Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

Bioengineering

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Summary

Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).

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Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415, doi:10.3791/4415 (2012).

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Abstract

Die Entdeckung von RNAi in Eukaryoten und der anschließenden Entwicklung von RNAi Mittel wie siRNA und shRNA, haben eine potente Verfahren zum Silencing spezifische Gene 1-8 für funktionelle Genomik und Therapeutika erreicht. Eine große Herausforderung bei RNAi basierenden Studien beteiligt ist die Lieferung von RNAi Agenten gezielt Zellen. Traditionelle non-viralen Techniken, wie Bulk-Elektroporation und chemische Transfektionsmethoden fehlt oft die notwendige räumliche Kontrolle über Lieferung und leisten schlechte Transfektionseffizienz 9-12. Jüngste Fortschritte in der chemischen Transfektionsmethoden wie kationische Lipide, kationische Polymere und Nanopartikel wurden in stark verbesserte Transfektionseffizienzen 13 geführt. Allerdings sind diese Techniken immer noch nicht präzise räumliche Kontrolle über Lieferzeiten, die immens Hochdurchsatz-Technologien, einzelne Zelle Studien und Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen können miniaturisierte Nutzen bieten.

nt "> Neueste technologische Fortschritte in der Gentransfer haben High-Throughput-Transfektion von adhärenten Zellen 14-23, ein Großteil davon mikroskaligen Elektroporation verwenden aktiviert. Microscale Elektroporation bietet präzise räumlich-zeitliche Kontrolle über Lieferung (bis auf einzelne Zellen) und hat sich gezeigt, um hohe Wirkungsgrade 19, 24-26. Zusätzlich zu erreichen, müssen Elektroporation Ansätze erfordern eine längere Inkubationszeit (in der Regel 4 Stunden) mit siRNA und DNA-Komplexe wie nötig in der chemischen Basis Transfektionsmethoden und führen zu direkten Eingabe der nackte siRNA und DNA Moleküle in die Zelle Zytoplasma. Als Folge Genexpression kann bereits sechs Stunden nach der Transfektion 27 erreicht werden. Unser Labor hat zuvor die Verwendung von Mikroelektrodenarrays (MEA) für die ortsspezifische Transfektion in adhärenter Säugerzellkulturen 17-19 gezeigt. In der MEA Ansatz, erfolgt die Lieferung der genetischen Nutzlast über lokale Mikro-Maßstab electroporati erreichtauf der Zellen. Eine Anwendung des elektrischen Impulses an den ausgewählten Elektroden erzeugt lokale elektrische Feld, die Elektroporation von Zellen in der Region der stimulierten Elektroden führt. Die unabhängige Steuerung der Mikroelektroden stellt räumliche und zeitliche Steuerung über Transfektion und ermöglicht auch mehrere Transfektion basierte Experimente auf der gleichen Kultur durchgeführt werden Erhöhung des Durchsatzes und zur Verringerung experimentellen Kultur-zu-Kultur Variabilität.

Hier beschreiben wir den Versuchsaufbau und das Protokoll für die gezielte Transfektion von adhärenten HeLa-Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten verschlüsselten Sequenz siRNA mittels Elektroporation. Das gleiche Protokoll kann auch zur Transfektion von Plasmid-Vektoren verwendet werden. Zusätzlich kann das hier beschriebene Protokoll leicht an eine Vielzahl von Säugetier-Zelllinien mit geringfügigen Modifikationen verlängert werden. Kommerzielle Verfügbarkeit von MEAs sowohl mit vordefinierten und benutzerdefinierten Elektrode Muster machen diese Technik zugänglich to die meisten Forschungslabors mit grundlegenden Zellkultur Ausrüstung.

Protocol

Ein. MEA Vorbereitung

  1. MEAs zur Verwendung bei Elektroporation Experimenten kann entweder unter Verwendung von Standard-Photolithographietechnik werden, wie zuvor beschrieben 18 oder direkt von gekauften Anbieter von MEA Herstellern wie Multi Channel Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) und Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Die MEAs in unseren Experimenten verwendet wurden, in-house im Reinraum in Arizona State University, die vom Center for Solid State Electronics Research (CSSER) verabreicht wird hergestellt. Die MEAs in unseren Experimenten verwendet wurden, hatten 32 Indium-Zinn-Oxid-Elektroden in einem 8 x 4 Array mit Elektroden-Durchmesser Größen von 50-200 um innerhalb eines 1 cm Innendurchmesser Glas gut. Das Glas wurde auch auf der MEA unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) verklebt ist.
  2. Sterilisieren MEA in einem Autoklaven vor cell seeding. Andere Verfahren zum Sterilisieren wie eine Einweichen in 70% Ethanol, UV-Behandlung und Behandlung mit heißem Wasser als auch an anderer Stelle beschrieben verwendet, so lange sie nicht gefährden die Integrität des MEA werden.
  3. Übertragen Sie die autoklaviert MEA zu einer laminaren Strömung Haube und legen Sie sie in einem Standard-sterile Polystyrol Petrischale. Vor dem Aussäen Zellen auf der MEA, sterilisieren Laminarströmungshaube durch Einschalten der UV-Licht für 20 min. Wenn der MEA ist empfindlich gegenüber UV-Licht decken die Petrischale mit der MEA mit steriler Aluminiumfolie während die Strömung Haube ist unter UV-Beleuchtung.

2. Seeding Cells auf der MEA

  1. Ernte von Zellen aus einem laufenden Zelllinie von adhärenten Säugetierzellen mit Trypsin / EDTA und heben sie bis zu einer Konzentration von 100-200 Zellen / ul in 1 ml Zellmedium zum Plattieren. In unseren Experimenten haben wir bei der Kultivierung NIH 3T3 Fibroblasten-Zelllinie HeLa-Zelllinie und primären kortikalen und hippocampalen Neuronen auf der MEA erfolgreich.
  2. 2 h nach dem Aussäen der Zellen übertragen die Petrischale mit der MEA aus dem Inkubator in Laminarströmungshaube und sanft hinzuzufügen 400-500 ul pre erwärmt Medien (37 ° C) zu der MEA gut. Unter dem Mikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen noch gebunden sind und gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt MEA. Übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. Das 2 hr Warteperiode vor der Zugabe von Medien sorgt genügend Zeit für die Zellen mit der MEA Oberfläche haften. Zugabe von Zell-Medien zu früh nach dem Aussäen der Zellen abzuwaschen die Zellen. Wenn Zellen nicht gut haften kann auf der MEA, kann seine Oberfläche mit Zellhaftung Faktoren wie aspolylysine, Fibronectin und Laminin behandelt werden, um die Zelladhäsion zu verbessern. In unserem HeLa-Zelle Experimente, die wir in der Regel behandeln die MEA Oberfläche mit fibronectin (10 ug / ml) für 1-2 Std.
  3. 8-12 Stunden nach dem Aussäen der Zellen, führen 1-2 Waschgängen mit PBS sie keine toten Zellen zu entfernen. Zellmedium ersetzt alle 24-48 Stunden nach Bedarf. In einem typischen Experiment werden die Zellen gewöhnlich Transfektion 24-48 h nach der Aussaat. Um die Konsistenz bei der Elektroporation Effizienz zu erhalten empfiehlt es sich zu warten, bis die Kultur ist mindestens 80% konfluent vor der Elektroporation.

3. Site-spezifische Transfektion von siRNA

  1. Planen Nukleinsäurelösung. Für siRNA Transfektion, bereiten Sie einen 1-2 uM siRNA Elektroporation Lösung in eiskaltem Elektroporationspuffer, um ein Endvolumen von 200-400 ul erreichen. In diesem Video Artikel zeigen wir die Transfektion von HeLa-Zellen mit Alexa 488 konjugierten verschlüsselten Sequenz von siRNA.
  2. Übertragen der MEA mit Zellen aus dem Inkubator in sterilen Sterilbank. Entfernen Sie die Zelle Medien aus dem MEA und führen Sie einen Waschgang mit PBS. Danach fügen 200-400 ul des ice kalten 1 uM siRNA Elektroporation Lösung für das gut.
  3. Anwenden anodischen quadratischen elektrische Impulse an die gezielte Elektroden (siehe 4 zur Bestimmung der optimalen Parameter des elektrischen Impulses Schritt). In unseren Experimenten verwendeten wir einen pragmatischen Instruments 2414A Waveform-Generator in elektrische Impulse und ein Dual-Inline-Package (DIP) 16 pin clip den Kontakt mit den MEA Bondpads machen zu generieren. Der Wellenformgenerator können zur DIP Clips über einen Demultiplexer Leiterplatte an Selektivität der einzelnen Elektroden bereitzustellen angeschlossen werden. Für die Referenzelektrode, legen eine Stahlkathode in dem Zellmedium. Gleichzeitig wird der Stahl Referenzelektrode in den Medien ist es extrem wichtig, um sicherzustellen, dass es keinen Kontakt mit der MEA Oberfläche. Bei Kontakt, kann es zu Schädigungen der Zellen und der MEA. Es wird empfohlen, um die Referenz-Elektrode mit einer Höhe von mindestens 1 mm oberhalb der Zellen abzusenken. Ein Abstandshalter mit einer Höhe von 1 mm können in der Vertiefung zu helfen bei Platzierung des ref abgegeben werdenerenz Elektrode. Ein alternativer Ansatz zur Verwendung eines externen Referenzelektrode ist in benachbarte Elektroden als Kathoden-Anoden-Paare verwendet werden.
  4. Sofort nach dem Auftragen die elektrischen Impulse an die gezielte Elektroden auf der MEA, übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator. Nach einer Inkubationszeit von 5 min sanft ersetzt 75% des Elektroporation Puffer mit vorgewärmten (37 ° C) Zelle Medien. Später kann Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt, um die Lieferung von fluoreszierend markierten siRNA zu den Zellen zu bestätigen.

4. Elektroporation Parameter Optimization

  1. Um die optimalen elektrischen Pulsparameter zur Elektroporation, Design Elektroporation Experimente für einen Bereich von Werten der Impulsamplitude, Impulsdauer, und die Anzahl der Impulse zu bestimmen. Nach unserer Erfahrung mit HeLa-Zellen wurde beobachtet, dass ein einzelner Spannungspuls von Amplitude von 3 V bis 9 V, und die Dauer von 1 msec bis 10 msec für eine Elektrode eine Größe von 100 um führte zu erfolgreichen Elektroporation mit minimal Zelltod. Es ist unsere Empfehlung, dass ein Parameter zu einem Zeitpunkt variiert werden und andere konstant gehalten werden. Um die Effizienz Elektroporation für jeden der Impulsparameter quantifizieren, verwenden wir Propidiumiodid (PI), eine Zelle impermeante Farbstoff daß Flecken Nukleinmaterial und Live Assay basierte Methodik, wie in Schritten von 4,2 bis 4,5 beschrieben.
  2. Stellen Sie eine Zellkultur auf der MEA nach den Anweisungen in Schritt 1 und 2 dargestellt.
  3. Vor der Elektroporation bereiten 300-500 ul von 30 ug / ml PI-Lösung in eiskaltem Elektroporation Puffer und 400 ul von 4 uM calcien AM-Lösung in PBS.
  4. Übertragen der MEA aus dem Inkubator zur Sterilbank. Entfernen Sie die Zelle Medien aus dem MEA und führen Sie einen Waschgang mit PBS. Danach fügen 300-500 ul des eiskalten Elektroporation Puffer mit PI.
  5. Anwenden elektrischer Impulse mit gewünschten Puls Amplitude und Dauer, um die gezielten Elektroden (Die Ausrüstung in unseren Experimenten zum Erzeugen und Anlegen des elek verwendettric Impuls an der MEA im Schritt 3.3) beschrieben. Für die Referenzelektrode entweder abzusenken einen Stahl-Elektrode in die Elektroporationspuffer in der MEA gut oder den benachbarten Elektrode als Referenz. Durch selektives Anlegen von Impulsen variierender Amplituden oder Dauern, um verschiedene Elektroden mehrere Experimente können auf demselben Gerät durchgeführt werden. Beispielsweise auf einem 32-Elektrode MEA kann durch Spalten 8 Versuche durchgeführt werden, um die Elektroden 32 in 8 Gruppen, jeweils bestehend aus 4 Elektroden. Jede der acht Gruppen können dann durch einen einzigen rechteckigen Spannungsimpuls von 5 msec Dauer mit variierenden Amplituden in 3 V-6 V bei 0,5 V-Schritten und eine Gruppe stimuliert werden kann als Kontrolle verwendet werden.
  6. Unmittelbar nach dem Auftragen die Spannungsimpulse übertragen die MEA zum Inkubator für 5 min. Danach entfernen Sie vorsichtig 75% der Elektroporation Puffer aus dem MEA gut und ersetzen Sie es mit warmem Zellmedien. Übertragen Sie die MEA zurück in den Inkubator.
  7. Nach einer Inkubationszeit von 2-4 hersetzen Sie die Zelle Medien in der MEA gut mit 300-500 ul 4 uM Calcein AM-Lösung in PBS. Übertragen Sie die MEA zurück zum Inkubator für weitere 30 min.
  8. Nach der Inkubation der Zellen mit Calcein AM, Calcein AM ersetzen Lösung in der MEA gut mit PBS nach zweimaligem Waschen mit PBS. Erhalten Fluoreszenzbilder der Zellen unter Verwendung mit einem optischen Mikroskop mit Filtern für PI (Anregung / Emission - 535 nm/617 nm) und Calcein AM (Anregung / Emission - 490 nm/520 nm). Die Aufnahme von PI aufgrund Elektroporation bewirkt Zellen fluoreszieren rot und die Calcein AM verursacht Zellen, die lebendig zu fluoreszieren grün sind. Drei mögliche Szenarien, die beobachtet werden können, sind 1) Zelle elektroporierten und lebendig (fluoreszieren sowohl rot und grün), 2) Cells lebendig, aber nicht elektroporiert (fluoresziert nur grün) und 3) Cells Toten durch Elektroporation (fluoresziert nur rot) . Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozent der Gesamtzahl der Zellen am Leben auf der Elektrode und der Elektroporation eff berechneticiency wurde als Prozent der Gesamtzahl der Zellen mit PI / siRNA geladen berechnet.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die site-spezifische Belastung von HeLa-Zellen mit PI. Es kann beobachtet werden, dass nur Zellen auf der Elektrode eine Aufnahme von PI (1B) nachzuweisen. Ein Live-Assay durchgeführt nach der Elektroporation wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen (1A) zu beurteilen. Die Elektroporation Effizienz und Zelllebensfähigkeit für das Beispiel in 1 gezeigt sind 81,8% und 96,1% betragen. Hohe Zelllebensfähigkeit und Elektroporation Effizienz kann durch Optimierung der Elektroporation Pulsparameter erreicht werden. Ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit fluoreszierend markierten siRNA zur optimierten Impulses Elektroporation (8 V, 1 ms) ist in Abbildung 2 gezeigt. Die Elektroporation Effizienz für die siRNA bei 8 V, 1 ms wurde festgestellt, dass 74,4 von ± 16,0% undZelllebensfähigkeit wurde gefunden, 87,9 ± 8,4% (alle Angaben als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, N = 5) sein.

Abbildung 1
Abbildung 1. Ortsspezifische Lieferung von PI in HeLa-Zellen auf einem 200 um-Elektrode (6 V, 5 ms). A) Calcien basierende Live-Assay durchgeführt 2 h nach der Elektroporation. Lebenden Zellen werden durch grüne Fluoreszenz. B) Rot-Fluoreszenz zeigt die Aufnahme von PI von Zellen auf der Elektrode. C) Eine überlagerte Bild von A und B. Die weißen Pfeile zeigen Zellen, die Elektroporation und lebendig sind. Die schwarzen Pfeile zeigen Zellen, die tot sind. Der weiße Kreis in A, B und C zeigt den Umriss der Elektrode.

Abbildung 2
Abbildung 2. Transfektion von HeLa-Zellen mit fluoreszenzmarkierten scramble Abfolge von siRNA. A) Bild von HeLa-Zellen auf einem 100 um Elektrode mit Alexa 488 markierten siRNA (8 V, 1 ms) transfiziert. B) Bild von Zellkerne mit DAPI gefärbt. Der weiße Kreis markiert den Rand der Elektrode.

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Discussion

In diesem Video Artikel zeigen wir die Verwendung von MEA für die ortsspezifische Transfektion von HeLa-Zellen mit verschlüsselten Sequenz von siRNA. Einer der Vorteile dieser Technologie ist die Anwendbarkeit auf verschiedene Zelllinien einschließlich primären Zelllinien. Unser Labor hat zuvor die Verwendung dieser Technologie für die ortsspezifische Transfektion von primären hippocampalen Neuronen Kultur von E18 Tage alten Ratten und NIH-3T3-Zellen mit verwürfelten siRNA Sequenzen und GFP-Plasmid 18, 19 gezeigt. Wir haben auch erfolgreich bei der Bereitstellung funktioneller siRNA gegen ein endogenes Target in HeLa-Zellen (unveröffentlichte Daten) hatte. Eine typische kommerziell erhältliche MEA ist kompatibel mit optischen Bildgebung (aufrechten Mikroskop), so dass quantitative Abschätzung der funktionellen Auswirkungen von Gen-Silencing, unter Verwendung von fluoreszierenden Immunfärbung Techniken. Zusätzlich können die Mikroelektroden in MEA verwendet, um elektrische Aktivität der Zellen, wie primären Neuronen überwacht werden, in Reaktion auf genetische Störung. Dieeinzigartige Natur der MEA ermöglicht gleichzeitige mehrfache Versuche auf einem einzigen Zellkultur, wodurch die experimentellen Durchsatz. Derzeit eine große Einschränkung der MEA basiertes System ist die große Menge von siRNA zur Transfektion (400 ul von 1 um siRNA), die eine hohe Transfektionseffizienz zu herkömmlichen chemischen Ansätze verglichen wird benötigt und begrenzt somit die Wirtschaftlichkeit des Systems. Dies kann teilweise durch Einarbeiten mircofluidics mit der MEA basierten System, um das Gesamtvolumen von siRNA Elektroporation Lösung auf weniger als ein paar Mikroliter verringern überwunden werden. Zusätzlich können die Mikrofluidik ermöglichen seriellen Abgabe unterschiedlicher siRNA-Moleküle; dadurch stark verbessert den Durchsatz der MEA basierten Technologie. Alternativ kann siRNA-Moleküle auf den Mikroelektroden vor Zellaussaat beschmutzt werden und dann die siRNA-Moleküle können in Zellen durch Elektroporation umgekehrter 15, 23 transfiziert werden. Die weitere Entwicklung dieser Technologie bietet eine neuartige High-throughput, effiziente und kostengünstige Methode zur Genmanipulation Studien.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell media:
Advanced MEM
L-Glutamine 200 mM
Penicillin/Streptomycin
Fetal bovine serum
Gibco/Invitrogen
Himedia Laboratories/VWR
Lonza group Ltd.
Gibco/Invitrogen
12492-013
95057-448
09-757F
16000-044
Cell media composition:
2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA Mediatech, Inc. 25-053-CL
PBS Mediatech, Inc. 21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA Qiagen, Inc. 1027292
Electroporation buffer Biorad Laboratories 165-2677
Waveform generator Pragmatic 2414A Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.

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References

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