게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

Published 10/05/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

Cite this Article

Copy Citation

Li, Y., Song, C. X., He, C., Jin, P. Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. (68), e4441, doi:10.3791/4441 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

5 methylcytosine (5-MC)는 인간 게놈 DNA의 총 cytosines의 ~ 2-8%를 구성하고 유전자 발현, 게놈 무결성 유지, 부모의 각인, X-염색체 불 활성화, 규제 등의 생물학적 기능의 광범위한 영향을 개발, 노화, 암 1. 최근 산화 5 MC, 5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)의 존재는 배아 줄기 (ES) 세포와 neuronal 세포 2-4, 특히 포유류의 세포에서 발견되었습니다. 5 HMC는 TET 가족 철 (II) / α-ketoglutarate에 따라 달라 dioxygenases 2, 3 5 - MC 촉매의 산화에 의해 생성됩니다. 5 HMC는 배아 줄기 (MES) 세포, 정상 조혈 및 malignancies, 그리고 접합자 개발이 5-10의 유지에 참여 제안합니다. 더 나은 5 HMC의 기능을 이해하기 위해서는 안정적이고 간단한 시퀀싱 시스템이 필수적입니다. 전통 bisulfite 배열은 5 - MC 11 일부터 5 HMC을 구별 할 수 없습니다 12 포도당 잔기를 추가 박테리오파지 효소 활용, 라벨 및 5-HMC를 캡처 할 수있는 매우 효율적이고 선택적 화학 접근 방식을 개발했습니다.

여기 5 HMC의 선택적 화학 라벨에 대한 간단한 두 단계 절차를 설명합니다. 첫 번째 라벨 단계에서, 게놈 DNA의 5 HMC는에서 5 HMC에 6 azide 포도당를 전송하는 방식으로, β-GT, T4 박테리오파지에서 glucosyltransferase로 6 azide-포도당 촉매으로 표시됩니다 수정 cofactor, UDP-6-N3-Glc (6 N3UDPG). 두 번째 단계, biotinylation에서 이황화 비오틴의 링커는 클릭 화학으로 azide 그룹에 연결되어 있습니다. 두 단계는 게놈 지역에서 5 HMC의 풍부한 관계없이 라벨 매우 낮은 배경을 제공 완료로 이어지는, 매우 구체적이고 효율적이다. 5 HMC의 후 biotinylation, 5 HMC 함유 DNA 조각을 한 후 선택적으로 캡처되어밀도 독립적 인 방식으로 streptavidin 비즈를 사용합니다. 그 결과 5 HMC 강화 DNA 조각은 차세대 시퀀싱 등의 다운 스트림 분석을 위해 사용될 수있다.

우리의 선택 레이블 및 캡처 프로토콜은 다양한 / 변수 5 HMC의 abundances과 게놈 DNA의 소스에 해당 높은 감도를, 수여. 이 프로토콜의 주요 목적은 자사의 다운 스트림 응용 프로그램 (예., 차세대 시퀀싱은 게놈의 5 HMC 배포를지도)이지만, 단일 분자입니다 실시간 SMRT (DNA) 시퀀싱과 호환됩니다 5 HMC의 단일 기본 해상도 시퀀싱을 제공 할 수.

Protocol

1. 게놈 DNA 조각

원하는 크기 범위로 sonication을 사용하여 조각 게놈의 DNA는 게놈 전체 시퀀싱 플랫폼에 가장 적합합니다. (우리는 보통 ~ 300 BP에 sonicate.) 1% 아가로 오스 겔 (그림 1)에 조각 게놈의 DNA의 크기 분포를 확인합니다.

2. DNA 준비

게놈 DNA의 5 HMC의 풍부한에 따라 시작 DNA 금액을 확인합니다. 5 HMC 수준이 다른 조직 유형에 크게 다르므로, 시작 DNA의 금액은 샘플 5 HMC 수준에 따라 달라집니다. 예제 표 1을 참조하십시오.

3. β-GT 촉매 반응 (포도당 전송 반응)

  1. 1 시간에 37 ° C 물 목욕의 표 2와 배양에 명시된 바와 같이 혼합물을 pipetting하여 섞는다.
  2. 부화 후, DNA의 10 μg을 당 사용 QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리열. 열 30 μl 물 Elute과 조화를 이루고 있습니다.

4. Biotinylation 반응 (클릭 화학)

  1. 150 μm의 최종 농도 (즉, 30 μl DNA 솔루션에 따라 솔루션을 작업 5 μl)에 용출 DNA 솔루션 (3 단계에서) DBCO-SS-PEG3 - 비오틴 공액 작업 솔루션 (1 MM)를 추가합니다.
  2. 2 시간에 37 ° C 물 목욕에 pipetting 및 배양하여 섞는다.
  3. QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리. 이상적인 총 용출 볼륨은 100 μl입니다.
  4. 마이크로 리터 규모 분광 광도계 (예를 들면., NanoDrop)를 사용하여 복구 DNA 금액을 수량화.

5. 5 HMC 함유 DNA의 캡처

  1. 제조업체의 지시에 따라 1X B & W 버퍼 1 ML과 Dynabeads MyOne Streptavidin C1의 50 μl 3 번 씻으십시오. 자기 스탠드로 구슬을 분리합니다.
  2. 복구 biotinylated D에 배 B & W 버퍼의 동등한 볼륨을 추가세척 구슬로 NA (100 UL).
  3. 회선 근의 부드러운 회전 실온에서 15 분에 품다.
  4. 자기 스탠드로 구슬을 분리하고 1X B & W 버퍼 1 ML과 구슬에게 3 번 씻는다.
  5. 회선 근의 부드러운 회전 상온에서 2 시간에 신선하게 조리 된 50 ㎜의 DTT의 100 μl의 구슬을 잠복기하여 DNA를 Elute.
  6. 자기 스탠드로 구슬을 분리합니다. DTT를 제거 할 수있는 제조 지침에 따라 마이크로 바이오 스핀 6 열로 eluent와 부하를 대기음. 대상 DNA는 이제 솔루션입니다.
  7. EB 버퍼의 10 μl의 Qiagen PCR MinElute 정화 키트 및 elute의 DNA에 의해 이전 단계에서 용출 DNA를 정화. 농도가 20 NG / UL보다 높은 경우 큐빗 Fluorometer, 또는 NanoDrop를 사용하여 DNA를 정량화. DNA는 다운 스트림 게놈 전체 시퀀싱 도서관 준비 할 준비가되었습니다.

6. 대표 결과

품질 O 경우F 게놈 DNA가 높은, β-GT와 biotinylation 반응 후 일반적인 복구 수율은 ~ 60-70% 있습니다. 그러나, 캡처 효율은 샘플의 5 HMC 수준에 따라 서로 다른 조직 유형 상당히 다릅니다. 일반적으로, 뇌 게놈의 DNA에 대한 캡처 효율은 ~ 4-9%이며, 일부 극단적 인 경우에 효율은 12 %까지 도달 할 수 있습니다. ES 세포의 경우 평균 캡처 효율은 신경 줄기 세포에 대한 ~ 0​​.5 %로 대조적으로, ~ 2-4%입니다. 본 최저 효율은 지금까지 암 세포의 게놈 DNA에 대한했습니다. 모든 농축 DNA는 표준 차세대 도서관 준비 프로토콜 준비가되었습니다. 또한 캡처 한 DNA는 또한 관련 프리 머를 사용할 경우 입력 DNA에 비해 몇 조각의 강화를 감지하는 실시간 PCR을위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다.

그림 1
1 그림. 에 Sonicated 인간 게놈의 DNA 조각1퍼센트 아가로 오스 겔. 1X TE 버퍼 120 μl 인간의 IPS 세포로부터 격리 게놈 DNA의 10 μg은 sonication 장치 (Covaris)를 사용하여 sonicated되었습니다. sonication 후, sonicated DNA의 2 μl은 sonicated DNA 조각의 크기를 비교하는 DNA 마커의 100 BP를 사용하여 1퍼센트 아가로 오스 겔에로드했습니다.

구성 요소 음량 최종 농도
_ μl
10 X β-GT 반응 버퍼 2 μl 1 X
최대 10 μg의 게놈의 DNA에 _ μl 최대 500 μl / NG
UDP-6-N 3-Glc (3 ㎜) 0.67 μl 100 μM
β-GT (40 μM) 1 μl 2 μM
총 볼륨 20 μl

조직 게놈의 DNA (높은 5 HMC 내용> 0.1 %)의 경우 I)

구성 요소 음량 최종 농도
_ μl
10 X β-GT 반응 버퍼 10 μl 1 X
20 μg의 게놈의 DNA에 _ μl 최대 500 μl / NG
UDP-6-N3-Glc (3 ㎜) 1.33 μl 100 μM
β-GT (40 μM) 2 μl 2 μM
총 볼륨 40 μl

II) 줄기 세포 게놈의 DNA (평균 5 HMC 내용 ~ 0.05 %)의 경우

구성 요소 음량 최종 농도
_ μl
10 X β-GT 반응 버퍼 10 μl 1 X
최대 50 μg의 게놈의 DNA에 _ μl 최대 500 μl / NG
UDP-6-N3-Glc (3 ㎜) 3.33 μl 100 μM
β-GT (40 μM) 5 μl 2 μM
총 볼륨 100 μl

III) 암 세포 게놈의 DNA (낮은 5 HMC 내용 ~ 0.01 % 용)

표 1. 입력 DNA와 선택 화학 라벨 방식에 의한 다양한 5 HMC 수준으로 샘플을 사용하여 라벨 반응 금액의 예.

견본 5 HMC 수준 시작 DNA (μg) 라벨 후 복구 (구슬로 입력) (μg) 복구 수율 풀다운 DNA (NG) 풀다운 얻을 수
성인 마우스 소뇌 0.4 % 10 7.5 75% 236 3.1 %
출생 후의 일 7 마우스 소뇌 0.1 % 11 9 82% 140 1.6 %
마우스 ES 세포 E14 0.05 % 60 42 70% 350 0.8 %

표 2. 마우스 뇌 조직 및 ES 세포의 대표 결과입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)는 특정 포유류의 세포 유형에서 상당한 양의 최근 확인 epigenetic 수정 존재입니다. 여기에 제시된 방법은 5 HMC의 게놈 전체의 분포를 결정하기위한 것입니다. 우리는 5 HMC의 수산기 그룹에 azide 그룹을 포함하는 엔지니어링 포도당 잔기를 전송하는 β-glucosyltransferase T4 박테리오파지를 사용합니다. azide 그룹은 화학적으로 포유류의 genomes에 5 HMC 함유 DNA 조각의 감지, 연관성 강화, 그리고 배열 ​​비오틴을 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 hMeDIP은 간단하지만, 그 고밀도 5 HMC 지역에 대한 강한 편견을 가지고 있으며 일반적으로 독립 풀에서 일관 결과를 제공, 5 HMC 항체 기반 hydroxymethylated DNA의 immunoprecipitation (hMeDIP-Seq) 13-15 이상의 장점이 있습니다 다운. 우리의 방법은 편견을 소개 할 것입니다.

가 우리 레이블의 관점에서 두 가지 문제는, 그러나,하고 저를 캡처thod. 첫 번째 문제는 라벨과 캡처의 특이성이 될 수 있습니다. 최근 보고서는 5 hydroxymethyluracil (5 hmU)는 또한 β-GT의 기판으로 사용할 수 있다고 표시하기 때문에, 허위 - 긍정적 인 신호는 5 HMC-relatedness 16 특이 현상 아르 강화 조각으로 이어지는 도입 될 수 있습니다. 높은 활성 5 hydroxymethyluracil-DNA의 glycosylases은 지속적으로 포유류의 게놈 17,18에 본질적으로 감지 5 hmU의 결과로이 DNA 손상을 제거하는 때문에이 문제는하지만 근거가 될 수 있습니다. 두 번째 문제는 라벨의 효율성과 캡처 수 있습니다. 5 HMC 수준은 뇌 조직의 0.5 %에서 MES 세포의 0.05 %와 암 세포의 0.01 %에 이르기까지, 다양한 조직과 세포에 크게 다르므로, 우리의 방법은 하류의 관점에서 모든 조직에 적용되는 것이 중요합니다 라벨 및 캡처 게놈 DNA의 응용 프로그램입니다. 우리의 경험은 여기에 설명 된 방법은 실제로 민감하고 구체적인 것을 보여줍니다충분한 조직들 또는 깊은 게놈 19-21에서 5 HMC의 분포를 매핑하는 순서와 같은 다운 스트림 응용 프로그램을위한 5 HMC 수준 중 하나 정량화 기반의 비교의 목적이 모든 조직을 분석 할 수 있습니다.

우리의 방법의 핵심은 게놈 DNA를 시작하는 적절한 양의 사용이다. 게놈 DNA 농도가 너무 낮은 경우, 라벨 효율과 특이성 그에 따라 줄어 듭니다. 농도가 25 20 반응 μl, 라벨링 및 캡처 효율성뿐만 아니라 특이성에 μl / NG,보다 낮을 경우 5 HMC의 풍부한이 뇌 조직에서 DNA에 충분한 높은하더라도, 우리의 경험을 바탕으로 크게 감소 될 것입니다. 낮은 풍부한 DNA 샘플의 경우 농도 요구 사항에 추가하여, DNA의 총 금액은 높고 특정 캡처 효율을 얻을 것이 중요합니다. 따라서, 비록 하나는 하류 세인트​​을위한 5 HMC 강화 DNA 조각의 25 NG가 필요합니다차세대 시퀀싱 플랫폼에서 사용 andard 라이브러리 생성 프로토콜은 뇌 조직에서 게놈 DNA의 시작 금액은 2 μg (그리고 이상적인 금액 5-10 μg입니다) 이상이어야한다. 시행 착오를 통해, 우리는 표 2에 설명 된 것처럼, 높은 라벨링 효율과 특이성를 얻을 변수 5 HMC의 abundances과 다른 조직에서 게놈 DNA의 시작 양을 최적화했습니다.

요약하면, 우리의 방법은 정확하게 게놈 5 HMC 레이블을 할 자격이 있으며, 특히 그 하류 차세대 시퀀싱의 assays에 대한 민감도와 특이성의 관점에서 성공적으로 프로토콜을 만드는 5 HMC 함유 조각을 캡처합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

이 연구는 국립 보건원 (CH와 NS051630/MH076090/MH078972에 PJ에 GM071440)에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
5M Sodium chloride (NaCl) Promega V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5 Invitrogen 15567-027)
HEPES 1M, pH7.4 Invitrogen 15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M Ambion AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate Click Chemistry Tools A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure Invitrogen 15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen 28304
Micro Bio-Spin 6 Column Bio-Rad 732-6222
Dynabeads MyOne Invitrogen 650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
UDP-6-N3-glucose Active Motif 55013
Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT) New England Biolab M0357
Equipment
Sonication device Covaris
Desktop centrifuge
Water bath Fisher Scientific
Gel running apparatus Bio-Rad
NanoDrop1000 Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker Barnstead
Labquake Tube Shaker Thermolyne
Magnetic Separation Stand Promega Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. Suppl 33. 245-254 (2003).
  2. Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
  3. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  6. Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
  7. Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
  8. Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
  9. Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
  10. Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
  11. Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
  12. Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
  13. Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
  14. Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
  15. Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
  16. Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. (2012).
  17. Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
  18. Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
  19. Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
  20. Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
  21. Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats