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Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo

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Summary

Aquí se describe cómo identificar la etapa del ratón reproductiva (proestro, estro, metaestro o diestro) por simple, no invasivo recogida y evaluación citológica de muestras de frotis vaginales. Nos describen con más detalle cómo citología vaginal refleja los niveles circulantes de hormonas subyacentes transición a través del ciclo reproductivo murino.

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McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

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Abstract

Un medio rápido para evaluar el estado reproductivo en roedores es útil no sólo en el estudio de la disfunción reproductiva, sino que también es necesario para la producción de nuevos modelos de ratón de la enfermedad y las investigaciones en la regulación hormonal de la degeneración del tejido (o regeneración) después de la estimulación patológica. El murino reproductiva (o estro) ciclo se divide en 4 etapas: proestro, estro, metaestro y diestro. Fluctuaciones definidas en los niveles circulantes de los esteroides ováricos 17-β-estradiol y progesterona, las gonadotropinas luteinizante y hormonas estimulantes del folículo, y la prolactina luteotropic hormona transición de la señal a través de estas etapas de reproducción. Los cambios en la tipología de células dentro del canal vaginal murino reflejar estos eventos endocrinos subyacentes. Evaluación diaria de la proporción relativa de células nucleadas cornificadas epiteliales, células epiteliales escamosas, y leucocitos presentes en los frotis vaginales se pueden utilizar para identificar murino estraletapas. El grado de invasividad, sin embargo, empleado en la recogida de estas muestras puede alterar el estado reproductivo y provocar una respuesta inflamatoria que puede confundir la evaluación citológico de frotis. Aquí se describe un simple, no invasivo protocolo que se puede utilizar para determinar el estadio del ciclo estral de una hembra de ratón sin alterar su ciclo reproductivo. Detallamos cómo diferenciar entre las cuatro fases del ciclo estral por la recolección y el análisis de la tipología predominante de células en frotis vaginales y nos muestran cómo estos cambios pueden ser interpretados con respecto al estado endocrino.

Protocol

1. Preparación de Reactivos

  1. Para el lavado vaginal estéril, autoclave agua doblemente destilada (DDH 2 O) y guárdela en un recipiente herméticamente cerrado, a temperatura ambiente hasta que se necesite.
  2. Para la evaluación citológica, añadir 0,1 g de polvo de cristal violeta a 100 ml de ddH 2 O. Mezclar bien. Tinción de cristal violeta (0,1%) se puede almacenar en un recipiente herméticamente cerrado a temperatura ambiente hasta que se necesite.

2. Recolección de células vaginales (lavado vaginal)

  1. Colocar una bombilla de látex en el extremo de una punta estéril 200 l y elaborar aproximadamente 100 l de ddH 2 O estéril utilizando las gradaciones en la punta como una guía volumen.
  2. Levante el ratón fuera de su jaula y coloque la jaula en la tolva (tapa) con su extremo trasero / trasero hacia usted.
  3. Sujete firmemente la cola y elevar el extremo posterior. El ratón tendrá ahora sólo sus patas delanteras prensiles la tolva. En este punto, el ratón puede orinar. Si es así, Espere hasta que deje de orinar. ¿Debería haber orina que queda en la entrada del canal vaginal, es posible que desee aclarar la abertura con el exceso de O 2 ddH usando una punta diferente (es decir, no con la punta de recogida de muestras).
  4. Coloque el extremo de la ddH 2 O llena de punta en la abertura del canal vaginal, teniendo cuidado de no penetrar en el orificio vaginal como (y cervical) estimulación puede inducir pseudopreñez en ratas 1,2. Los informes recientes sugieren que los ratones son menos susceptibles a este efecto, sin embargo se debe tener cuidado para reducir al mínimo el grado de invasividad en análisis repetidos 3.
  5. Presione suavemente la bombilla para expulsar un cuarto a la mitad del volumen de agua (~ 25-50 l) en la apertura del canal vaginal. El líquido aspirado de forma espontánea en el canal sin la punta de inserción. Lentamente libere la presión ejercida sobre el bulbo. El fluido se retire de nuevo en la punta. Evite liberación de presión demasiado rápido para evitar la aspiración de líquidoen el bulbo. Una punta filtrada puede ser útil para este propósito.
  6. Repetir los tiempos de las etapas anteriores 4-5 utilizando la misma punta, bulbo, y el líquido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra.
  7. Coloque el fluido sobre portaobjetos de vidrio, y permitir que el frotis se seque por completo a temperatura ambiente. Una vez seca, estos frotis estrales puede teñir inmediatamente o almacenarse y se tiñeron en una fecha posterior.

3. Tinción citológica utilizando Crystal Violet * 4

  1. Colocar el portaobjetos en seco en un vaso de Coplin (u otro recipiente de tinción comparable) que contiene el colorante cristal violeta durante 1 min.
  2. Retirar a un segundo vaso de Coplin que contiene ddH 2 O. Lave el portaobjetos con ddH 2 O durante 1 min. Repetir.
  3. Retire el exceso ddH 2 O de los bordes de la diapositiva con un limpiador de tejidos ligeros, evitando el contacto con la tinción.
  4. Pipetear aproximadamente 15 l de glicerol en la parte superior de la tinción y la taparesbale. Alternativamente, otros reactivos histológicos de montaje pueden ser utilizados para obtener un más permanente, no difusora mancha.

* El método de tinción descrito aquí es el procedimiento más simple que puede realizarse en cualquier laboratorio. Otros métodos pueden proporcionar detalles adicionales. Por ejemplo, mediante la tinción de Papanicolaou, la madurez de las células epiteliales nucleadas se pueden distinguir con células menos maduras maduras células teñidas de color turquesa y más rosa o anaranjado-teñidas. Estas diferencias se pueden utilizar para la etapa proestro temprano o tardío. 4

4. Citología Vaginal

  1. Examinar el frotis al microscopio óptico para determinar los tipos de células presentes. El examen microscópico se debe hacer inmediatamente después de la tinción de cristal violeta como se difundirá a partir de las células con el tiempo cuando se usa glicerol para cubreobjetos. Las microfotografías deben tomarse en el momento de análisis para documentar la citología.
  2. Comience por examinar la entire frotis con un aumento menor. Seleccione un área representativa y pasar a un mayor aumento. Verá cornificación células epiteliales escamosas, leucocitos, y / o células epiteliales nucleadas (resultados representativos, la figura 1A-C). La proporción de células presentes le permitirá determinar la etapa de estro de su ratón en el momento de la toma de muestras (resultados representativos, Figura G-1D) y su estado hormonal inmediata (discusión, Figura 2).

5. Los resultados representativos

Citología: Tres tipos de células primarias pueden ser detectados en muestras de frotis vaginales: (1) células nucleadas epiteliales (Figura 1A), (2) cornificación células epiteliales escamosas (Figura 1B), y (3) los leucocitos (Figura 1C). Nucleados células epiteliales tienen un citoplasma ligeramente manchado, manchado oscuro membrana plasmática, y un núcleo oval ( (Figura 1B). Los leucocitos polimorfonucleares se pueden distinguir de las células epiteliales por su forma irregular, núcleos polimórfico oscuro manchado, y el pequeño tamaño (Figura 1C, las flechas negras). En caso de contaminación de la orina estar presente en el frotis, cristales de ácido úrico se detectan fácilmente por sus estructuras cristalinas diferentes a cualquier tipo de celda esperados (Figura 3). Si esto ocurre, y la detección oscura de tipo celular predominante, la prueba debe ser desechado y no se utiliza para fines de estadificación.

Montaje: La proporción relativa de los tipos de células observadas en frotis se puede utilizar para identificar la fase del ciclo estral de su ratón en el día de la recogida de muestras (Figura 1D-G). Durante el proestro, las células son casi exclusivamenteracimos de vuelta, bien formado nucleados células epiteliales (Figura 1D, célula representativa indicada por la flecha blanca). Durante el estro, las células son predominantemente cornificación células epiteliales escamosas, presentes en racimos compactados (Figura 1E, célula representante indicado por punta de flecha). Durante metaestro, pequeñas leucocitos oscuramente teñidos predominan (Figura 1F, célula representativa indicada por la flecha negro). Cornified células epiteliales escamosas se puede observar, a menudo en fragmentos, (Figura 1F, célula representativa indicada por negro punta de flecha). Durante el diestro, raras cornificadas células epiteliales escamosas puede aún estar presente (Figura 1G, célula representativa indicada por negro punta de flecha), sin embargo aún predominan los leucocitos (Figura 1G, célula representativa indicada por la flecha negro). Metaestro puede distinguirse de diestro por la aparición de células epiteliales nucleadas en diestro ( g> Figura 1G, célula representativa indicada por la flecha blanca).

Figura 1
Figura 1. Evaluación citológico de frotis vaginal puede ser utilizado para identificar la etapa estral tres principales tipos de células se detectan en muestras de frotis vaginales:. (A) las células epiteliales nucleadas, (B) cornificadas células epiteliales escamosas, y leucocitos (C). La proporción de estos tipos de células presentes en el frotis se puede utilizar para identificar en ratones (D) proestro, (E) estro, (F) metaestro, o diestro (G) como se describe en los resultados representativos. Puntas de flecha negras en E, F y G a punto representativos cornificadas células epiteliales escamosas. Las flechas negras en C, F y G a punto leykocytes representativas. Las flechas blancas en D y G representante más destacado nucleados células epiteliales.

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Figura 2. Citología vaginal smear refleja hechos subyacentes endocrinos. Detalles se proporcionan también en discusión. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3
Figura 3. Cristales de ácido úrico puede estar presente siguiente de tinción de cristal violeta de orina contaminados-muestras. (A) los cristales son transparentes y pueden ser de varios tamaños (flechas y la región en caja magnificados en (B)). No hay células están presentes en este campo. En caso de contaminación úrico cristales de ácido dentro de los campos utilizados para la tinción citológica estar presente, puede ser difícil identificar con precisión los tipos de células presentes y el frotis debe ser desechado. Las barras de escala = 50 micras.

Discussion

Estos cambios en la tipología de células son indicativos de eventos endocrinos subyacentes. La fase proestro del ciclo estral se corresponde con la fase folicular humano del ciclo menstrual y 5 se define por un aumento preovulatorio en circulante 17-β-estradiol niveles 6, así como un aumento pequeño en la prolactina 7 (Figura 2, proestro, panel izquierdo). El aumento de 17-β-estradiol estimula indirectamente liberadora de gonadotropina hormona de neuronas en el hipotálamo y el septo que, a su vez, activan las células sensibles en la pituitaria anterior para liberar hormona luteinizante y hormona estimulante del folículo en la circulación 8,9 (Figura 2 , Proestro, panel izquierdo). En los frotis vaginales obtenidas de los animales en proestro, las células son casi exclusivamente ovales células nucleadas epiteliales (Figura 1D, la figura 2, el proestro, panel derecho). El pico en horm estimulante del folículouna ovulación y los niveles de las señales de entrada en estro 10,11. Durante el estro, 17-β-estradiol disminuyen los niveles de los niveles de prolactina y pico de 6,7 (Figura 2, estro, panel izquierdo). Frotis vaginales se caracterizan por detección casi exclusivo de forma irregular cornificadas células epiteliales escamosas a menudo en grupos (Figura 1E, la Figura 2, el estro, panel derecho). Entrada en metaestro coincide con un aumento continuo en los niveles de hormonas progesterona y 6 se corresponde con el inicio de la fase lútea humano 12 (Figura 2, metaestro, panel izquierdo). Como los niveles de progesterona comienzan a aumentar y hay un aumento pequeño en el 17-β-estradiol los niveles en respuesta a la activación del cuerpo lúteo 6,13,14 (Figura 2, metaestro, panel izquierdo). Los tipos de células presentes en los frotis vaginales durante esta etapa son células fragmentadas, cornificadas epiteliales y leucocitos más pequeñas más oscuras manchadas (Figure 1F, la figura 2, metaestro, panel derecho). Por último, la entrada en el diestro en ratones se produce y los niveles circulantes de progesterona pico 6, correspondiente a la fase lútea tardía humano 12. Regresión del cuerpo lúteo conduce a una posterior disminución brusca en los niveles de progesterona 15,16 (Figura 2, Diestro, panel izquierdo). Los leucocitos predominan en los frotis durante el diestro. La frecuencia de células epiteliales cornificadas y nucleadas se reduce células epiteliales empiezan a ser detectados justo antes de la transición a la proestro (Figura 1G, la Figura 2, diestro, panel derecho).

En resumen, este protocolo simple rutina puede ser utilizada para estimar las fluctuaciones hormonales diarias y establecer etapa estral en ratones experimentales sin alterar el estado reproductivo si las toman las siguientes precauciones. El muestreo se debe realizar no más de una vez al día usando el protocolo no invasivo described aquí, en comparación con la penetración repetida de la cavidad vaginal, la aspiración y la agitación. Esto puede causar irritación vaginal resulta en una 17 respuesta inflamatoria resultante en leucocitos y otros tipos de células para estar presentes en los frotis que pueden confundir la evaluación citológica. Además, incluso en colonias alojadas las mujeres, es normal ver a diestro prolongados y fases de estro en ratones diferentes como la inducción y de anestro 18 y esta identificación es útil en la interpretación de impacto hormonal en la salud reproductiva, género y estudios de enfermedades. La variabilidad en la duración del ciclo también se introduce con la edad y por las diferencias de vivienda en colonias (individual o en grupo de viviendas-) de las hembras 7,19-21. Hembras alojadas en femenino-colonias sólo puede dejar la bicicleta y entrar en un estado de prolongada diestro 18,22,23 aunque la bicicleta puede ser restablecida por la exposición a las jaulas pretratados con orina masculino para obtener 24,25 bicicleta. Por lo tanto, para establecer individual longitudes de ciclo para un ratón dado, se recomienda que las evaluaciones no invasivos descritos aquí puede realizar diariamente, con cuidado, hasta dos ciclos completos se observan.

Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las normas y reglamentos establecidos por la Universidad de Ottawa Animal Care Comité y el Consejo Canadiense de Protección de los Animales.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Marc Leonard de Carleton Immersive Media Studio expertos para la asistencia técnica en la producción y edición de video y el Dr. Martin Bertrand de Carleton Immersive Media Studio / Laboratorio de Regeneración Neural de asistencia modelo visual. Los autores agradecen el asesoramiento de la Dra. Marilyn Keaney y todo su personal especializado en la Universidad de Ottawa y Cuidado de Animales Servicios Veterinarios. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR, RP 62826) para SALB, el Instituto de Envejecimiento y CIHR Iniciativa para la Formación Estratégica de Investigación de la Salud / Programa de Formación en CIHR lipidomics Neurodegenerativas (TGF 96121) para SALB y SF, Fundación Canadiense de Innovación a SF, Ontario Innovation Trust a SF, y Autodesk investigación a la ciencia ficción. ACM recibe un CIHR Banting y Best premio doctoral. NV recibe una beca post-profesional del Instituto de Mayores y el Programa de Capacitación en CIHR lipidomics neurodegenerativas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

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