En Low Cost Opsætning til Behavioral Audiometeret i Gnavere

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En hurtig og billig metode til adfærdsmæssige bestemmelse af høre parametre som høretærsklerne, hørenedsættelser eller fantom opfattelser (subjektive tinnitus) er beskrevet. Det bruger pre-pulse inhibition af den akustiske forskrækkelsesrespons og kan nemt implementeres i en personlig computer ved hjælp af en programmerbar AD / DA-konverter og et piezo-sensor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tziridis, K., Ahlf, S., Schulze, H. A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents. J. Vis. Exp. (68), e4433, doi:10.3791/4433 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I auditive dyreforsøg er det afgørende at få nøjagtige oplysninger om grundlæggende høreapparater parametre for animalske emner, der er involveret i forsøgene. Sådanne parametre kan være fysiologiske respons egenskaber for den auditive pathway fx via hjernestammeaudiometri (Bera). Men disse metoder giver kun indirekte og usikker ekstrapoleringer om det auditive percept, der svarer til disse fysiologiske parametre. At vurdere den perceptuelle grad af hørelse, adfærdsmæssige metoder skal anvendes. Et potentielt problem med brugen af adfærdsmæssige metoder til beskrivelse af opfattelsen i dyremodeller er det faktum, at de fleste af disse metoder indebærer en vis form for læring paradigme, før fagene kan behaviorally testes, kan fx dyr nødt til at lære at trykke på en løftestang i respons på en lyd. Da disse learning paradigmer ændre selve sansningen 1,2 de derfor vil påvirke noget resultat om perception opnået meddisse metoder og derfor skal fortolkes med forsigtighed. Undtagelser er paradigmer, der gør brug af refleks respons, fordi her ingen læring paradigmer skal foretages forud for perceptuel testning. En sådan refleks reaktion er den akustiske forskrækkelsesrespons (ASR), der kan meget reproducerbart kan fremkaldes med uventede høje lyde i naive dyr. Denne ASR igen kan påvirkes ved forudgående lyde afhængigt af opfattelsen af ​​denne tidligere stimulus: lyder langt over høretærsklen vil fuldstændig inhiberer amplituden af ​​ASR, lyder tæt på grænsen vil kun svagt inhiberer ASR. Dette fænomen kaldes pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, og mængden af PPI i ASR gradvist afhænger af synligheden af præ-puls. PPI af ASR er derfor velegnet til at bestemme adfærdsmæssige audiogrammer hos naive, ikke-uddannede dyr, for at bestemme hørenedsættelse eller endda at opdage mulige subjektive tinnitus perceptioner i dissedyr. I denne rapport demonstrerer anvendelsen af denne metode i en gnavermodel (se også ref. 5), den mongolske hoppemus (Meriones unguiculatus), som er en velkendt model arter for forskrækkelsesrespons forskning inden for det normale menneskelige høreområde (fx 6).

Protocol

1. Opsætning Montering og Software Programmering

  1. Installer en D / A kort i en personlig computer (f.eks: NI PCI 6229, National Instruments) og slutte den til en breakout-boks (fx: BNC-2110, National Instruments), bør begge understøtte mindst én indgang og én udgang kanal med en samplingfrekvens på mindst 44,1 kHz hver.
  2. Forbind udgangen af breakout-box via BNC-kabel til en sund forstærker (f.eks AMP75 bredbånds effektforstærker, Thomas Wulf).
  3. Installer en infrarød webcam (f.eks: Grand IP Camera Pro, Grandtec Electronics) for dyr overvågning i mørke.
  4. Installer en Integrated Development Environment (f.eks: Matlab) at gennemføre et program som defineret af rutediagrammet i figur 1. En version, der kører på Matlab 2007b kan fås gratis hos den tilsvarende forfatter.
  5. Inden for en lydisoleret kammer installere en højttaler på et bord. Tilslut højttaleren to lyden forstærker.
  6. Installer et piezo-sensor (f.eks kraft sensor FSG15N1A, Honeywell) på toppen af en isolerende bord, støtte det med magt og tilslut den via BNC-kabel til indgangen af breakout-box, jord sensorsignalet.
  7. Opbygge et målekammer fra en acrylisk glasrør justeret til størrelsen af gnaver at måle (for sandrotter fx: længde 15 cm, indvendig diameter 4,3 cm, udvendig diameter 4,8 cm). Fastsætte en rist med en maskevidde på 0,5 mm til den forreste del af røret og en polstret dør med en låsemekanisme (eksempelvis en krog) bagud. Fikseringen kan ske med varm lim, for døren kun hængslet og redningen for krogen er fastgjort til røret.
  8. Vedhæft skumplast fødder, der passer til de måle rørdimensioner på den isolerende sensor bord. Fødder skal understøtte røret under den forreste og bageste ende og løft røret til sensoren niveau. Sørg for, at der er lys kontakt mellem piezo-sensoren og målekammeret. Fastgør sensoren bord med målekammeret centreret foran højttaleren og sætte en mikrofon for en forsvarlig kontrol siden den (f.eks B & K Type 2669 / B & K Type 4190 forbundet til måling forstærker B & K Type 2610, alle: Bruel og Kjær) i niveauet af dyrene hovedet, således at det ikke interfererer med røret.
  9. Bemærk, at kvaliteten af ​​dine audiometriske data vil afhænge af kvaliteten af ​​dit lydsystem. Under alle omstændigheder bruge mikrofonen og måling forstærker til at bestemme hyppigheden overføringsfunktionen for systemet, før du dine første eksperimenter og omfatter en rutine i din software til at korrigere for denne frekvens transfer funktion til at gøre den spektrale output af din højttaler flad.
  10. Ret webcam med opsætningen, så man kan overvåge dyrs adfærd.

2. Behavioral Bestemmelse af høretærsklerne (audiogram)

  1. Tage dyret fra dets hjembur og sætte det med hovedet først i røret cmister døren.
  2. Sæt røret på skum fødder og sensoren. Sluk alt lys og lukke døren til kammeret. Kammeret selv er ikke aircondition, men har den temperatur, luftfugtighed og andre miljømæssige variabler af det omgivende laboratorium. Luftskifte af ventilatorer er ikke tilrådeligt på grund af den inducerede støj, men volumenet af kammeret understøtter oxygen for dyret i mange timer. Vent 15 min til, at dyret at vænne sig til opsætningen. Den akklimatisering tid er til gavn for dyret, da det kan berolige i sit eget tempo og vænne sig til røret. På den anden side, kan man ikke se nogen forskelle i opførsel under akklimatisering tid over flere session, hvilket indikerer, at en ekstra session for fortrolige dyret med røret og kammeret inden forsøget ikke er nødvendig.
  3. Start programmet og definere de parametre for stimulation (jf. også ref 5).: Stimuli består af rene toner med forskellig frekvenser. Den forskrækkelse stimulus skal præsenteres med et lydtrykniveau højt nok til at reproducerbart fremkalde en startle response. I vores laboratorium bruger vi intensiteter af 105 dB SPL (stimulus varighed 6 ms herunder 2 ms cosinus-kvadrerede opadgående og nedadgående ramper) til at fremkalde startle reaktioner i mongolske hoppemus. De teststimulus forud for de startle stimuli præsenteres ved varierende frekvenser og intensiteter i området, der skal testes, sædvanligvis fra neden høretærsklen til niveauer langt over tærsklen og med frekvenser, der dækker hele hørbare område af arterne. Hyppighed og varighed af startle og testen stimulus matches i hvert forsøg, er interstimulus intervallet mellem startle og test stimulus sat til 100 ms. Brug mindst 15 gentagelser med randomiserede interstimulus intervaller på 10 ± 2,5 sek for hver frekvens og intensitet kombination af test-stimuli (se figur 2A, venstre). Efterfølgende teststimulus kan præsenteres i enten randomiseret eller ikke-løbdomized rækkefølge. Hvis du bruger et ikke-randomiseret tilgang (f.eks, en test stimulus niveau er fastsat for alle testede frekvenser) tillader 5 min for inddrivelse mellem forskellige stimulus sæt. Bemærk, at den bestemte absolutte tærskel afhænger af randomiseringen af de stimuli, men mulige relative forskydninger af tærskelværdien vil ikke (fx efter akustisk traume, jfr. Ref. 5).
  4. Inden vi analyserer data, fjerne ugyldige forsøg fra datasættet (f.eks forsøg, hvor dyret flyttes før den forskrækkelse stimulus,. Jf. figur 2b).
  5. Inden for et tidsvindue af de første 50 ms efter startle stimulus, beregne respons amplituden (topafstand mellem det første maksimum til det første minimum af reaktionen) og respons latenstiden (tiden fra stimulus start til reaktion indtræden) af hvert enkelt forsøg .
  6. Sæt en Boltzmann-funktion til de fuldstændige responsamplituden datasæt af en frekvens sorteret for prestimulus intensitet for alle gyldige single forsøg. Den 50% punktet af Boltzmann-funktionen 7 viser høretærsklen for denne stimulering frekvens.

3. Akustisk Trauma og Kvantificering af nedsat hørelse

  1. Fremstille ketamin-xylazin-anæstesi med en blanding af ketamin-hydrochlorid: 96 mg / kg (ketamin-ratiopharm, Ratiopharm), xylazin-hydrochlorid: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer), atropinsulfat: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) og fysiologisk NaCl-opløsning (Berlin-Chemie AG, Berlin) med et forhold på 9:1:2:8.
  2. Injicere dyret med 3 ml / kg af anæstesi subkutant. Vent, indtil dyret er dybt bedøvet (ca. 5 min, tjek reflekser, fx bruge pedalen tilbagetrækning refleks). At opretholde anæstesi under målingerne, kontinuerligt injiceres den anæstetiske opløsning ved en hastighed på 3 ml / kg / time under anvendelse af en sprøjtepumpe. Styr livstegn med udstyr (f.eks vejrtrækning via kamera) og holde dyret varmt ved placing den på en opvarmning pad.
  3. Fremkald en akustisk traume, fx ved hjælp af en høj ren tone: fx 2 kHz ved 115dB SPL i 75 min.
  4. Efter afslutningen af ​​traumer stoppe sprøjtepumpen og lad dyret vågen i et wake-up bur på en opvarmning pad på et roligt sted. Kontrollér regelmæssigt i løbet af opvågningen fase, hvis de vitale tegn er stabile. Aflive dyret i dets hjembur, når den er helt vågen. Lad dyret komme sig efter anæstesi (mindst 2 dage) og hvile i sit hjem bur.
  5. Udfør 2,1 til 2,6 igen. Sammenlign høretærsklerne før og efter den akustiske traumer ved at beregne procentdelen af ​​høretab for hver frekvens. Efter afslutningen af ​​alle eksperimenter smertefrit aflive dyret.

4. Test for Acoustic Phantom Perception (Subjektiv tinnitus)

  1. Udføre disse målinger før og efter den akustiske traumer.
  2. Følg fra 2,1 til 2,2, hvis dyret ikke allerede er i opsætningen.
  3. A nNTAL stimulering paradigmer kan anvendes til at teste gnavere for subjektiv tinnitus. Forholdet i alle disse fremgangsmåder er at teste for prominens af et tavst mellemrum i en baggrundsstøj. Hvis mellemrummet opfattes af dyrene, kan den anvendes som en test stimulus for at reducere en startle response analogt med fremgangsmåden beskrevet i 2. Hvis dyret lider af tinnitus (som er tilbøjelige til at udvikle efter akustisk traume), vil denne tinnitus blive opfattet i den tavse hul og derfor gør hullet mindre fremtrædende. Effekten af hullet på forskrækkelsesrespons derfor vil være svagere i tinnitus dyr sammenlignet med raske kontrolpersoner (reduceret PPI, jfr. 8). Denne percept testes med to lidt forskellige protokoller.
  4. I den første subjektive tinnitus paradigme præsenteres her (. Figur 2A, center, jf. 9) anvendes følgende parametre for stimulation: startle lydintensitet 105 dB SPL med frekvenser fra 1 til 16 kHz i 1 oktav ad gangen, stimulos længde 6 ms herunder 2 ms cosinus-kvadrerede opadgående og nedadgående ramper. Fremlægge en hvid støj baggrund på 50 dB SPL under eksperimentet, enten med eller uden et 15 ms mellemrum, der går forud for startle stimulus ved 100 ms; stede mindst 15 forsøg for hver frekvens og gap-tilstand. Hvis du bruger en ikke-randomiseret tilgang, kan gå 5 min recovery mellem de forskellige hjælpepakker sæt. Anvendelse af forskellige startle stimulus frekvenser vil give et groft skøn over den formodede tinnitus frekvens.
  5. Som et andet subjektivt tinnitus paradigme (figur 2A, højre) kan du bruge følgende stimulation parametre: startle lydintensitet 105 dB SPL, skal du dobbeltklikke på stimulus med 0,1 ms varighed per klik og 0,1 ms mellem klik, det andet klik med den omvendte retning sammenlignet med den første. Præsentere en båndpasfiltreres støj baggrund af 50 dB SPL med en Gaussisk filter bredde på 0,5 oktaver og center frekvenser fra 1 til 16 kHz i oktav ad gangen. Præsentere denne støj either med eller uden et 15 ms mellemrum, der går forud for startle stimulus med 100 ms, til stede i mindst 15 forsøg for hver frekvens og gap-tilstand. Hvis du bruger en ikke-randomiseret tilgang, kan gå 5 min recovery mellem de forskellige hjælpepakker sæt. Anvendelse af forskellige centrale frekvenser af den båndpas baggrundsstøjen vil give et groft skøn over den formodede tinnitus frekvens.
  6. Følg fra 2,4 til 2,5, normalisere alle opsamlede data med en reference datasæt for hver testet frekvens og hver traumer tilstand, dvs før og efter en akustisk traume.. Denne reference er responsamplituden til den rene tone startle stimulus uden nogen prestimulus (jf. 2,3). Frekvensen bestemmes enten ved ren tone eller centerfrekvensen af ​​båndpasfiltreres støj. Beregn den gennemsnitlige respons for hver reference og normalisere hvert beregnet responsamplituden ved at dividere den gennem dens reference.
  7. Beregn PPI ved at dividere de normaliserede respons-amplituder af mellemrummet condition gennem middelværdien af ​​den normaliserede ikke-hul tilstand hver testet frekvens.
  8. Beregn PPI ændringen efter traumet i procent for hver testet frekvens.

Forskrækkelsesrespons reaktioner af dyr er lette at generere og analysere. 2B giver en oversigt over et typisk resultat af et dyr stimuleret med en ren tone på 105 dB SPL uden prestimulus til 15 gange. De fleste af forsøgene er gyldige og ugyldige forsøg er nemme at genkende (forsøg markeret med en rød firkant). De respons amplituder og latenstider beregnes kun fra gyldige forsøg.

En typisk adfærdsmæssige tærskelværdi ændring er givet i figur 3A. Audiogrammet af et eksempel på dyr opnået ved fremgangsmåden beskrevet i 2 gives før (blå) og efter (rød) et akustisk traume ved 2 kHz (gult område). En klar høretab er vist specifikt ved 2 kHz. Svarene i forbindelse med en subjektiv tinnitus percept kan væreses i figur 3B er de normaliserede respons-amplituder i det samme dyr som ovenfor vist eksemplarisk for stimulationer en oktav under og over trauma som beskrevet i 4.5. Sammenligningen af ​​reaktioner på stimuli med og uden mellemrum før (blå) og efter traume (rød) tillader en fortolkning af en eventuel tinnitus percept. Under traume frekvens ingen ændring af reaktionsmønster kan findes medens over traumer effekten af ​​mellemrummet forsvandt efter traumet, hvilket indikerer en mispercept ved denne frekvens.

Figur 1
Figur 1. Flow diagram af programmet anvendes til at erhverve de adfærdsmæssige tærskler og subjektive tinnitus data. Bemærk, at dette kun er en forenklet version af programkoden. Forkortelser: GUI - grafisk brugergrænseflade, ISI - inter stimulus interval.


Figur 2. Auditory startle response (ASR) stimuli. A Ordninger af de tre forskellige stimulationsregimer anvendes. Venstre panel: pre-puls hæmning (PPI) af ASR målt uden nogen ren tone test stimulus før (grøn) den forskrækkelse tone (rød); svaret periode er afbildet i blåt. Center panel: hul / støj paradigme med ren tone startle stimulus præsentation af forskellige frekvenser på en hvid støj baggrund. Højre panel: hul / støj paradigme med klik startle stimulus præsentation på båndpasfiltreres baggrund af forskellige centerfrekvenser B Eksempler auditory startle besvarelser af 15 forsøg optaget med tærsklen paradigme uden prestimulus ved 1 kHz stimulation frekvens.. Tre forsøg tælles ugyldige (røde firkanter) som dyret bevægede allerede før stimulation debut.

<img alt = "Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" />
Figur 3. Eksempler på resultater af ASR i et dyr. En adfærdsmæssig tærskel før (blå) og efter (rød) den akustiske traume ved 2 kHz (gult område). De tærskelværdier er beregnet ud fra svarene på PPI moduleret ASR protokol ved hjælp af Boltzmann-funktionen vendepunkt som tærskelværdi. Bemærk, at høretabet ved 2 kHz beløber sig til mere end 66%, mens FARER væk fra traume frekvens man ofte kan se endnu bedre høretærskler B Normaliserede respons-amplituder (åbne cirkler:. Enkelt forsøg, fyldte cirkler: midler, whiskers: standardafvigelse) under stimulation med mellemrummet / støj klik ASR-protokol (4,5) for 1 og 4 kHz center frekvenser. Svarene er sorteret til forsøg med og uden hul i støjen før og efter traume ved 2 kHz. Kun på 4 kHz virkningen af ​​mellemrummet forsvinder efter traumet, som angiver en subjektiv tinnitus percept omkring dennefrekvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en billig og nem at bygge setup til audiometriske målinger i gnavere baseret på pre-puls hæmning af akustiske startle reaktioner, der kan bruges til at bestemme adfærdsmæssige høretærskler (= audiogrammer 10) og auditive fantom perceptioner som subjektive tinnitus 11. Især de sidstnævnte målinger er i fokus af flere nylige rapporter 8,12,13,14 og kan ses som en forudsætning for elektrofysiologiske undersøgelser af de neuronale mekanismer bag denne sygdom. Ved anvendelse af denne metode er det muligt differentiere hvilke dyr har udviklet en subjektiv tinnitus percept efter akustisk traume og dem, der ikke gjorde det, og derefter yderligere at undersøge disse personer, fx med elektrofysiologiske optagelser i primær auditive cortex.

Et afgørende skridt i analysen af ​​de startle data efter akustisk traume er en normalisering af dataene til forskrækkelse amplitude, der kanmaksimalt være fremkaldt uden forudgående test stimulus: Dette er særlig vigtigt at skelne reducerede startle svar baseret på høretab fra formindsket PPI i tinnitus dyr: Virkningerne af den akustiske traumer ændrer sig over tid, da dyret delvist genvinder fra det, men omtrent 50 % af høretab er permanent. I modsætning til ovennævnte rapporter, hvor de auditive tærsklerne testes, men ikke anvendes til kalibrering, forsøgte vi at minimere virkningerne af de forskellige høretærskler af hver frekvens og virkningen af ​​den akustiske traumer selv ved at normalisere hver responsamplituden med en reference. Derudover bruger vi to forskellige slags protokoller at vurdere eventuelle tinnitus percept, med den første (4,4) arbejder bedre for dyr undersøgt over længere tidsskalaer fra en uge efter traumet, og den anden "klassiske" (4,5) arbejder bedre for dyr undersøgt i en uge efter traumer.

En begrænsning ved denne fremgangsmåde er clearly at man ikke kan vurdere de akutte virkninger af en akustisk traumer. Mindst to dage mellem bedøvelse og det første post-måling skal vælges, da dyret komme sig efter den. At opnå et estimat af akut høretab umiddelbart efter traumer, hjernestammeaudiometri (Bera) kan anvendes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (IZKF, projekt E7) ved University Hospital fra University of Erlangen-Nürnberg.

References

  1. Brown, M., Irvine, D. R., Park, V. N. Perceptual learning on an auditory frequency discrimination task by cats: association with changes in primary auditory cortex. Cereb. Cortex. 14, 952-965 (2004).
  2. Ohl, F. W., Scheich, H. Learning-induced plasticity in animal and human auditory cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 15, 470-477 (2005).
  3. Koch, M. The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol. 59, 107-128 (1999).
  4. Larrauri, J., Schmajuk, N. Prepulse inhibition mechanisms and cognitive processes: a review and model. EXS. 98, 245-278 (2006).
  5. Walter, M., Tziridis, K., Ahlf, S., Schulze, H. Context dependent auditory thresholds determined by brainstem audiometry and prepulse inhibition in Mongolian gerbils. Open Journal of Acoustics. 2, 34-49 (2012).
  6. Gaese, B. H., Nowotny, M., Pilz, P. K. Acoustic startle and prepulse inhibition in the Mongolian gerbil. Physiol. Behav. 98, 460-466 (2009).
  7. Fechter, L. D., Sheppard, L., Young, J. S., Zeger, S. Sensory threshold estimation from a continuously graded response produced by reflex modification audiometry. J. Acoust. Soc. Am. 84, 179-185 (1988).
  8. Turner, J. G., Parrish, J. Gap detection methods for assessing salicylate-induced tinnitus and hyperacusis in rats. Am. J. Audiol. 17, 185-192 (2008).
  9. Campeau, S., Davis, M. Fear potentiation of the acoustic startle reflex using noises of various spectral frequencies as conditioned stimuli. Animal Learning & Behavior. 20, 177-186 (1992).
  10. Young, J. S., Fechter, L. D. Reflex inhibition procedures for animal audiometry: a technique for assessing ototoxicity. J. Acoust. Soc. Am. 73, 1686-1693 (1983).
  11. Turner, J. G., Brozoski, T. J., Bauer, C. A., Parrish, J. L., Myers, K., Hughes, L. F., Caspary, D. M. Gap detection deficits in rats with tinnitus: a potential novel screening tool. Behav. Neurosci. 120, 188-195 (2006).
  12. Turner, J., Larsen, D. Relationship between noise exposure stimulus properties and tinnitus in rats: Results of a 12-month longitudinal study. ARO. Abs. 594, (2012).
  13. Turner, J. G. Behavioral measures of tinnitus in laboratory animals. Prog. Brain Res. 166, 147-156 (2007).
  14. Engineer, N. D., Riley, J. R., Seale, J. D., Vrana, W. A., Shetake, J. A., Shetake, J. A., Sudanagunta, S. P., Borland, M. S., Kilgard, M. P. Reversing pathological neural activity using targeted plasticity. Nature. 470, 101-104 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics