Анализ и построение структуры нуклеиновых кислот с 3DNA

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

3DNA пакет программного обеспечения является популярным и универсальным биоинформатики с возможностями, анализировать, строить и визуализировать трехмерные структуры нуклеиновых кислот. В данной статье представлены подробные протоколы для подмножества новые и популярные функции, доступные в 3DNA, применимо и к отдельным структурам и ансамбли связанных с ними структур.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

3DNA пакет программного обеспечения является популярным и универсальным биоинформатики с возможностями, анализировать, строить и визуализировать трехмерные структуры нуклеиновых кислот. В данной статье представлены подробные протоколы для подмножества новые и популярные функции, доступные в 3DNA, применимо и к отдельным структурам и ансамбли связанных с ними структур. Протокол 1 перечислены набор инструкции, необходимые для загрузки и установки программного обеспечения. После этого следует, в Протоколе 2, путем анализа нуклеиновых кислот структуры, включая назначение пар оснований и определение твердого тела параметров, которые описывают структуру и, в Протоколе 3 к описанию реконструкции атомное модель строения от своего твердого тела параметров. Самая последняя версия 3DNA, версия 2.1, добавлены новые функции для анализа и манипулирования ансамблей структур, таких, как вывести из ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и молекулярной динамики (MD) Моделирования; эти особенности представлены в протоколах 4 и 5. В дополнение к 3DNA автономный пакет программного обеспечения, веб-сервер w3DNA, расположенный на http://w3dna.rutgers.edu , предоставляет удобный интерфейс для выбранных функций программного обеспечения. Протокол № 6 демонстрирует роман особенность сайта для построения моделей длинных молекул ДНК украшены связанных белков в указанное пользователем место.

Introduction

Понимание трехмерные структуры ДНК, РНК и их комплексов с белками, наркотиками и другими лигандами, имеет решающее значение для расшифровки их разнообразные биологические функции и на предоставление рационального проектирования терапии. Исследование таких структур влечет за собой три отдельных, но тесно связанных компонентов: анализа (для извлечения моделей в форм и взаимодействия), моделирование (для оценки энергетики и молекулярной динамики), и визуализации. Структурный анализ и построение модели по существу две стороны одной монеты, и визуализация дополняет их обоих.

3DNA набор компьютерных программ становится все более популярным структурным инструментарий биоинформатики с возможностями анализировать, строить и визуализировать трехмерные структуры нуклеиновых кислот. Более ранние публикации, изложенные возможностей программного обеспечения 1, при условии, рецепты для выполнения выбранной задачи 2, представила веб-интерфейсраспространенному особенности программного обеспечения 3, представлены базы данных структурных особенностей собраны с помощью 3DNA 4, 5 и проиллюстрированы полезности программного обеспечения в области анализа и ДНК, и РНК структуры 6, 7.

Целью данной статьи является приведение 3DNA комплект программного обеспечения для лаборатории ученые и другие с интересами и / или потребности исследовать ДНК и РНК пространственной организации с государством в самых современных вычислительных средств. Протоколы, представленные здесь включают шаг за шагом инструкции (I), чтобы загрузить и установить программное обеспечение на Mac OS X системы, (II-III) для анализа и изменения структуры ДНК на уровне учредительного пар оснований шаги, ( IV-V), чтобы проанализировать и согласовать наборы связанных структур ДНК и (VI) для построения моделей белка оформленные цепей ДНК с удобным интерфейсом веб w3DNA. Программное обеспечение имеет возможность анализировать отдельные структуры решены с помощью рентгеновских методов кристаллографических, а также крупныеансамбли структур определяется с ядерным магнитным резонансом (ЯМР) методы или сгенерированного компьютером-моделирования.

Структур рассматриваемых здесь включают (I) с высоким разрешением кристаллической структуры ДНК связаны с Hbb белка из Borrelia Burgdorferi 8 (клещевой бактерия, которая вызывает болезнь Лайма у людей 9, 10), (II) два больших наборов последовательно родственные молекулы ДНК, полученная с молекулярным моделированием 11 - 4500 снимков D (GGCAAAATTTTGCC) 2 и D (CCGTTTTAAAACGG) 2 собраны в 100-пс шагом при расчетах, и (III) небольшой ансамбль ЯМР-структур на основе оператора ДНК O3 связан с заставками из кишечной палочки Lac белок-репрессор 12. Приведенные ниже инструкции включают в себя информацию о том, как получить доступ к файлам атомных координат, связанной с каждой из этих структур, а также как использовать 3DNA (копия Этот файл находитсяна форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove ) для проверки и изменения этих структур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Установка пакета программ

  1. Подключение к 3DNA сайте http://x3dna.org и нажмите на ссылку для 3DNA форума. В рамках Форума выберите 'регистрация' и следуйте инструкциям, чтобы создать новую учетную запись.
  2. Ниже приводится подробная инструкция по установке программного обеспечения на OS X на основе Macintosh компьютер с оболочкой "баш 'по умолчанию. Порядок Linux или ОС Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) систем с часто используемыми оболочек (в том числе "Tcsh ') находится в пределах 3DNA форума.
  3. Как только Вы установили имя пользователя и пароль, войдите в Форуме. Выберите ссылку «Скачать» в разделе Добро пожаловать и на новой странице выберите '3 ДНК скачать ». Это приведет вас к 3DNA странице загрузки, где различные версии программного обеспечения могут быть загружены.
  4. Выберите Mac OS X Intel ссылку, чтобы загрузить файл сжатый архив (tar.gz), содержащий программное обеспечение.
  5. Дважды кликнутьК на (tar.gz) файл, чтобы создать папку с именем x3dna-v2.1. Эта папка, которая содержит 3DNA набор программного обеспечения, могут быть перемещены в любое место. Для этого рецепта, мы перетащить его в папку "Приложения". На этом этапе вы закончите с tar.gz файл и его можно удалить.
  6. Откройте приложения терминала обычно находятся в разделе "Утилиты", и перейдите в x3dna v2.1-каталог, созданный на шаге 5 с помощью следующей команды (закончилась здесь, и во всех из приведенных ниже инструкций возврата каретки):
    CD / Applications/x3dna-v2.1
  7. Запустите установочный скрипт, необходимый для 3DNA функционировать должным образом, набрав:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Скопируйте две строки настройки экспорта печатаются на этапе 7. Если пользователь поместил программное обеспечение в каталог "Приложения", две линии должен выглядеть следующим образом:
    экспорт X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    Экспорт PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    Другого слова, кроме "Приложения" будет AppeAR в экспорте команду, если пользователь выбрал для установки программного обеспечения в другой каталог. Это альтернативное имя каталога заменит "Приложения" в этих двух команд. Заметим, что если оболочкой по умолчанию является 'Tcsh' вместо 'баш', содержание двух линий будет: SetEnv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 и SetEnv путь / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
  9. Заезд "Finder", чтобы увидеть, если файл с именем ". Bashrc 'уже существует на вашем компьютере.
  10. Откройте приложение TextEdit располагается в каталоге "Приложения" и выберите "Сделать Plain Text" в разделе "Формат" меню.
  11. Если файл '. Bashrc ходьбы от Шаг 9 существует, откройте файл в TextEdit и вставьте настройки экспорта с шага 8 к концу файла. Если выхода нет ». Bashrc 'файла, вставьте сохраненных настроек Шаг 8 в пустой файл и сохранить с именем файла. Bashrc' в вашем домашнем каталоге. (Домашний каталог обозначается 'дом' значок на Macintosh.)
  12. Для того, чтобы новые настройки Bэлектронной доступны, необходимо запустить недавно сохраненный файл 'Bashrc.' с помощью следующей команды в терминале программы:
    Источник ~ /. Bashrc
  13. 3DNA пакет теперь установлен на вашей системе и вы можете выполнять в течение 2-5 протоколам терминальной программой. Протокол 6 выполняется с использованием w3DNA, веб-интерфейс для выбранных особенности 3DNA программного обеспечения.

2. Анализ кристаллической структуры

  1. Проиллюстрируем анализ нуклеиновой кислоты с использованием структуры ДНК, связанный с белком Hbb от Borrelia Burgdorferi 8. Файла атомных координат, связанной с этой структурой можно найти на Protein Data Bank 13 (PDB; http://www.rcsb.org ), где ему присваивается структурных 2np2 идентификатор. Прилагаемые дополнительные данные включают в себя копию этого файла, которую также можно найти на форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Первым шагом в 3DNA анализ структуры является создание файла, который перечисляет все спаренных оснований. Это делается с "find_pair 'программу, набрав следующие:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Здесь 2np2.pdb является входной файл координат атомов описанных выше, и является 2np2.bps выходного текстового файла, который содержит спаривания оснований информации. Последние пару оснований Файл может быть рассмотрен и редактироваться пользователем при необходимости.
  3. Следующий шаг анализа заключается в определении геометрических параметров, характеризующих структуру. Они включают в себя стандартные химические торсионных углов 14, псевдовращения углы, которые описывают сморщивание сахарного кольца 15, твердотельное параметры, которые определяют механизмы оснований и последовательных пар оснований 16 и другие меры трехмерных химической структуры. Команда 'анализ' принимает в качестве входных пар оснований файл, созданный на шаге 2 и создает несколько OUTPUT файлов, которые появляются в настоящее рабочий каталог. Эти значения рассчитываются, введя следующую команду:
    проанализировать 2np2.bps
    Выход файлы, используемые здесь, включают 2np2.out, который содержит обзор расчетных параметров, и bp_step.par, которое содержит список твердого тела параметрами, описанными выше. Последний файл можно легко прочитать в программу электронных таблиц для дальнейшего анализа и построения. См. Представитель Результаты (рис. 1) для примера.

3. Строительство структуру ДНК от твердого тела Параметры

  1. В дополнение к анализу нуклеиновых кислот структуры, 3DNA программное обеспечение предоставляет возможность построить структурную модель твердого тела параметров с помощью команды 'восстановления'. В этом протоколе мы покажем, как построить две спирали ДНК моделей, сначала с помощью твердотельного параметров из Hbb-ДНК, рассчитанному в Протоколе 2, а затем с помощью модифицированного набора параметров в WHICH выбранных углов крена не будут изменены. Угол крена измеряет степень изгиба последовательных пар оснований в пазы ДНК 16. Положительные значения рулон связаны с сужением большой бороздки и отрицательные значения с сужением малой бороздки. Стандартная система отсчета 17 принятых 3DNA и других популярных программного обеспечения для анализа нуклеиновых кислот, например Curves + 18, обеспечивает последовательность в численном рассчитанных параметров Уотсона-Крика пар оснований.
  2. По умолчанию функция "Перестроить" 3DNA создаст точные атомные модели, которые содержат только координаты атомов в азотистых оснований. Для того чтобы создать приблизительную модель атома, которая включает в себя координаты и от основы и базовые атомов, введите следующую команду:
    x3dna_utils cp_std BDNA
    Эта команда 3DNA ввести стандартную B-конформации остова ДНК в строительстве моделей от твердого тела параметров.
  3. Чтобы БуйLD двойной спирали, модель с твердотельным параметры, найденные в Hbb-структуры ДНК, введите следующую команду:
    восстановить атомный bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Вот-атомная "определяет строительство все модели атома с атомным координатам для всех тяжелых (не водород) атомов, 'bp_step.par' является файл, созданный на шаге 3 протокола № 2, который содержит введенные твердого тела параметрам , и '2 np2_rbld_org.pdb 'является выходной файл с атомными координатами созданной структуры. Последний файла отформатирован в соответствии со спецификациями PDB и, таким образом завершается. PDB.
  4. Файл 'bp_step.par' могут быть отредактированы для создания модифицированной структурой. На Macintosh, изменения могут быть выполнены с помощью приложения TextEdit, как описано в Протоколе 1 Шаг 10.
  5. Здесь мы изменим экстремальных углах барабан, образованный на двух участках наибольший изгиб. Ценности, которые выражаются в градусах, меняются к нулю от значения 64,95 на линии 17 и 600,93 в трубопроводе 26. Мы сохраняем измененный файл с новым именем, 'bp_step_roll0.par, и закрыть программу TextEdit.
  6. Мы строим структуру, как и в шаге 3, с измененным набором параметров шага в качестве входного файла, введя:
    восстановить атомный bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Эти две модели могут быть просмотрены в стандартных способов молекулярной зрителя, например PyMOL ( www.pymol.org ) с использованием сгенерированного файла координат (. PDB) в качестве входных данных. См. Представитель Результаты (рис. 2) для изображений восстановленного структур.

4. Анализ Multi-модель структуры файлов

  1. В отличие от протокола № 2, в котором мы анализируем одного нуклеиновых кислот содержащие структуры, здесь мы покажем, как для анализа большого массива структур. Рассмотрены изменения во времени из твердого тела параметров вдоль серию из 14 пар оснований цепи ДНК, полученных от молекулярной динамики (МД) 11 http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Первым шагом в анализе является таким же, как выполняются в 2 протокола, выявление спаренных оснований, запустив 'find_pair' программы. Так как весь набор структур разделяет те же спаривания оснований схема нужна для запуска 'find_pair' только один раз на репрезентативной файла. Здесь мы выбираем 1001-структуры в моделировании цепей ДНК содержащих центральные На этапе, с именем файла md_AT_set1.pdb.1001. После родов инструкциюTES спаривания оснований информацию и сохраняет ее в файле md_AT_set1.bps:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    Пользователь может просмотреть идентифицированной базовой кожура и вручную внести изменения в файл на основе знания структуры.
  3. Следующим шагом является определение геометрических параметров всей набор структур с помощью "x3dna_ensemble Проанализировать" команды. Эта программа использует в качестве входных пар оснований файл, созданный на шаге 2 (md_AT_set1.bps), а также файл, содержащий список из структур для анализа. Последний файл, называемый здесь md_AT_set1.list, содержится 4500 файлов, которые будут проанализированы, с именами файлов вступил на отдельных линиях в порядке, порожденных МД-моделирования. Копию этого файла включен в дополнительный материал, а также предлагаемых в 3DNA форума. Пользователь должен быть предупрежден, в связи с большим количеством файлов, что вычислительная время может быть длинным (~ 20 мин на 1000 файлов на AMD Phenom II X4 965). Thэлектронной команда выполняется, введя следующие:
    x3dna_ensemble анализировать md_AT_set1.bps-B-L-O md_AT_set1.list md_AT_set1.out
    В приведенном выше примере относится '-B' на пару оснований файл, созданный в шаге 2, '-L' указывает, что список файлов дается, и '-O' позволяет пользователю присвоить имя выходного файла. Есть много вариантов, которые могут быть использованы в сочетании с командой 'x3dna_ensemble анализа, такие как выбор конкретной модели. Пользователь может ввести "x3dna_ensemble проанализировать-H 'для получения более подробной информации об этих параметрах.
  4. Следующим шагом является извлечение нужного твердого тела параметрами из файла Обзор выход, md_AT_set1.out, созданного на шаге 3. Это выполняется с помощью команды 'x3dna_ensemble экстракта. Список доступных геометрических параметров можно найти 'x3dna_ensemble экстракт-L' печатать. Здесь мы извлекаем углов крена и создать текст, разделенный запятыми файл (CSV) из углов крена с помощью следующей команды:
    x3dna_ensemble экстракт-Pролл-S,-F-O md_AT_set1.out md_AT_set1_roll.csv
    '-Р-ролл в этой команде указывает параметр, который будет извлечен,'-с, "означает разделенный запятыми файл, '-F' обозначает выходной файл получается из ансамбля проанализировать команду, а '-O 'позволяет пользователю имя файла CSV выход углов крена вдоль ДНК во всех проанализированных структур. Этот файл может быть прочитан в другие программы для дальнейшего анализа и построения. См. Представитель Результаты (рис. 3) для анализа изменения рулон в двух MD-порожденных наборами данных описано выше, и 3DNA Форум для сценария MATLAB используется для создания этих образов.

5. Наложение нескольких модельных структур на общей раме Ссылка

  1. Самая последняя версия 3DNA (версия 2.1) имеет новую функцию, которая позволяет пользователю смотреть на несколько структур из общей перспективы. 'X3dna_ensemble переориентировать' команды накладывает коллекцию связанных структурноы на общей пары оснований или пар оснований шаг. Следующий протокол применяется эта возможность ЯМР-производных структур оператора O3 ДНК связан с заставками белка Lac репрессор 12. Эти структуры хранятся в PDB под идентификатором 2kek в мульти-модель структурного файл, который содержит все структуры модели в одном файле, а не отдельные файлы, такие как те, которые используются для каждой из моделей в 4500 протокола 4. Прилагаемые дополнительные данные включают в себя копию этого файла, которую также можно найти на форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Как и в предыдущих протоколов, первый шаг состоит в вычислении спаривания оснований ДНК с программой 'find_pair. В этом случае мы используем в качестве входных файлов kek.pdb '2 'и введите следующую команду:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    Спаривания оснований генерируется с использованием первой модели в PDB файла. Руководство поправки к выводимой BASE-пары файлов, '2 kek.bps ', может быть сделан на основе знания структуры.
  3. Программа 'x3dna_ensemble переориентировать "будет согласовывать отдельные модели в мульти-структуры модели на общей системе отсчета. Эта программа требует как PDB файлов и спаривание оснований файл из предыдущего шага в качестве входных данных и управляется с помощью следующей команды:
    x3dna_ensemble переориентировать 2kek.bps-B-F 1-E-O 2kek.pdb 2kek_fr1.pdb
    Здесь ключ '-б' задает спаривание оснований файла '+ 1' обозначает пар оснований, на которых все структуры выровнены, в данном случае пара основание 1 на 5'-конце последовательности, несущей нити, '-E' задает входной файл ансамбль, и '-O' позволяет пользователю ввести имя выходного файла, в данном случае kek_fr1.pdb '2 '. Более подробную информацию о командной строке может быть получен 'x3dna_ensemble переориентироваться-H' печатать. См. Представитель Результаты (рис. 4) для обсуждения выровненных структур.

6. Construие белка оформленные молекулы ДНК

  1. Интерфейс веб-w3DNA включает в себя несколько популярных функций 3DNA пакет программного обеспечения. Здесь мы обращаем внимание на возможности для построения трехмерных моделей белок-ДНК оформлен с веб-сервером. Связанных фрагментов ДНК принять твердого тела параметры выбранного белок-ДНК, при этом значения ДНК, связанный с белком Hbb проанализированы протокола 2. Несвязанных участков ДНК может принимать одно из трех выбранных пользователем спиральной формы (A, B или C). A, B и C относятся к трем каноническим моделей ДНК, полученные из ранних экспериментов дифракции волокно, с соответственно 11, 10 и 9 пар оснований на виток двойной спирали 19-21.
  2. Первый шаг в построении белка оформленные модели ДНК, это посетить сайт w3DNA расположен на http://w3dna.rutgers.edu . Выбор «реконструкции» из меню в верхней левой части страницы актизание модель онлайн потенциала возможностей.
  3. Следующим шагом является нажмите на ссылку "Связанный белок-ДНК-матрицы 'найдены в слегка затененное окно в середине новой страницы. Этот выбор будет активировать выпадающее меню, которое позволяет пользователю указать количество связанных белков. Здесь мы выбираем два связанных белков и нажмите на кнопку "Продолжить". Следует отметить, что модели ограничены в размерах до 1000 пар оснований, или 2000 нуклеотидов и тридцать связанные белки.
  4. Выбор числа связанных белков приводит к странице с техническими характеристиками, аналогичный показанному на рисунке 5. Эта страница позволяет пользователю определять последовательность ДНК, спиральная форма несвязанного ДНК и идентичность и местоположение связанные белки.
  5. Пользователь вводит или пасты в нужной последовательности в текстовом поле в середине спецификации (Рис. 5, этикетки 1). Обратите внимание, только стандартные остатки - A, T, C, G и U - не принимаются. Здесь мы входим в 81 пар оснований Homopolymer, полностью состоит из пары · Т с в последовательности, несущие нити.
  6. Существует выпадающего меню (рис. 5, этикетки 2), под текстовым полем, чтобы выбрать спиральной конформации несвязанных участков ДНК. В этом примере мы выбираем B-форме конформацию.
  7. Существует текстовом поле в нижней части страницы спецификации, чтобы войти в позицию сшивания (ы) и имя файла (ов) связанного белка (ов) (рис. 5, этикетки 3). Положении связывания указывает местоположение центра белком фрагмента на последовательности ДНК. Если связанной ДНК содержит нечетное число пар оснований, как в Hbb-структуры ДНК, связывание позиции обозначает местоположение средней пар оснований фрагмента. В случае Hbb-связанной ДНК, эта средняя пара база T · T mispair. В этом примере, где связывать две копии Hbb белка с ДНК-матрицы, T · T пара находится в положениях 20 и 63 из 81 пар оснований ДНК себепоследовательности. Следует отметить, что последовательность связанного фрагмента не должен совпадать с введенный на шаге 5. Если белком область содержит четное число пар оснований, связывание позиции обозначает местоположение средней пар оснований шагом на ДНК. Таким образом, центральный пар оснований шаг связанного фрагмент помещается между парами оснований п и п +1, где п указанный номер вдоль отрезка. Также отметим, что пользователь может украшать ДНК с любой белок, при условии, что структура его комплекса с ДНК, как известно, и хранятся в стандартном формате PDB 13.
  8. В нижней части спецификации странице есть окно, которое позволяет пользователю создавать предварительный просмотр с белком ДНК (рис. 5, этикетки 4). Здесь мы проверяем, что поле и нажмите кнопку "Продолжить". Это действие генерирует отзыв страницу со списком выбранных параметров, а также любые ошибки, которые могут возникнуть из-за перекрытия выбранных сайтов связывания. Пользователь может SEраскройте его, выберите кнопку "Назад", если любые изменения должны быть сделаны или 'Build', чтобы продолжить.
  9. На следующей странице статическое изображение ДНК-белкового комплекса в наиболее расширенном соглашении и позволяет для он-лайн с помощью интерактивной визуализации и Jmol Webmol. Пользователь может также загрузить координаты (. PDB-файл), который отформатирован в соответствии со спецификациями PDB. Это можно сделать, выбрав "Загрузить файл восстановлен PDB 'ссылку ниже создается изображение. Последний файл можно легко прочитать в молекул в графическом виде для дальнейшей визуализации. См. Представитель Результаты (рис. 6) для примеров Hbb оформленные ДНК, описанных выше, и немного длиннее (86 пар оснований) цепь с Hbb центру в положениях 20 и 67.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3DNA программных средств, которые обычно используются для анализа структуры нуклеиновых кислот. Например, личность пар оснований и твердого тела параметров, характеризующих механизмы баз в двойной спирали фрагменты ДНК и РНК структур вычисляются автоматически и хранятся для каждой новой записи в базе данных нуклеиновых кислот 22, во всем мире хранилище нуклеиновой кислоты структурной информации. Значения твердого тела параметров, определяемых с протоколом 2 легко раскрыть искажений в трехмерной структуры, такие, как два крайних участков ДНК изгиб в большой бороздке, с большими положительными углами крена (64,95 ° и 60,93 °), найденные при AT · на этапах 13 и 22 в кристалле комплекса с Borrelia Burgdorferi Hbb белка 8 (рис. 1).

Возможности программного обеспечения для восстановления структуры из этих величин с Протоколом 3 позволяет определить, как виндивидуальные базы и пар оснований шаги вклад в общую молекулярную раза. Как показано на рисунке 2, глобальная изгиб ДНК, индуцированное Hbb отражает более двух крайних искажений рулон, указанных выше. Таким образом, ДНК остается сильно искривленные когда реконструированы с этими пар оснований шаги выпрямить, т.е. с нулевого угла крена на двух участках. Такой же метод ранее показали, вклады конкретных пар оснований шаги и деформаций в сверхвитков шаг ДНК наматывается на поверхности нуклеосом ядро частицы 6 и ширины малой бороздки ДНК связан с бактериальным-нуклеоидом ассоциированный белок Fis 23.

Новая возможность в 3DNA, описанных в Протоколе 4, изучить большое количество связанных с ними структур позволяет извлечь как последовательности и нестационарные модели в пространственной планировки моделируемых молекул ДНК и РНК. Например, (желтый) седлоили кодирование углов крена между последовательными парами оснований в двух больших наборов моделируемых структур ДНК 11 показывает льготных изгиб этих молекул на пиримидин-пуринового основания паре шагов (рис. 3). Более высокие значения рулон, изображенные на красный, которые сохраняются в течение коротких периодов по концам ДНК, указывающие на локализованное расплавление и reannealing из двойной спиральной структуры. Вариационной модели других твердых тел параметров, таких как углы и расстояния между комплементарными основаниями, может помочь расшифровать точный структурных искажений.

Способность 3DNA программного обеспечения, представленный в Протоколе 5 переориентировать родственных молекул в общей системе отсчета, показывает особенности общей структуры скрыты во многих из файлов, хранящихся в PDB. Например, обычное выравнивание связанных с ним структур на основе среднеквадратическое приступе соответствующих атомов производит серию подобных пространственных путей Tшляпа примерно наложить друг на друга, вот десять ЯМР-модели, основанные на оператора ДНК O3 связан с заставками белка Lac репрессор 12 (рис. 4 слева). Суперпозиции те же структуры на общей раме координат на 5'-терминальном пар оснований каждого дуплекса показывает значительное искажение глобальной структуры, в которых молекулы изгибаться в заметно разных направлениях (рис. 4 справа). Структурная изменчивость может влиять на легкость, с которой кишечной палочки Lac белок-репрессор связывается O3 и индуцирует петлю между O3 и последовательно далеких операторов в Lac оперона 24.

Действия, описанные в Протоколе 6, для построения моделей длинные фрагменты ДНК оформлен при произвольных сайтов с белками и другими лигандами, добавляет новый взгляд на организацию большие сборки макромолекулярных. Такие модели помогают понять, как мульти-молекулярных комплексоввзаимодействуют во биологической обработки. Как показано на рисунке 6, точное размещение архитектурных белка, как Hbb может иметь драматическое влияние на общий складной ДНК. Если две копии известных высоким разрешением структуры 8 разделены на 43 пар оснований, 81 пар оснований ДНК-фрагмент закрывается в плотный, почти закрыто конфигурации. Если эти два белка разделены пять дополнительных пар оснований ДНК следующим открытой, извилистый путь. Очень разные механизмы белка оформленный дуплекс показывают, как расстояние архитектурных белки могут влиять на циклизации или циклов ДНК из 25, 26.

Рисунок 1
Рисунок 1. Изменение угла крена между последовательными парами оснований (см. вставку для визуальной) вдоль ДНК чаВ связанной с Hbb белка из Borrelia Burgdorferi 8. Значения, полученные с помощью "анализа"-команд 3DNA и структурных данных описаны в Протоколе 2. Обратите внимание на экстремальные значения в рулон на этапах, что кронштейн центральной трети структуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Приблизительная атомные модели ДНК, сконструированной с помощью "восстановить" функции 3DNA и оказанных в PyMOL с разноцветной атомов (C-голубой, N-синие; O-красные; P-золото). Модели, основанные на (слева) твердого тела шаг параметров белка Hbb и (справа) модифицированный набор параметров шага, где две наибольшие значения рулон был установлен на ноль. См. Протокол 3 шаг за шагом инструкции . Обратите внимание на раскрытие ДНК индуцированных навязанных изменений в рулоне.


Рисунок 3. Мозаичные изображения углов крена вдоль ДНК в двух сетах моделируемых структур 11. Значения ролл, извлекается с помощью протокола 4, имеют цветовую маркировку от синего до красного в диапазоне [-5 °, 20 °]. Обратите внимание на обратный порядок баз и больших значениях рулон, подчеркнул желтые / красные колонны, которые происходят на пиримидин-пуриновых шага, в 14 пар оснований самодополнительных последовательностей.

Рисунок 4
Рисунок 4. Мультфильма изображения ДНК модели найдены в ЯМР-производных структур оператора ДНК O3 с Lac репрессор заставки белок 12 иллюстрируют возможностииз «x3dna_ensemble переориентировать 'команды. Изображения отображаются в PyMOL (магистралей показать, как золото труб и оснований, как синие палки) и приведены в соответствие использования (слева) координаты в PDB запись (2kek) и (справа) структурных суперпозиции представлена ​​в Протоколе 5 . Обратите внимание на большие различия между структурами при размещении в общей системе отсчета на 5'-концевых пар оснований.

Рисунок 5
Рисунок 5. Скрин-шот с веб-сервера w3DNA иллюстрирующие характеристики последовательности ДНК (ярлык 1), спиральная форма несвязанной ДНК (ярлык 2), позиции и идентичность белков (ярлыком 3), и чек просмотра окне образ (этикетки 4) Протокол описан в 6. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6
Рисунок 6. Приблизительная атомных моделей из двух белков Hbb 8 связаны с длинного фрагмента ДНК. Структур, созданных с сервером w3DNA Сети как описано в Протоколе 6 и оказанные в PyMOL. Белковых цепей являются шоу, как фиолетовые ленты в то время как ДНК-цветные кодируется тип атома (C-голубой, N-синий, O-красные; P-золото). Центральный пары оснований каждого белка-связывающие сайты установлена ​​в позиции (слева) 20 и 62 по 81 пар оснований ДНК цепи и (справа) 20 и 67 по 86 пар оснований ДНК цепь. Обратите внимание на существенное изменение в складывания структур, связанных с повышенной (пяти пар оснований) смещения двух белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Набор протоколов, представленных в этой статье, лишь коснуться возможности 3DNA набор программ. Инструменты могут быть применены к РНК структуры идентифицировать неканонические пары оснований, чтобы определить вторичные структурные контексты, в которых такие спаривание происходит, для количественной оценки пространственного расположения спиральных фрагментов, чтобы измерить перекрытие баз вдоль основной цепи, и т.д. Перестроить команда позволяет пользователю построить простые и информативные блок представлений баз и пар оснований, как показано на вставке к рис 1. Строительный инструмент также предусмотрены элементы 'нити' на различных последовательностей данного структурного шаблона, позволяет создавать модели, многочисленные двух-, трех-, четырех-и многожильных структуры ДНК, чтобы ориентировать модели в определенном направлении, и т.д. Наконец, имеет 3DNA сыграл значительную роль в ряде других проектов, таких как: веб-SwS сольватации сервис для нуклеиновых кислот 27; сервер для веб-ARTSвыравнивания РНК третичные структуры 28; MDDNA веб-инструмент для анализа молекулярной динамики и результатов предсказания структуры 29; пикшу управляемой информацией белок-ДНК методом стыковки 30; сервер SARA для функции аннотации структур РНК 31; 3D- DART моделированием структуры ДНК сервере 32; 3D-след базы данных для структурного анализа белок-ДНК 33; РНК FRABASE 2.0 базы данных для идентификации трехмерных фрагментами РНК-структур 34, а также веб-сервер SETTER для парного сравнения РНК структур 35. Насколько нам известно, в настоящее время нет других нуклеиновых кислот структура программного пакета с сопоставимым широкие сочетание функций и надежный рекорд результативности 3DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарны Иржи Шпонер для обмена координатами двойных спиралей ДНК генерируется в молекулярной динамики. Мы также признаем, Nada Špačková за помощь в загрузке этих структур. Поддержка этой работы за счет грантов USPHS исследований GM34809 GM096889 и выражает искреннюю признательность.

References

  1. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures. Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).
  2. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).
  3. Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).
  4. Xin, Y., Olson, W. K. BPS: a database of RNA base-pair structures. Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).
  5. Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA. Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).
  6. Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).
  7. Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex. Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).
  8. Mouw, K. W., Rice, P. A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).
  9. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science. 216, 1317-1319 (1982).
  10. Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).
  11. Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA. Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).
  12. Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes. J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).
  13. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. The Protein Data Bank. Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).
  14. Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).
  15. Altona, C., Sundaralingam, M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).
  16. Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters. J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).
  17. Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry. J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).
  18. Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+. Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).
  19. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  20. Watson, J. D., Crick, F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  21. Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. A new configuration of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, 387-388 (1958).
  22. Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids. Biophys. J. 63, 751-759 (1992).
  23. Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis. Genes Dev. 24, 814-826 (2010).
  24. Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).
  25. Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations. J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).
  26. Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation. J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).
  27. Auffinger, P., Hashem, Y. SwS: a solvation web service for nucleic acids. Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).
  28. Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures. Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).
  29. Dixit, S. B., Beveridge, D. L. Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction. Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).
  30. de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking. Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).
  31. Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. SARA: a server for function annotation of RNA structures. Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).
  32. van Dijk, M., Bonvin, A. M. 3D-DART: a DNA structure modelling server. Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).
  33. Contreras-Moreira, B. 3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).
  34. Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures. BMC Bioinformatics. 11, 231 (2010).
  35. Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. SETTER: web server for RNA structure comparison. Nucleic Acids Res. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics