleer lökositler onların düzensiz şekil, koyu lekeli polimorfik nukleus ve küçük boyutu (Şekil 1C, siyah oklar) ile epitel hücreleri ayırt edilebilir. Idrar kontaminasyon yayma mevcut olmalı, ürik asit kristalleri kolayca herhangi beklenen hücre tipleri (Şekil 3) benzemeyen kendi kristal yapılar tarafından algılanır. Bu meydana, ve baskın hücre tipi belirsiz tespiti halinde, smear atılır ve Aşamalandırma amacıyla kullanılmaz edilmelidir.

Hazırlama: lekeleri içinde gözlenen hücre tipleri arasında nispi oranı, numune toplama gününde (şekil 1D-G) fare estrojen döngüsü aşamasına belirlemek için kullanılabilir. Proestrus sırasında hücreler hemen hemen özeldiryuvarlak kümeleri, epitel hücreleri (Şekil 1D, beyaz ok ile gösterilen temsili hücre) çekirdeğini iyi biçimlidir. Kızgınlık sırasında hücreler ağırlıklı yoğun dolu kümeleri bulunan skuamöz epitel hücreleri, (Şekil 1E, ok ucu ile gösterilen temsili hücre) Boynuzsu edilir. Metestrus sırasında, küçük koyu lekeli lökosit (Şekil 1F, siyah ok ile gösterilen temsili hücre) baskındır. Boynuzsu yassı epitel hücreleri genellikle parçacıkları, (Şekil 1F, beyaz ok ucu ile gösterilen temsili hücre) içinde görülebilir. Diestrus sırasında nadir Boynuzsu skuamöz epitel hücreleri hala (Şekil 1G, siyah ok ucu ile gösterilen temsili hücre) mevcut olabilir, ancak lökosit hala (Şekil 1G, siyah ok ile gösterilen temsili hücre) baskındır. Metestrus diestrus içinde çekirdekli epitel hücrelerinin görünümü (diestrus ile ayırt edilebilir g> Şekil 1G, temsili hücre) beyaz okla gösterilir.

Şekil 1
Şekil 1. Vaginal smear sitolojik değerlendirilmesi östrus aşamada tanımlamak için kullanılan üç ana hücre tipi vajinal smear örneklerinde tespit edilmiştir:. (A) çekirdekli epitel hücreleri, (B) Boynuzsu skuamöz epitel hücreleri, ve (C) lökositler. Yayma mevcut olan bu hücre tipleri oranı (D) Proestrus, (E) kızışma, (F) metestrus, ya da (G) diestrus olarak temsil eden sonuçlar tarif fareler belirlemek için kullanılabilir. Temsilcisi Boynuzsu skuamöz epitel hücreleri E, F ve G noktası Siyah ok başları. Temsilcisi leykocytes C, F ve G noktası siyah oklar. D ve G vurgulamak temsilcisi Beyaz oklar epitel hücreleri çekirdekleşirken.

. Jpg "alt =" Şekil 2 "/>
Şekil 2. Vajinal smear sitoloji yatan endokrin olayları yansıtır. Ayrıntılar ayrıca Tartışma sağlanmaktadır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3,. Ürik asit kristalleri idrar-kontamine örneklerin bugünkü şu kristal violet boyama olabilir. (A) Kristaller şeffaf ve çeşitli boyutlarda ((B) büyütülmüş oklar ve kutulu bölge) olabilir. Resim hücreleri, bu alanda bulunmaktadır. Sitolojik boyama için kullanılan alanlar içinde ürik asit kristal kirlenme mevcut olmalı, doğru hücre tipleri mevcut ve yayma atılmalıdır tespit etmek zor olabilir. Ölçek bar = 50 mikron.

Discussion

Hücre tipoloji Bu değişiklikler altta yatan endokrin olaylar göstergesidir. Estrojen döngüsü Proestrus faz adet döngüsünün 5 insan foliküler faz karşılık gelir ve 17-β-estradiol düzeyleri 6 dolaşan bir ön-ovulatuar artışın, aynı zamanda prolaktin 7 küçük dalgalanma (Şekil 2 ile tanımlanır, Proestrus, sol panel). 17-β-estradiol artış dolaylı uyarır gonadotropin salgılatıcı sırayla, sirkülasyon 8,9 içine luteinizan hormon ve follikül uyarıcı hormon serbest bırakmak için ön hipofiz içinde duyarlı hücreleri aktive, hipotalamus ve septumda hormon nöronlar (Şekil 2 , Proestrus, sol panel). Proestrus yılında hayvanlardan alınan vajinal smear, hücreler neredeyse sadece oval nükleuslu epitel hücreleri (Şekil 1D, Şekil 2, Proestrus, sağ panel) vardır. Folikül uyarıcı Horm yılında zirvekızışma 10,11 içine bir düzeyde sinyalleri yumurtlama ve giriş. Kızgınlık sırasında, 17-β-östradiol düzeyleri düşüş ve prolaktin seviyeleri zirve 6,7 (Şekil 2, Östrus, sol panel). Vajinal smear kümeleri genellikle düzensiz şekilli Boynuzsu skuamöz epitel hücreleri (Şekil 1E, Şekil 2, Östrus, sağ panel) neredeyse özel algılama ile karakterizedir. Metestrus girmesi progesteron hormon düzeyleri 6 sürekli bir artış ile çakışmaktadır ve insan luteal faz 12 (Şekil 2, Metestrus, sol panel) başlangıcına karşılık gelir. Progesteron seviyeleri yükselmeye başlar ve korpus luteum aktivasyon 6,13,14 (Şekil 2, Metestrus, sol panel) yanıt olarak 17-β-estradiol düzeyleri küçük bir dalgalanma var gibi. Bu aşamada sırasında vajinal smear mevcut hücre tipleri parçalanmış, boynuzsu epitel hücreleri ve küçük koyu lekeli lökosit (Figür vardırE 1F, Şekil 2, Metestrus, sağ panel). Son olarak, farelerde diestrus içine giriş oluşur ve progesteron seviyeleri insan geç luteal faz 12 karşılık gelen tepe 6, dolaşan. Corpus luteum Regresyon progesteron seviyeleri 15,16 bir sonraki keskin bir düşüş (Şekil 2, Diestrus, sol panel) yol açar. Lökositler diestrus sırasında smear baskındır. Boynuzsu epitel hücrelerinin sıklığı azalır ve çekirdekleşirken epitel hücrelerinin hemen önce Proestrus (Şekil 1G, Şekil 2, Diestrus, sağ panel) geçiş algılanabilir başlarız.

Özetle, bu basit, rutin protokolü günlük hormonal dalgalanmalar tahmin ve aşağıdaki önlemler alındığı takdirde üreme durumunu değiştirmeden deneysel farelerde östrus sahne kurmak için kullanılabilir. Örnekleme günde bir kez invazif olmayan bir protokol kullanılarak azalan fazla yapılmalıdırvajinal kanal, aspirasyon ve ajitasyon tekrarlanan penetrasyonu ile karşılaştırıldığında burada belirlemiş. Bu sitolojik değerlendirme yanıltabilecek smear mevcut olduğu lökosit ve diğer hücre tipleri ile sonuçlanan bir inflamatuvar yanıt 17 sonuçlanan vajinal tahrişe neden olabilir. Dahası, koloni yer kadınlarda, iyi anestrous 18 indüksiyonu ve bu tanımlama üreme, cinsiyet hormonal etkisi yorumlanması yararlıdır, ve hastalık çalışmaları gibi farklı farelerde uzun diestrus ve kızışma aşamaları görmek normaldir. Döngüsü uzunluğu değişkenlik de yaş ile birlikte kadın ve 7,19-21 kolonileri içinde konut farklılıkları (bireysel ya da grup-konut) tarafından tanıtıldı. Sadece kadınların koloniler içinde yer Dişiler bisiklet durdurma ve bisiklet bisiklet 24,25 ortaya çıkarmak için erkek idrar ile önceden kafesleri maruz tarafından yeniden aktarabileceği rağmen uzamış diestrus 18,22,23 bir devlet girebilirsiniz. Böylece, individua kurmakBelirli bir fare için l döngü uzunlukları, iki tam devir gözlenir kadar burada açıklanan non-invaziv değerlendirmeler, bakım, günlük yapılması tavsiye edilir.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim. Hayvanlar üzerinde tüm deneyler Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere tam uyum içinde yapıldı.

Acknowledgments

Biz görsel modeli yardım için video üretimi ve kurgusu ve Carleton Dr Martin Bertrand Immersive Media Studio / Sinir Rejenerasyon Laboratuvar uzman teknik yardım için Carleton Immersive Media Studio Marc Leonard teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar minnetle Dr Marilyn Keaney ve Ottawa Hayvan Bakım ve Veteriner Hizmetleri Üniversitesi'nde adanmış tüm personelin uzman tavsiyesi kabul. Bu çalışma SALB, Yaşlanma CIHR Enstitüsü ve SALB ve SF, Kanada Vakfı Nörodejeneratif Lipidomics Sağlık Araştırma / CIHR Eğitim Programı (TGF 96121) Stratejik Eğitim Girişimi, Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü (CIHR, MOP 62826) tarafından finanse edilmiştir SF, SF Ontario Yenilik Güven ve SF Autodesk Araştırma Yenilik. ACM CIHR Banting ve iyi doktora ödülü aldı. NV Yaşlanma ve Nörodejeneratif Lipidomics yılında CIHR Eğitim Programı Enstitüsü sonrası profesyonel bursu alır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
  2. Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
  3. Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
  4. Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
  5. Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
  6. Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
  7. Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
  8. Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
  9. Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
  10. Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
  11. Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
  12. Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. 124-229 (2011).
  13. Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
  14. Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
  15. Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
  16. Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
  17. Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
  18. Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
  19. Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
  20. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
  21. Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
  22. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
  23. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
  24. Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
  25. Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics