3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

Biology

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Summary

3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

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Abstract

3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜 1은 소프트웨어를 다운로드하고 설치하는 데 필요한 지침의 집합을 나열합니다. 이 기본 쌍의 할당 및 구조를 설명 강체 매개 변수의 결정을 포함하는 핵산 구조의 분석의 프로토콜 2에 따르고, 프로토콜 3, 원자의 재건에 대해 설명합니다 의 강체 매개 변수와 구조의 모델입니다. 3DNA, 버전 2.1의 가장 최근 버전은 핵 자기 공명 (NMR) 측정 및 분자 동적 (MD에서 추론 것과 같은 구조의 앙상블의 분석 및 조작을위한 새로운 기능을 가지고 있습니다) 시뮬레이션, 이러한 기능은 프로토콜 4와 5에 제시되어있다. 3DNA 독립형 소프트웨어 패키지 외에도,에 위치한 w3DNA 웹 서버, http://w3dna.rutgers.edu는 , 소프트웨어의 선택 기능과 사용자 친화적 인 인터페이스를 제공합니다. 프로토콜 6 사용자가 지정한 위치에 바인딩 단백질과 장식 긴 DNA 분자의 모델을 구축하는 사이트의 새로운 기능을 보여줍니다.

Introduction

DNA, RNA, 단백질, 마약, 그리고 다른 리간드와의 착물의 입체 구조를 이해하는 것은 그들의 다양한 생물학적 기능을 해독 매우 중요하며, 치료의 합리적인 디자인을 허용합니다. 분석 (모양과 상호 작용 패턴을 추출하는), 모델링 (에너지 론과 분자 역학을 평가하기 위해), 및 시각화 : 같은 구조의 탐사 별도의 세 가지 아직 밀접하게 관련 구성 요소를 수반한다. 구조 분석 및 모델 구축은 동전 본질적으로 두 가지 측면, 그리고 시각화 둘 다 보완한다.

컴퓨터 프로그램의 3DNA 제품군은 세 가지 차원 핵산 구조를 분석 구성 및 시각화하는 기능을 점점 더 인기를 구조 생물 정보학 툴킷입니다. 이전 출판물 조리법 선택한 작업 2를 수행하기 위해 제공되는 소프트웨어 1의 기능을 설명, 웹 기반 인터페이스를 도입소프트웨어 3의 인기있는 기능으로, 구조 기능을 제공 데이터베이스를 사용하여 수집 3DNA 4, 5는 DNA와 RNA의 구조 6, 7 모두 분석 소프트웨어의 유틸리티를 설명합니다.

이 문서의 목적은 DNA와 최첨단 전산 도구를 사용하여 RNA 공간 조직을 조사하기 위해 이익 및 / 또는 필요로하는 실험실 과학자와 다른 사람에게 3DNA 소프트웨어 키트를 가지고있다. 여기에 제시 프로토콜은 단계별 지침 (I) 맥 OS X 시스템에서 소프트웨어를 다운로드하고 설치하려면 (II-III) 구성 기본 쌍 단계의 수준에서 DNA 구조를 분석하고 수정하는 방법 (포함 IV-V) 분석 및 관련 DNA 구조의 집합을 정렬하고 (VI) 사용자 친화적 w3DNA 웹 인터페이스 단백질 장식 DNA 사슬의 모델을 구성 할 수 있습니다. 소프트웨어는 각각의 구조뿐만 아니라 큰 X-선 결정학 방법을 사용하여 해결할 분석하는 기능을 가지고 있습니다핵 자기 공명 (NMR) 방법으로 측정 또는 컴퓨터 시뮬레이션 기술에 의해 생성 된 구조의 앙상블.

구조 (I) 보렐리 아 burgdorferi 8 (인간 9, 10에서 라임 병을 일으키는 원인이되는 진드기 매개 박테리아), (ⅱ)에서 HBB 단백질에 바인딩 DNA의 고해상도 결정 구조를 포함 여기에 순차적으로 두 개의 큰 세트를 검토 D 4,500 스냅 샷 (GGCAAAATTTTGCC 2)와 D (CCGTTTTAAAACGG 2) 계산시 100 psec로 단위에서 수집하고, O3의 DNA 연산자의 NMR 기반 구조 (III) 작은 앙상블 - 분자 시뮬레이션을 11로 생산 관련 DNA 분자 대장균 락 억제 단백질 (12)의 투구에 바인딩됩니다. 아래의 지침은 이러한 구조의 각각뿐만 아니라 방법 3DNA (이 파일의 복사본을 찾을 수 있습니다 사용하는 연결된 원자 좌표 파일에 액세스하는 방법에 대한 정보를 포함에서 3DNA 포럼 http://forum.x3dna.org/jove ) 이러한 구조를 검사하고 수정합니다.

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Protocol

1. 소프트웨어 패키지 설치

  1. 에서 3DNA 웹 사이트에 연결 http://x3dna.org 및 3DNA 포럼 링크를 클릭합니다. 포럼에서 '등록'링크를 선택하고 새 계정을 만들려면 지침을 따르십시오.
  2. 기본 '강타'쉘 OS X 기반 Macintosh 컴퓨터에서 소프트웨어의 다음 지시 사항 세부 설치. 일반적으로 사용되는 쉘 ( 'tcsh가'포함)와 리눅스 또는 Windows (Cygwin에서, MinGW를 / MSYS) 시스템에 대한 절차는 3DNA 포럼에서 찾을 수 있습니다.
  3. 당신은 사용자 이름과 암호를 설정 한 후에는 포럼에 로그인합니다. 시작 부분과 새 페이지에서 '다운로드'링크 '3 DNA 다운로드 '를 선택을 선택합니다. 이 소프트웨어의 여러 버전을 다운로드 할 수 있습니다 3DNA 다운로드 페이지로 이동합니다.
  4. 소프트웨어를 포함하는 압축 된 tarball 파일 (tar.gz를)을 다운로드 맥 OS X 인텔 링크를 선택합니다.
  5. 더블 카릭x3dna-2.1라는 폴더를 만듭니다 (tar.gz를) 파일에서 K. 3DNA 소프트웨어 스위트를 포함이 폴더는, 어떤 위치로 이동할 수 있습니다. 이 조리법의 목적을 위해, 우리는 드래그 앤 '응용 프로그램'디렉토리에 놓습니다. 이 단계에서 당신의 tar.gz 파일을 완료하고 삭제할 수 있습니다.
  6. 일반적으로 '유틸리티'아래에있는 터미널 응용 프로그램을 열고 다음 명령을 (여기 캐리지 리턴 아래의 지침을 모두 종료)를 사용하여 5 단계에서 만든 x3dna-2.1 디렉토리로 변경
    CD / Applications/x3dna-v2.1
  7. 입력하여 제대로 작동하는 데 3DNA에 필요한 설치 스크립트를 실행합니다 :
    ./bin/x3dna_setup
  8. 7 단계에서 인쇄 된 두 줄의 내보내기 설정을 복사합니다. 사용자가 '응용 프로그램'디렉토리에 소프트웨어를 배치 한 경우, 두 줄은 다음과 같이 나타납니다 :
    수출 X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    $ PATH : PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin를 내보낼
    '응용 프로그램'외에 다른 단어 APPE합니다사용자가 다른 디렉토리에 소프트웨어를 설치하도록 선택한 경우 내보내기 명령 아칸소. 이 대체 디렉토리 이름은 위의 두 명령에서 '응용 프로그램'을 대체합니다. 에서는 setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1와의 setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin : $ 기본 쉘 대신 '강타'의 'tcsh에서'인 경우, 두 줄의 내용이 될 것이라고합니다 PATH.
  9. 파일 이름이 있는지 확인하기 위해 '파인더'체크 '. bashrc에'는 컴퓨터에 이미 존재합니다.
  10. '응용 프로그램'디렉토리에있는 텍스트 편집기 응용 프로그램을 열고 '형식'메뉴에서 '일반 텍스트 만들기'를 선택합니다.
  11. 9 단계에서 '. bashrc에'파일이 존재하는 경우 텍스트 편집기에서 파일을 열고 8 단계에서 파일의 끝으로 내보내기 설정을 붙여 넣습니다. 아니 '. bashrc에'파일이 종료하면, 빈 파일에 8 단계에서 내보내기 설정을 붙여 파일 이름을 사용자의 홈 디렉토리에서 '. bashrc에'로 저장합니다. (홈 디렉토리는 Macintosh에서 '집'아이콘으로 표시됩니다.)
  12. B에 새 설정 순서사용 가능한 전자, 당신은 터미널 프로그램에서 다음 명령을 사용하여 새로 저장된 '. bashrc에'파일을 실행해야합니다 :
    소스 ~ /. bashrc에
  13. 3DNA 제품군은 현재 시스템에 설치되어 있고 터미널 프로그램에서 프로토콜 2-5을 수행 할 수 있습니다. 프로토콜 6 3DNA 소프트웨어의 선택한 기능에 w3DNA, 웹 인터페이스를 사용하여 수행됩니다.

2. 결정 구조 분석

  1. 우리는 보렐리 아 burgdorferi 8 일부터 HBB 단백질에 바인딩 된 DNA를 사용하여 핵산 구조의 분석을 보여줍니다. ;이 구조와 관련된 원자 좌표 파일 단백질 데이터 뱅크 13 (PDB에서 찾을 수 있습니다 http://www.rcsb.org 이 구조 식별자 2np2 지정됩니다). 첨부 된 보충 자료도에서 3DNA 포럼에서 찾을 수 있습니다이 파일의 복사본을 포함 http://forum 있습니다.x3dna.org/jove.
  2. 구조의 3DNA 분석의 첫 번째 단계는 쌍 기지를 모두 나열하는 파일을 만드는 것입니다. 이것은 다음을 입력하여 'find_pair'프로그램을 수행합니다 :
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    여기 2np2.pdb 원자 위에서 설명한 좌표와 2np2.bps의 입력 파일이 기본 페어링 정보를 포함하는 출력 텍스트 파일입니다. 후자의 기본 쌍 파일을 검사하고 사용자가 필요한 경우 편집 할 수 있습니다.
  3. 분석의 다음 단계는 구조의 특성을 기하학적 매개 변수를 결정하는 것입니다. 이 표준 화학 비틀림 각 14 기지와 연속 염기쌍 16, 3 차원 화학 구조의 다른 조치의 준비를 지정 설탕 반지 15, 강체 매개 변수의 퍼커을 설명 pseudorotation 각도 (가) 있습니다. 명령 입력으로 단계에서 생성 된 기본 쌍 파일이 소요되는 2 여러 OU를 만듭니다 '는 분석'이현재 작업 디렉토리에 나타나는 tput을 파일. 이 값은 다음 명령을 입력하여 계산된다 :
    2np2.bps 분석
    여기에 사용되는 출력 파일은 계산 된 매개 변수의 개요가 포함 2np2.out, 및 매개 변수 위에서 설명한 강체의 목록을 포함 bp_step.par를 포함합니다. 후자의 파일을 쉽게 추가 분석 및 플로팅 스프레드 시트 프로그램으로 읽을 수 있습니다. 예를 들어 대표 결과 (그림 1)을 참조하십시오.

3. 강체 매개 변수에서 DNA 구조의 건설

  1. 핵산 구조의 분석뿐만 아니라, 3DNA 소프트웨어는 '재구성'명령을 사용하여 강체 매개 변수와 구조 모델을 구축 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 프로토콜에서 우리는 첫 번째 프로토콜 2에서 계산 된 HBB-DNA 복합체에서 강체 매개 변수를 사용하고 w에서 매개 변수의 수정 된 집합을 사용하여 두 개의 DNA 나선형 모델을 구성하는 방법을 보여줍니다의 hich 선택한 롤 각도가 변경됩니다. 롤 각도 DNA 16의 홈에 연속 염기쌍 휨 정도를 측정합니다. 롤의 양의 값이 작은 홈의 축소와 주요 그루브와 음수 값의 축소와 연관됩니다. 표준 참조 프레임 17 3DNA 및 기타 인기있는 핵산 분석 소프트웨어에 의해 채택, 예를 들어 곡선 + 18, 왓슨 크릭 염기쌍의 계산 된 파라미터 수치의 일관성을 보장합니다.
  2. 기본적으로 3DNA '재구성'기능은 질소 기지에있는 원자 만 좌표를 포함하는 정확한 원자 모델을 만들 것입니다. 백본 및 기본 원자 모두의 좌표를 포함하는 대략 원자 모델을 만들려면 다음 명령을 입력합니다 :
    x3dna_utils cp_std bdna
    이 명령은 강체 매개 변수와 모델의 건설 표준 B-DNA 백본 형태를 소개 3DNA 지시합니다.
  3. BUI에HBB-DNA 구조에있는 강체 매개 변수 LD 이중 나선 모델은, 다음을 입력합니다 :
    다시 원자 bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    여기 원자는 '모든 무거운 (비 수소) 원자 원자 좌표 모든 원자 모델의 구성을 지정하고,'bp_step.par '은 입력 된 강체 매개 변수를 포함 의정서 2의 3 단계에서 생성 된 파일 , '2 np2_rbld_org.pdb '이 만든 구조의 원자 좌표 출력 파일입니다. 후자 파일은 PDB의 사양에 따라 서식하기 때문에 '. PDB'로 종료합니다.
  4. 'bp_step.par'파일이 수정 된 구조를 생성하기 위해 편집 할 수 있습니다. Macintosh에서, 변경 의정서 1 단계 10에서 설명한대로 텍스트 편집기 응용 프로그램을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
  5. 여기에서 우리는 큰 굴곡의 두 사이트에 형성된 극단적 인 롤 각도를 수정합니다. 도 단위로 표현되는 값은, 라인 (17) 및 60 64.95의 값에서 제로로 변경라인 26 .93. 우리는 'bp_step_roll0.par'새 이름으로 수정 된 파일을 저장하고 텍스트 편집기 프로그램을 닫습니다.
  6. 우리는 타이핑하여 입력 파일로 단계 매개 변수의 수정 된 세트로, 3 단계에서와 같이 구조를 구축 :
    다시 원자 bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. 두 모델은 같은 PyMOL (같은 표준 분자 뷰어에서 볼 수 있습니다 www.pymol.org 입력으로 생성 된 좌표 파일 (. PDB)를 사용하여). 다시 구조의 이미지를 대표 결과 (그림 2)를 참조하십시오.

4. 다중 모델 구조 파일 분석

  1. 우리는 단일 핵산 함유 구조를 분석하는 프로토콜 2, 대조적으로, 우리가 구조의 큰 앙상블을 분석하는 방법을 보여줍니다. 우리는 분자 역학 (MD) 시뮬레이션을 11에서 얻은 14 기본 쌍의 DNA 사슬의 시리즈에 따라 강체 매개 변수를 시간이 지남에 따라 변화를 검토 http://forum.x3dna.org/jove .
  2. 분석의 첫 번째 단계는 'find_pair'프로그램을 실행하여 프로토콜 2 쌍 기지의 식별을 수행하는 것과 동일합니다. 구조 주식의 전체 집합 때문에 동일한 기본 페어링 계획 한 대표적인 파일에서 한 번만 'find_pair'를 실행해야합니다. 여기에서 우리는 파일 이름 md_AT_set1.pdb.1001와 단계에서 중앙을 포함하는 DNA 사슬의 시뮬레이션 1천1번째 구조를 선택합니다. 다음 명령 장군기본 페어링 정보를 TES 및 파일 md_AT_set1.bps에 저장합니다 :
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001의 md_AT_set1.bps
    사용자는 과도 식별 기준을 검토하고 구조의 지식을 기반으로 파일에 수동으로 변경할 수 있습니다.
  3. 다음 단계는 명령을 'x3dna_ensemble 분석'를 사용하여 구조물의 전체 집합의 기하학적 매개 변수를 결정하는 것입니다. 이 프로그램은 입력으로 2 단계 (md_AT_set1.bps)뿐만 아니라 분석 할 수있는 구조의 목록을 포함하는 파일에서 생성 된 기본 쌍 파일을 사용합니다. 여기 md_AT_set1.list라는 후자 파일, MD 시뮬레이션에 의해 생성 된 순서대로 개별 줄에 입력 한 파일 이름으로, 분석 할 4500 파일이 포함되어 있습니다. 이 파일의 복사본이 보충 자료에 포함되어 있으며 또한 3DNA 포럼에서 제공됩니다. 사용자는 계산 시간이 오래 될 수 있다는 때문에 파일의 큰 숫자, 경고해야한다 (~ AMD 페넘 II X4 965 프로세서 1000 파일 당 20 분). 목e 명령은 다음을 입력하여 실행됩니다 :
    x3dna_ensemble 분석-B md_AT_set1.bps-L md_AT_set1.list-O md_AT_set1.out
    위의 예에서 2 단계에서 만든 기본 쌍 파일에 '-B'와 관련이 '-L'는 파일의 목록이 주어집니다 지정하고, '-O'는 사용자가 출력 파일에 이름을 할당 할 수 있습니다. 이러한 특정 모델의 선택과 같은 'x3dna_ensemble 분석'명령과 함께 사용할 수있는 많은 옵션이 있습니다. 사용자가 이러한 옵션에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 'x3dna_ensemble 분석-H'를 입력 할 수 있습니다.
  4. 다음 단계는 3 단계에서 생성 개요 출력 파일 md_AT_set1.out에서 원하는 강체 매개 변수를 추출하는 것입니다. 이 'x3dna_ensemble 추출물'명령을 사용하여 수행됩니다. 사용 가능한 기하학적 매개 변수의 목록은 입력 'x3dna_ensemble 추출물 L'로 찾을 수 있습니다. 여기에 우리가 롤 각도를 추출하고 다음 명령을 사용하여 롤 각도의 쉼표로 구분 된 텍스트 파일 (CSV)를 작성
    x3dna_ensemble 추출물-P롤 S,-F md_AT_set1.out-O md_AT_set1_roll.csv
    이 명령에 '-P 롤'추출 할 매개 변수를 지정하고, '-S'가 쉼표로 구분 된 파일을 의미, '-F'명령을 분석 앙상블에서 얻은 출력 파일을 나타냅니다, 그리고 '-O '사용자가 모든 분석 구조 DNA를 따라 롤 각의 CSV 출력 파일 이름을 지정할 수 있습니다. 이 파일은 추가 분석 및 플로팅 다른 프로그램으로 읽을 수 있습니다. 위에서 설명한 두 가지 MD에서 생성 된 데이터 집합 및 이러한 이미지를 생성하는 데 사용되는 MATLAB 스크립트에 대한 3DNA 포럼 롤의 변화 분석을위한 대표 결과 (그림 3)을 참조하십시오.

5. 공통 참조 프레임 위에 다중 모델 구조의 중첩

  1. 3DNA (버전 2.1)의 최신 버전은 사용자가 일반적인 관점에서 여러 구조를 볼 수있는 새로운 기능이 있습니다. 'x3dna_ensemble는 방향을'명령 관련 structur에의 컬렉션을 중첩공통 기본 쌍 또는 기본 쌍 단계에 말이지. 다음 프로토콜은 락 억제 단백질 12의 투구에 바인딩 O3의 DNA 연산자의 NMR에서 파생 된 구조에이 기능을 적용합니다. 이러한 구조는 같은 프로토콜 4 4500 각 모델에 사용되는 것과 같은 별도의 파일이 아닌 하나의 파일에 모든 구조 모델을 포함하는 다중 모델 구조 파일에 식별자 2kek에서 PDB에 저장됩니다. 첨부 된 보충 자료도에서 3DNA 포럼에서 찾을 수 있습니다이 파일의 복사본을 포함 http://forum.x3dna.org/jove을 .
  2. 이전 프로토콜에서와 같이, 첫 번째 단계는 'find_pair'프로그램으로 DNA의 염기쌍을 계산하는 것입니다. 이 경우 우리는 입력 파일 '2 kek.pdb '로 사용하고 다음을 입력합니다 :
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    기본 페어링 pdb 파일의 첫 번째 모델을 사용하여 생성됩니다. 출력 된 B를 수동으로 수정ASE 쌍 파일, '2 kek.bps는 '구조의 지식을 기반으로 할 수 있습니다.
  3. 이 프로그램은 일반적인 참조 프레임에 대한 다중 모델 구조에서 각 모델을 맞출 것 'x3dna_ensemble는 방향을'이 (가) 이미 있습니다. 이 프로그램은 입력으로 이전 단계에서 pdb 파일과 기본 페어링 파일을 모두 필요하며 다음 명령을 실행합니다 :
    x3dna_ensemble 방향을-B 2kek.bps-F 1-E 2kek.pdb-O 2kek_fr1.pdb
    여기에 '-B'옵션이 기본 페어링 파일을 지정하고, '-F 1'은 시퀀스 베어링 가닥의 5'-말단에서이 경우 기본 쌍 1, 모든 구조가 정렬되는 기본 쌍을 나타냅니다 '-E'는 입력 앙상블 파일을 지정하고, '-O'는 사용자가이 경우 '2 kek_fr1.pdb '에서 출력 파일 이름을 제공 할 수 있습니다. 명령 옵션에 대한 자세한 내용은 입력 'x3dna_ensemble 방향을-H'에 의해 얻을 수 있습니다. 정렬 된 구조의 토론을위한 대표 결과 (그림 4)를 참조하십시오.

6. constru을단백질 장식 DNA 분자의 ction의

  1. w3DNA 웹 인터페이스 3DNA 소프트웨어 패키지의 일부 인기있는 기능이 포함되어 있습니다. 여기에서 우리는 웹 서버와 단백질 장식 DNA의 3 차원 모델을 생성하는 기능에 관심을 그립니다. 바인딩 된 DNA 단편은 여기에서 선택한 단백질 DNA 복합체, 프로토콜 2에서 분석 HBB 단백질에 바인딩 DNA의 값의 강체 매개 변수를 채택한다. DNA의 언 바운드 영역은 세 가지 사용자가 선택한 나선형 형태 (A, B 또는 C) 중 하나를 채택 할 수있다. A, B 및 C는 각각 11, 10로, 초기 섬유 회절 실험에서 얻은 DNA의 세 가지 표준 모델 및 이중 나선 19-21의 회전 당 10 개의 염기쌍을 참조하십시오.
  2. 단백질 장식 DNA 모델을 구축하는 첫 번째 단계에있는 w3DNA 웹 사이트를 방문하는 것입니다 http://w3dna.rutgers.edu을 . 페이지 함께하는의 왼쪽 상단의 메뉴에서 '재건'의 선택온라인 모델 구축 기능을 실행시킨다.
  3. 다음 단계는 새 페이지의 중간에 가볍게 음영 처리 된 상자에있는 '바인딩 단백질 DNA 템플릿'링크를 선택하는 것입니다. 이 옵션을 선택하면 사용자가 바운드 단백질의 수를 지정할 수 풀다운 메뉴를 활성화합니다. 여기서 우리는 두 가지 바인딩 단백질을 선택하고 '계속'버튼을 클릭합니다. 모델이 1,000 염기쌍 또는 2,000 뉴클레오티드, 서른 바인딩 단백질의 크기에 제한이 있습니다.
  4. 바인딩 단백질의 수의 선택은 그림 5에 표시된 것과 유사한 사양 페이지로 연결됩니다. 이 페이지는 사용자가 DNA 시퀀스 언 바운드 DNA의 나선형 형태와 결합 단백질의 신원과 위치를 지정할 수 있습니다.
  5. 사양 페이지의 중간에있는 텍스트 상자 (그림 5, 라벨 1)에서 원하는 순서대로 사용자 유형 또는 붙여 넣습니다. A, T, C, G, 및 U는 - - 접수는 표준 잔류합니다. 여기에서 우리는 81베이스 쌍 동음를 입력시퀀스 베어링 가닥으로 · T 쌍으로 완전히 구성 opolymer.
  6. 풀다운 메뉴 (그림 5, 라벨 2) DNA의 언 바운드 영역의 나선형 형태를 선택하고, 텍스트 상자 아래에 있습니다. 이 예에서는 B 형태의 형태를 선택합니다.
  7. 바인딩 위치 (들)과 결합 단백질 (들)의 파일 이름 (들) (그림 5, 라벨 3)를 입력 사양 페이지의 아래쪽에있는 텍스트 상자가 있습니다. 바인딩 위치는 DNA 서열의 단백질 결합 조각의 중심의 위치를​​ 지정합니다. 바인딩 된 DNA가 HBB-DNA 구조와 같은 기본 쌍의 홀수를 포함하는 경우, 바인딩 위치는 조각의 중간 기본 쌍의 위치를​​ 나타냅니다. HBB 바인딩 된 DNA의 경우,이 가운데 기본 쌍 T · T mispair입니다. 이 예제에서, 우리는 DNA 템플릿에 HBB 단백질의 두 복사본을 바인딩 곳, T · T 쌍은 위치 20 81 기본 쌍의 DNA 자체의 63에 배치됩니다quence. 바인딩 된 조각의 순서가 그것과 일치하지 않는 것을 참고 5 단계에서 입력 한. 단백질 바인딩 영역이 기본 쌍의 짝수가 포함되어있는 경우, 바인딩 위치는 DNA의 중간 기지 쌍 단계의 위치를​​ 나타냅니다. 즉, 바인딩 된 조각의 중심 기지 쌍 단계는 기본 쌍의 n과 n은 세그먼트에 따라 지정된 번호 N +1, 사이에 배치됩니다. 알려진 표준 PDB 형식 13에 저장되어있는 해당 사용자가 너무 오래 DNA와의 복합체의 구조와 같은 단백질과 DNA를 장식 할 수도 있습니다.
  8. 사양 페이지의 하단에 사용자가 단백질에 바인딩 DNA (그림 5, 라벨 4)의 미리보기를 생성 할 수있는 상자가있다. 여기에서 우리는 그 상자를 선택하고 '계속'버튼을 클릭합니다. 이 작업은 선택한 매개 변수뿐만 아니라 선택한 바인딩 사이트의 오버랩에서 일어난 모든 오류를 나열 리뷰 페이지를 생성합니다. 사용자는 SE 수변경할 사항이나 진행하는 '빌드'버튼을해야하는 경우 '뒤로'버튼을 선 택을.
  9. 다음 페이지는 가장 확장 된 배열 DNA-단백질 복합체의 정적 이미지를 표시하고 Jmol과 Webmol를 통해 온 - 라인 인터랙티브 시각화 할 수 있습니다. 사용자는 PDB의 사양에 따라 포맷 좌표 (. PDB) 파일을 다운로드 할 수 있습니다. 이것은 생성 된 이미지 아래의 링크를 '다시 pdb 파일 다운로드'를 선택하면됩니다. 후자 파일은 쉽게 더 시각화를위한 분자 그래픽 프로그램으로 읽을 수 있습니다. HBB-장식 DNA의 예는 대표 결과 (그림 6)은 위에서 설명한 위치에 20 67에 HBB 중심에 약간 더 (86베이스 쌍) 체인을 참조하십시오.

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Representative Results

3DNA 소프트웨어 도구는 정기적으로 핵산의 구조를 분석하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 기본 쌍의 신원과 DNA와 RNA 구조의 이중 나선형 조각의 염기 배열을 특징 강체 매개 변수가 자동 핵산 데이터베이스 22의 세계적인 저장소의 각 새 항목에 대해 계산 및 저장 핵산 구조 정보를 제공합니다. 프로토콜 2 결정 강체 매개 변수의 값은 쉽게에서 발견, 대형 긍정적 인 롤 각도 (64.95 °, 60.93 °)로, 주요 홈으로 구부리는 극단적 인 DNA의 두 사이트로, 3 차원 구조의 왜곡을 공개 보렐리 아 burgdorferi HBB 단백질 8 (그림 1) 크리스탈 단지에 13 단계 22 AT · AT.

프로토콜 3에서 이러한 수량의 구조를 재 구축하는 소프트웨어의 기능 여부를 판단 할 수있게하는 방법에분리 된베이스와베이스 쌍 단계는 전체 분자 배에 기여한다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, HBB에 의해 유도 된 DNA의 글로벌 굽힘이 두 극단적 인 롤 왜곡 위에서 언급 한 이상을 반영한다. 즉, DNA는 이러한 기본 쌍 단계를 재구성 할 때 매우 곡선 남아는 두 사이트에서 널 (null) 롤 각도, 정리. 동일한 기술 이전 세균에 특정 기본 쌍 단계와 변형의 뉴 클레오 코어 입자 (6)의 표면에 감싸 인 DNA의 superhelical 피치와 결합 DNA의 작은 홈의 폭 공헌을 밝혔다 핵 양체 - 관련 단백질 FIS 23.

관련 구조의 큰 숫자를 검사하는 프로토콜 4에 설명 3DNA의 새로운 기능은, 그것이 가능한 시뮬레이션 DNA와 RNA 분자의 공간적 배열에 두 시퀀스와 시간에 따른 패턴을 추출 할 수 있습니다. 예를 들어, (노란색) COL시뮬레이션 DNA 구조 11의 두 개의 큰 세트의 연속 염기쌍 사이의 롤 각도 또는 코딩 피리 미딘 - 퓨린 염기 쌍 단계 (그림 3)에서 이러한 분자의 특혜 굽힘을 보여준다. DNA의 끝에서 짧은 기간 동안 지속 빨간색으로 묘사 롤의 높은 값, 지역화 된 용해 암시하고 이중 나선 구조 reannealing. 같은 각도 보완 기지 사이의 거리와 같은 다른 강체 매개 변수의 변분 패턴 해독 정확한 구조 왜곡하는 데 도움이 될 수 있습니다.

공통 참조 프레임에 관련된 분자의 방향을하는 프로토콜 5에 제시 3DNA 소프트웨어의 기능은, PDB에 저장된 파일의 많은에 숨겨져 전체 구조의 특징을 보여준다. 예를 들어, 해당 원자의 평균 제곱근 적합의 기초에 관련 구조의 종래의 정렬과 비슷한 공간 경로의 일련의 t을 생산모자는 대략 O3의 DNA 연산자의 열 NMR 기반 모델은 락 억제 단백질 12 (그림 4 왼쪽)의 투구에 바인딩 여기, 서로에 중첩. 각 이중의 5'-말단 염기 쌍에 일반적인 좌표계에서 동일한 구조의 중첩은 분자가 분명하게 다른 방향 (오른쪽 그림 4)에서 플렉스하는 글로벌 구조의 상당한 왜곡을 보여준다. 구조적 변화는 대장균 락 억제 단백질 O3를 바인딩 오페론 24에서 O3 순차적으로 멀리 사업자 사이의 루프를 유도있는 용이성에 영향을 미칠 수 있습니다.

프로토콜 6에 설명 된 단계는 단백질과 다른 리간드와 임의의 사이트에서 장식 된 긴 DNA 단편의 모델을 구축하기위한 큰 고분자 어셈블리의 조직​​에 새로운 관점을 추가합니다. 이러한 모델은 다 분자 복합체하는 방법을 이해하는 데 도움이생물학적 처리하는 동안 상호 작용합니다. 그림 6에 도시 된 바와 같이, HBB 같은 건축 단백질의 정확한 위치는 DNA의 전체 폴딩에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 알려진 고해상도 구조 8 개의 사본이 43 염기쌍에 의해 분리 된 경우, 81 염기쌍의 DNA 조각은 단단한 거의 닫혀 구성으로 닫힙니다. 두 개의 단백질이 추가로 다섯 개의 염기쌍에 의해 분리 된 경우, DNA는 개방, 구불 구불 한 통로를 따릅니다. 단백질 장식 이중 쇼의 매우 다른 준비 방법 건축 단백질의 간격은 DNA 25, 26의 고리 화 반응 또는 반복에 영향을 미칠 수 있습니다.

그림 1
그림 1. DNA 차를 따라 연속적인 염기쌍 사이의 롤 각의 변화 (시각적 묘사를 위해 삽입 참조)에있는 보렐리 아 burgdorferi 8에서 HBB 단백질에 바인딩. 3DNA의 '분석'명령 및 프로토콜 2에서 설명하는 구조적 데이터를 사용하여 얻은 값. 스텝스에서 롤의 극단적 인 값을 참고 브라켓 구조의 중앙 번째.

그림 2
그림 2. 색으로 구분하는 원자 (, N-블루, O - 빨강, P-골드 C-시안)에 PyMOL에서 렌더링 '다시'3DNA의 기능을 사용하여 구성 DNA의 대략적인 원자 모형. HBB 단백질과 롤의 가장 큰 두 값이 0으로 설정되어 단계 매개 변수의 (오른쪽) 수정 세트 (왼쪽) 강체 단계 매개 변수에 따라 모델. 단계별 지침에 대한 프로토콜 3 참조 . 롤에서 부과하는 변화에 의해 유도 된 DNA의 전개를합니다.


그림 3. 시뮬레이션 구조 11 두 세트의 DNA를 따라 롤 각도의 모자이크 이미지. 프로토콜 4를 사용하여 추출 롤의 값, 범위 파란색에서 빨간색으로 색상으로 구분됩니다 [-5 °, 20 °]. 두 개의 14 기본 쌍 자기 보완 시퀀스 피리 미딘 - 퓨린 단계에서 발생하는 빨강 / 노랑 열 의해 강조 기지와 롤의 큰 값의 역순을합니다.

그림 4
그림 4. 기능 설명 라크 억제 단백질 투구 (12)과 O3의 DNA 연산자의 NMR-파생 구조에서 발견 된 DNA 모델의 만화 이미지PyMOL (백본 파란색 막대기로 골드 튜브와 기지로 표시)에서 렌더링하고 (왼쪽) PDB 항목 (2kek)의 좌표와 프로토콜 5에 제시 (오른쪽) 구조 중첩을 사용하여 정렬 명령을 'x3dna_ensemble 방향을 돌리'. 이미지의 . 5'-말단 염기 쌍에 대한 일반적인 참조 프레임에 배치 구조 사이에 큰 차이가 있습니다.

그림 5
그림 5. 화면 w3DNA 웹 서버에서 DNA 시퀀스의 설명 사양 (라벨 1), 언 바운드 DNA의 나선형 형태 (라벨 2) 위치 및 단백질의 신원 (라벨 3), 및 미리보기 이미지 확인란 (라벨 4) 총 프로토콜 6에서 설명하는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 6
그림 6. 긴 DNA 조각에 바인딩 된 두 개의 HBB 단백질 8 대략 원자 모델. 프로토콜 6에 설명 PyMOL에서 렌더링으로 w3DNA 웹 서버로 만든 구조. DNA가 원자 유형 (; N-블루, O - 빨강, P-골드 C-시안)​​에 의해 색 코딩하는 동안 단백질 사슬은 보라색 리본으로 표시됩니다. 각 단백질 결합 부위의 중앙 염기쌍이 위치에서 설정 86 기본 쌍의 DNA 사슬을 따라 (왼쪽) 20 62 81 기본 쌍의 DNA 사슬을 따라 (오른쪽) 20 67. 두 단백질의 증가 (5 개 기본 쌍) 변위와 관련된 구조의 접이식의 주요 변경 사항을 확인합니다.

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Discussion

이 문서에 제시된 프로토콜의 집합은 프로그램의 3DNA 제품군의 기능에 터치합니다. 도구 등 같은 페어링이 발생하는 이차 구조 컨텍스트를 결정하는 나선형 조각의 공간적 배치를 정량화하기 위해, 체인 백본을 따라 기지의 중복을 측정하기 위해, 비정규 기본 쌍을 식별하는 구조를 RNA에 적용 할 수 rebuild 명령은 사용자가 1 그림 삽입에 표시된 것과 기지와 기지 쌍의 간단하고 유익한 블록 표현을 생성 할 수 있습니다. 구축 도구는 여러 번, 트리플, 4 좌초 된 DNA 구조의 모델을 생성하기 위해, 주어진 구조 템플릿의 '스레드'다른 시퀀스 기능을 포함, 특정 방향으로 방향을 모델로, 등 마지막으로, 3DNA에는 ;에 대한 ARTS 웹 서버 핵산 27 SWS의 용 매화 (solvation) 웹 서비스 : 같은 다른 프로젝트의 숫자에 중요한 역할을정렬 RNA 차 구조 28, 분자 역학 결과 및 구조 예측 (29)의 분석을위한 MDDNA 웹 기반 도구, 대구 정보 기반의 단백질 DNA 도킹 방법 30, RNA 구조 31의 기능 주석에 대한 SARA 서버, 3D- DART의 DNA 구조 모델링 서버 32, 단백질 DNA 복합체 (33)의 구조 분석을위한 3 차원 공간 데이터베이스, RNA 구조 34 내에있는 3 차원 조각의 식별을위한 RNA FRABASE 2.0 데이터베이스, 그리고 쌍 비교 세터 웹 서버 RNA 구조 35. 우리가 아는 한, 기능과 3DNA의 강력한 성능 기록의 비교 다양한 조합을 가진 다른 핵산 구조 소프트웨어 패키지는 현재 없습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는 분자 역학 시뮬레이션에서 생성 된 DNA 이중 나선의 좌표를 공유하기위한 지리산 Šponer에 감사합니다. 우리는 또한 이러한 구조를 다운로드에 도움 나다 Spackova을 인정합니다. USPHS 연구 보조금을 통해이 작업을 지원 GM34809 및 GM096889은 기꺼이 인정 받고 있습니다.

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