Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

Published 10/05/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Описывается два шага маркировки процесса с использованием β-glucosyltransferase (β-GT), чтобы передать азид-глюкозы до 5-HMC, а затем нажмите химия для передачи биотин компоновщика для легкой и плотности независимых обогащения. Это эффективный и конкретный маркировки метод позволяет обогащению 5-HMC с крайне низким фоном и высокой пропускной эпигеномном отображения с помощью следующего поколения секвенирования.

Cite this Article

Copy Citation

Li, Y., Song, C. X., He, C., Jin, P. Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. (68), e4441, doi:10.3791/4441 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

5-метилцитозин (5-MC) составляет ~ 2-8% от общего цитозина в геномной ДНК человека и влияет на широкий спектр биологических функций, включая экспрессию генов, поддержание целостности генома, родительского импринтинга, инактивации Х-хромосомы, регуляция развития, старения и рака 1. В последнее время в присутствии окисленного 5-тС, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), был обнаружен в клетках млекопитающих, в частности, в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и нервных клеток 2-4. 5-HMC образуется при окислении 5-тС катализируемой ТЕТ семьи железа (II) / α-КГ-зависимых диоксигеназ 2, 3. 5-HMC предлагается принять участие в поддержании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) клетки, нормального кроветворения и злокачественных новообразований, а также развития зиготы 2, 5-10. Чтобы лучше понять функции 5-HMC, надежный и простой последовательности системы имеет важное значение. Традиционная последовательность бисульфита не могут отличить 5-HMC из 5-тС 11 12.

Здесь мы опишем простой двухэтапной процедуры для селективного маркировки химической 5-HMC. На первом этапе маркировки, 5-HMC в геномной ДНК помечена с 6-азид-глюкозы, катализируемой β-GT, glucosyltransferase из бактериофага Т4, таким образом, что переводит 6-азид-глюкозы до 5-HMC из Изменения кофактора, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). На втором этапе, биотинилирование, линкер дисульфида биотин прикреплен к азид группу, нажав на кнопку химии. Оба шага весьма конкретные и эффективные, ведущие к полному маркировке независимо от обилия 5-HMC в геномных регионов и дает крайне низкий фон. После биотинилирования 5-HMC, 5-HMC-содержащих фрагменты ДНК затем выборочно захваченныеиспользованием стрептавидина бусы в плотности независимым образом. Полученный 5-HMC-обогащенного фрагменты ДНК могут быть использованы для последующего анализа, в том числе следующего поколения секвенирования.

Наш избирательный маркировки и захват протокол дает высокую чувствительность, применимы к любому источнику геномной ДНК с переменным / разнообразна 5-HMC содержания. Хотя основной целью этого протокола является его вниз по течению приложений (например,. Следующего поколения секвенирования, чтобы наметить 5-HMC распределение в геноме), она совместима с одной молекулой, в режиме реального времени SMRT (ДНК) последовательность, которая является способные доставлять одной базе резолюции последовательности 5-HMC.

Protocol

1. Геномной ДНК фрагментации

Фрагмент геномной ДНК с использованием ультразвука до нужного размера диапазона подходит для генома последовательности платформы. (Мы обычно разрушать ультразвуком до ~ 300 б.п.). Убедитесь, распределение по размерам фрагментированной геномной ДНК на 1% агарозном геле (рис. 1).

2. Подготовка ДНК

Определение исходной ДНК суммы, основанные на обилие 5-HMC в геномной ДНК. С 5-HMC уровни значительно различаются в разных типах тканей, начиная количества ДНК зависит от 5-HMC уровней образцов. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для примера.

3. β-GT катализируемой реакции (реакции глюкозы Transfer)

  1. Смешать с помощью пипетки смесью, как указано в таблице 2 и инкубировать при 37 ° С водяной бане в течение 1 часа.
  2. После инкубации, очистка реакции с QIAquick нуклеотидных Kit удаления, используя 10 мкг ДНК настолбца. Элюировать 30 мкл воды в колонке и объединить.

4. Биотинилирование реакции (Click Chemistry)

  1. Добавить DBCO-SS-PEG3-биотин сопряженных рабочий раствор (1 мм) в Элюированную решение ДНК (с шагом 3) до конечной концентрации 150 мкМ (то есть, 5 мкл рабочего раствора в 30 мкл раствора ДНК).
  2. Перемешать пипетированием и инкубируют при 37 ° C на водяной бане 2 часа.
  3. Очистка реакции с QIAquick нуклеотидных Kit удаления. В идеале общий объем элюирования 100 мкл.
  4. Количественная восстановленных ДНК сумму с помощью микролитр масштаба спектрофотометр (например,., NanoDrop).

5. Захват 5-HMC-содержащих ДНК

  1. Вымойте 50 мкл Dynabeads MyOne Стрептавидин C1 3 раза с 1 мл 1X B & W буфера в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Отделить бусин с магнитным стенда.
  2. Добавить равный объем 2X B & W буфер для восстановления биотинилированного DNA (100 мкл) в промытых бус.
  3. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре с легким вращением на ротатор.
  4. Отделить бусин с магнитным стенд и мыть гранул 3 раза с 1 мл 1X B & W буфера.
  5. Элюируйте ДНК путем инкубации бисером в 100 мкл свежеприготовленного 50 мМ DTT в течение 2 часов при комнатной температуре с легким вращением на ротатор.
  6. Отделить бусин с магнитным стенда. Аспирируйте элюента и нагрузка на Micro Bio-Spin 6 колонку в соответствии с инструкцией производство, чтобы удалить DTT. ДНК-мишени в решение сейчас.
  7. Очищают Элюированную ДНК из предыдущего шага по Qiagen MinElute ПЦР-комплект для очистки и элюируются ДНК в 10 мкл буфера EB. Количественная ДНК с использованием Кубит Флуорометр, или NanoDrop, если их концентрация превышает 20 нг / ул. ДНК готова для последующей генома подготовки библиотеке последовательности.

6. Представитель Результаты

Если качество выводаF геномной ДНК является высокой, типичной дает восстановление после β-GT и биотинилирование реакции ~ 60-70%. Тем не менее, эффективность захвата существенно различаться с различными типами тканей в зависимости от 5-HMC уровней образцов. Как правило, эффективность захвата головного мозга геномной ДНК составляет ~ 4-9%, а в некоторых крайних случаях эффективность может достигать 12%. Для ЭС клеток, средняя эффективность улавливания составляет ~ 2-4%, в отличие от ~ 0,5% для нейронных стволовых клеток. Низкая эффективность видели до сих пор было для геномной ДНК из раковых клеток. Все ДНК, обогащенной готова к стандартным следующего поколения протоколов библиотеке подготовки. Кроме того, захваченных ДНК может быть также использован в качестве шаблона для ПЦР в реальном времени для обнаружения обогащения некоторых фрагментов по сравнению с входным ДНК, если соответствующие праймеры имеются.

Рисунок 1
Рисунок 1. Ультразвуком геномной ДНК человека фрагментов в1% агарозном геле. 10 мкг геномной ДНК, выделенной из клеток человека плюрипотентных в 120 мкл 1X TE буфера ультразвуком помощью ультразвука устройство (Covaris). После обработки ультразвуком, 2 мкл ДНК ультразвуком был загружен на 1% агарозном геле с использованием 100 п.н. ДНК маркеров для сравнения размеров фрагментов ДНК ультразвуком.

Компонент Объем Конечная концентрация
Воды _ Мкл
10 X β-GT Реакционный буфер 2 мкл 1 X
До 10 мкг геномной ДНК _ Мкл До 500 нг / мкл
UDP-6-N 3-Glc (3 мМ) 0,67 мкл 100 мкМ
β-GT (40 мкм) 1 мкл 2 мкМ
Общий объем 20 мкл

I) Для ткани геномной ДНК (высокое 5-HMC содержимого> 0,1%)

Компонент Объем Конечная концентрация
Воды _ Мкл
10 X β-GT Реакционный буфер 10 мкл 1 X
До 20 мкг геномной ДНК _ Мкл До 500 нг / мкл
UDP-6-N3-Glc (3 мМ) 1,33 мкл 100 мкМ
β-GT (40 мкм) 2 мкл 2 мкМ
Общий объем 40 мкл

II) Для стволовых клеток геномной ДНК (в среднем 5-HMC содержание ~ 0,05%)

Компонент Объем Конечная концентрация
Воды _ Мкл
10 X β-GT Реакционный буфер 10 мкл 1 X
До 50 мкг геномной ДНК _ Мкл До 500 нг / мкл
UDP-6-N3-Glc (3 мМ) 3,33 мкл 100 мкМ
β-GT (40 мкм) 5 мкл 2 мкМ
Общий объем 100 мкл

III) Для раковых клеток геномной ДНК (низкой 5-HMC содержание ~ 0,01%)

Таблица 1. Примеры количество ДНК входа и маркировке реакций с использованием образцов с различными 5-HMC уровней селективный метод маркировки химических веществ.

Образец 5-HMC уровне Начиная ДНК (мкг) Восстановление после маркировки (вход с бисером) (мкг) Восстановление выход Выпадающие ДНК (нг) Выпадающие дают
Взрослые мозжечка мыши 0,4% 10 7,5 75% 236 3,1%
Послеродовая день 7 мышь мозжечка 0,1% 11 9 82% 140 1,6%
Мышь ЭС клеток E14 0,05% 60 42 70% 350 0,8%

Таблица 2. Представитель результаты мыши тканях мозга и ES клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) является недавно идентифицированных эпигенетической модификацией настоящего в значительных количествах в определенных типах клеток млекопитающих. Метод, представленный здесь для определения генома распределение 5-HMC. Мы используем бактериофага Т4 β-glucosyltransferase перенести инженерные часть глюкозы содержащие азид группу на гидроксильной группе 5-HMC. Азид группы могут быть химически модифицированы с биотином для обнаружения, близость обогащения, и последовательность 5-HMC-содержащих фрагментов ДНК в геномах млекопитающих. Этот протокол имеет преимущества по сравнению с 5-HMC основе антител гидроксиметилированных иммунопреципитации ДНК (hMeDIP-Seq) 13-15, хотя hMeDIP проста, она имеет сильный уклон в сторону высокой плотности 5-HMC регионов и обычно дает противоречивые результаты независимых притяжение -падений. Наш метод бы не ввести такую ​​предвзятость.

Есть, однако, два возможных проблем с точки зрения нашего маркировки и захватить меняТПК. Первая забота может быть специфика маркировки и захвата. С недавнем докладе указано, что 5-hydroxymethyluracil (5-ЖКХ) могут также служить в качестве субстрата β-GT, ложно-положительные сигналы могут быть введены, что приводит к обогащенным фрагменты, которые являются неспецифическими до 5-HMC-родства 16. Эта проблема может быть голословными, хотя, так как очень активного 5-hydroxymethyluracil-ДНК гликозилазами постоянно удаления этого повреждения ДНК, в результате чего существенно обнаружить 5-ЖКХ в геноме млекопитающих 17,18. Вторая проблема заключается в эффективности маркировки и захвата. С 5-HMC уровни значительно различаются в разных тканях и клетках, начиная с 0,5% в тканях мозга до 0,05% в ЭСК и 0,01% в раковых клетках, важно, что наши методы применимы ко всем этим тканям с точки зрения вниз по течению применение меченых и захватили геномной ДНК. Наш опыт показывает, что методы, описанные здесь, действительно, чувствительные и специфичныеДостаточно проанализировать все эти ткани с целью либо количественной основе сравнения 5-HMC уровнях между тканями или ниже по течению приложений, таких как глубокая секвенирования карту распределения 5-HMC в геноме 19-21.

Ключ к нашим методом является использование соответствующего количества исходного геномной ДНК. Если геномной ДНК концентрация слишком мала, эффективность маркировки и специфичность будет уменьшаться соответственно. Основываясь на нашем опыте, даже несмотря на обилие 5-HMC достаточно высок в ДНК из тканей мозга, если концентрация ниже 25 нг / мкл в 20 мкл реакции, маркировки и эффективность захвата, а также специфика, будет значительно сокращен. Для низкого обилия образцов ДНК, в дополнение к концентрации требование, общее количество ДНК необходимо получить высокие и конкретные эффективность захвата. Таким образом, хотя надо только 25 нг 5-HMC-обогащенных фрагментов ДНК на выходе йAndard библиотеки поколение протоколов, используемых платформ нового поколения секвенирования, начиная количество геномной ДНК из тканей мозга не должна быть менее 2 мкг (и идеальная стартовая сумма составляет 5-10 мкг). Путем проб и ошибок, мы оптимизировали исходного количества геномной ДНК из различных тканей с переменной 5-HMC содержания, чтобы получить высокую эффективность маркировки и специфичность, как указано в таблице 2.

Таким образом, наш метод квалифицирован, чтобы точно маркировать геномной 5-HMC и, в частности захвата 5-HMC-содержащих фрагментов, что делает его успешным протокол с точки зрения чувствительности и специфичности для последующих поколений анализа последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Это исследование было частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM071440 в CH и NS051630/MH076090/MH078972 к PJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
5M Sodium chloride (NaCl) Promega V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5 Invitrogen 15567-027)
HEPES 1M, pH7.4 Invitrogen 15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M Ambion AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate Click Chemistry Tools A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure Invitrogen 15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen 28304
Micro Bio-Spin 6 Column Bio-Rad 732-6222
Dynabeads MyOne Invitrogen 650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
UDP-6-N3-glucose Active Motif 55013
Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT) New England Biolab M0357
Equipment
Sonication device Covaris
Desktop centrifuge
Water bath Fisher Scientific
Gel running apparatus Bio-Rad
NanoDrop1000 Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker Barnstead
Labquake Tube Shaker Thermolyne
Magnetic Separation Stand Promega Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. Suppl 33. 245-254 (2003).
  2. Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
  3. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  6. Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
  7. Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
  8. Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
  9. Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
  10. Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
  11. Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
  12. Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
  13. Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
  14. Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
  15. Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
  16. Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. (2012).
  17. Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
  18. Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
  19. Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
  20. Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
  21. Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats