ゲノムDNAから5 - ヒドロキシの選択的捕獲

Published 10/05/2012
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Biology

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Summary

説明は簡単で、密度に依存しない濃縮のためのビオチンリンカーを転送するために、クリックケミストリー、続いて5-HMCにアジド-グルコースを転送するために、β-グルコシルトランスフェラーゼ(β-GT)を用いた二段階ラベリングプロセスである。この効率的で特異的標識法は、次世代シーケンシングを介して非常に低いバックグラウンドと高いスループットepigenomicマッピングで5-HMCの濃縮を可能にします。

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Li, Y., Song, C. X., He, C., Jin, P. Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. (68), e4441, doi:10.3791/4441 (2012).

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Abstract

5 - メチルシトシン(5-MC)は、ヒトのゲノムDNAの総シトシン〜2から8パーセントを構成しており、遺伝子発現、ゲノムの完全性の維持、親の刷り込み、X染色体不活性化の調節を含む生物学的機能の広い範囲に影響を与え発達、老化、癌1。最近では、酸化された5-MC、5 -ヒドロキシメチル(5 - HMC)の存在は、胚性幹(ES)細胞および神経細胞2-4の、特に哺乳動物細胞内で発見されました。 5-HMCは、TETファミリー鉄(II)/α-ケトグルタル酸依存オキシゲナーゼ2、3、5-MC触媒作用の酸化によって生成されます。 5-HMCは胚性幹(MES)細胞、正常な造血及び悪性腫瘍、および受精卵開発2、5月10日の維持に関与することが提案されている。良い5-HMCの機能を理解するために、信頼性が高く、簡単なシーケンシングシステムが不可欠です。従来のバイサルファイトシークエンシングは5-MC 11から5-HMCを区別することはできません12グルコース部分を追加したバクテリオファージ酵素を利用して、ラベルと5-HMCをキャプチャするための非常に効率的かつ選択的な化学的なアプローチを開発しました。

ここでは5-HMCの選択的化学標識するための簡単​​な2ステップの手順を説明します。第一の標識のステップでは、ゲノムDNA中の5 - HMCは、5 - HMCに6 - アジド-グルコースを転送する方法では、β-GTは、バクテリオファージT4からグルコシルトランスフェラーゼによる6 - アジド-グルコースで触媒で標識されている修正された補因子は、UDP-6-N3-GLC(6 N3UDPG)。第二段階、ビオチン化では、ジスルフィドビオチンリンカーをクリックケミストリーによりアジド基に装着されている。両方の手順は、ゲノム領域における5-HMCの豊富さに関わらず、ラベリングと非常に低いバックグラウンドを与えて完成につながる、非常に特異的かつ効率的である。 5-HMCのビオチン化に続いて、5-HMCを含むDNA断片を選択的に捕獲される密度に依存しない方法でストレプトアビジンビーズを使用。得られた5-HMC-濃縮したDNA断片を、次世代シーケンシングを含む下流の分析、を使用することができる。

私たちの選択的標識とキャプチャプロトコルは、変数/多様な5-HMCの存在量を用いたゲノムDNAの任意のソースに適用し、高感度を与える。このプロトコルの主な目的は、その下流のアプリケーション( すなわち 。、次世代シーケンシングは、ゲノム中の5-HMC分布をマップアウトする)ですが、それは単一分子であり、リアルタイムSMRT(DNA)の配列決定、と互換性があります5-HMCの単一塩基解像度のシーケンシングを提供することができる。

Protocol

1。ゲノムDNAの断片化

ゲノムワイドなシーケンシングプラットフォームに適した所望のサイズ範囲に超音波処理を用いてゲノムDNA断片。 (私達は通常〜300 bpまで超音波処理。)を1%アガロースゲル( 図1)上の断片化したゲノムDNAのサイズ分布を確認します。

2。 DNAの調製

ゲノムDNA中の5-HMCの豊富に基づく出発DNAの量を決定します。 5-HMCのレベルが異なる組織型においても大きく変動するので、出発DNA量は、試料の5-HMCのレベルによって異なります。例については、 表1を参照してください。

3。 β-GTの触媒反応(グルコース転移反応)

  1. 1時間37℃の水浴中で表2の詳細かつインキュベートした混合物をピペッティング。
  2. インキュベーション後、当たり10μgのDNAを用いて、QIAクイックヌクレオチド除去キットを使用した反応をクリーンアップコラム。列あたり30μlの水で溶出し、組み合わせる。

4。ビオチン化反応(化学は、ここをクリックします)

  1. 150μMの( すなわち 、30μlのDNA溶液当たりの作業溶液5μl)の最終濃度に溶出したDNA溶液中のDBCO-SS-PEG3 -ビオチンコンジュゲートワーキング溶液(1mM)を(ステップ3から)を追加します。
  2. 2時間37℃の水浴中でピペッティングとインキュベートしてミックス。
  3. QIAクイックヌクレオチド除去キットとの反応をクリーンアップします。理想的な総溶出量は100μlです。
  4. マイクロスケール分光光度計( 例えば 。、光度計)を用いて回収したDNA量を定量化する。

5。 5-HMC-含むDNAの捕捉

  1. 製造元の指示に従って、1XのB&W緩衝液1mlでのDynabeadsストレプトMyOne C1の50μlを3回洗浄する。マグネチックスタンドでビーズを分離。
  2. 回収されたビオチン化Dに2X B&Wの等量のバッファーを追加洗浄したビーズに、NA(100 UL)。
  3. ローテーターで穏やかに回転しながら室温で15分間インキュベートする。
  4. マグネチックスタンドでビーズを分離し、1X B&W緩衝液1mlでビーズを3回洗浄する。
  5. ローテーターで穏やかに回転しながら室温で2時間、新たに調製し、50mMのDTTを100μlのビーズをインキュベートすることによってDNAを溶出する。
  6. マグネチックスタンドでビーズを分離。 DTTを除去するために、製造指示に従ってマイクロバイオスピンカラムに溶離液6と負荷を吸引します。標的DNAは現在のソリューションである。
  7. のEB緩衝液10μl中にキアゲンMinElute PCR精製キット、溶出DNAによる前工程から溶出したDNAを精製する。濃度が20 ngの/ ULより高ければ量子ビット蛍光光度、または光度計を用いてDNAを定量化する。 DNAは下流のゲノムワイドなシーケンシングライブラリの準備のための準備ができています。

6。代表的な結果

品質O IFfのゲノムDNAが高く、β-GTとビオチン化反応後の典型的な回収率は約60から70パーセントである。しかし、捕獲効率は試料の5-HMCのレベルに応じてさまざまな種類の組織と大きく異なります。一般的に、脳のゲノムDNAの捕捉効率は約4から9パーセントであり、いくつかの極端な場合には、効率が12%にまで達する可能性があります。 ES細胞については、平均捕集効率は、神経幹細胞のための〜0.5%とは対照的に、〜2-4%である。これまで見て最も低い効率は、がん細胞からのゲノムDNAのためだった。すべての濃縮されたDNAは、標準の次世代ライブラリ調製のプロトコルのための準備ができています。関連のプライマーが使用可能な場合だけでなく、捕獲されたDNAはまた、インプットDNAと比較して、いくつかの断片の濃縮を検出するリアルタイムPCR用テンプレートとして使用することができます。

図1
図1。中で超音波処理したヒトゲノムDNA断片1%アガロースゲル。1X TE緩衝液120μlのヒトiPS細胞から単離したゲノムDNA10μgを超音波処理装置(Covaris)を使用して超音波処理した。超音波処理後、超音波処理したDNAの2μlを超音波処理したDNA断片の大きさを比較するためのDNAマーカーの100 bpを使用して1%アガロースゲルにロードした。

コンポーネント ボリューム 最終濃度
_μL
10 Xのβ-GTの反応バッファー 2μlの 1つのX
最大10μgのゲノムDNAへ _μL 最大500 ng /μlに
UDP-6-N 3 - GLC(3mM)を 0.67μlの 100μMの
β-GT(40μM) 1μlの 2μM
全体積 20μlの

組織のゲノムDNA(高5-HMCコンテンツ> 0.1%)のi)

コンポーネント ボリューム 最終濃度
_μL
10 Xのβ-GTの反応バッファー 10μlの 1つのX
最大20μgのゲノムDNAへ _μL 最大500 ng /μlに
UDP-6-N3-GLC(3mM)を μlの1.33 100μMの
β-GT(40μM) 2μlの 2μM
全体積 40μlの

ⅱ)幹細胞のゲノムDNA(中央値5-HMCコンテンツ〜0.05%)の場合

コンポーネントボリューム最終濃度
_μL
10 Xのβ-GTの反応バッファー 10μlの 1つのX
最大50μgのゲノムDNAへ _μL 最大500 ng /μlに
UDP-6-N3-GLC(3mM)を 3.33μlの 100μMの
β-GT(40μM) 5μlの 2μM
全体積 100μlの

iii)癌細胞のゲノムDNA(低5-HMCコンテンツ〜0.01%)の場合

表1:インプットDNA選択的化学標識法による種々の5-HMCレベルで試料を用いてラベリング反応の量の例。

サンプル 5-HMCレベル 出発DNA(μg)を 標識後リカバリ(ビーズへの入力)(μg)を 回収率 プルダウンDNA(NG) プルダウン得
成体マウス小脳 0.4パーセント 10 7.5 75パーセント 236 3.1パーセント
生後7日目のマウスの小脳 0.1パーセント 11 9 82パーセント 140 1.6パーセント
マウスES細胞はE14 0.05パーセント 60 42 70パーセント 350 0.8パーセント

表2。マウス脳組織およびES細胞からの代表的な結果。

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Discussion

5 - ヒドロキシメチル(5 - HMC)は、特定の哺乳類の細胞型における実質的な量で最近同定されたエピジェネティックな修飾の存在しています。ここで紹介する方法は、5 - HMCのゲノムワイドな分布を決定するためのものです。我々は5-HMCのヒドロキシル基にアジド基を含有する人工グルコース部分を転送するために、β-グルコシルT4バクテリオファージを使用しています。アジド基を化学的に哺乳類のゲノムの5-HMCを含むDNA断片の検出、親和性濃縮、シーケンシングのためのビオチンで修飾することができる。このプロトコルはhMeDIPは単純ですが、それは高密度の5-HMC領域に対する強い偏見を持っており、通常は独立したプルダウンメニューから矛盾した結果が得られますが、5-HMC抗体ベースのヒドロキシメチル化DNAの免疫沈降(hMeDIP-seq)が13から15以上の利点がありますダウン。我々の手法は、このようなバイアスを導入しないだろう。

そこに私たちのラベリングに関して2つの可能性の懸念は、しかし、で、私をキャプチャするthod。最初の懸念は、ラベリングとキャプチャの特異性である可能性があります。最近のレポートは、5 hydroxymethyluracil(5-HMU)はまた、β-GTの基質として役立つことができることが示されているので、偽陽性シグナルは5-HMC-16血縁に非特異的で濃縮された断片につながる、紹介されるかもしれません。この懸念は、しかし、非常にアクティブな5-hydroxymethyluracil-DNAグリコシラーゼ以来絶えず哺乳類ゲノム17,18において本質的に検出不能な5-HMUで、その結果、このDNA損傷を根拠のない削除している可能性があります。第2の問題は、標識及び捕獲の効率である。 5-HMCレベルは脳組織の0.5%からMES細胞で0.05%と、がん細胞では0.01%の範囲で、さまざまな組織や細胞で著しく変化するので、それは我々の方法は、下流の観点から、これらのすべての組織に適用可能であることが不可欠である標識し、キャプチャされたゲノムDNAのアプリケーション。我々の経験は、ここで説明する方法は確かに高感度かつ特異的であることを示している十分な組織間またはそのような深いゲノム19から21に5-HMCの分布をマッピングするためにシーケンシングなどの下流アプリケーションのための5-HMCレベルの定量ベースの比較どちらの目的のためにすべてのこれらの組織を分析する。

我々の手法の鍵は、ゲノムDNAの開始の適切な量を使用することである。ゲノムDNAの濃度が低すぎる場合は、標識効率と特異性は、それに応じて減少します。濃度が25 20μlの反応、標識および捕捉効率、ならびに特異性のng /μLの、より低ければ5-HMCの存在量は、脳組織からのDNAで十分な高さにもかかわらず、我々の経験に基づいて、大幅に削減されます。低濃度のDNAサンプルについては、濃度の要件に加えて、DNAの総量は高く、特異的捕捉効率を得ることが不可欠である。したがって、1が下流stのための5-HMC-濃縮DNA断片のわずか25 ngの必要があるが次世代シーケンシングプラットフォームで採用andardライブラリ生成プロトコルは、脳組織からのゲノムDNAの開始量は2μ​​g(との理想的な出発量は5〜10μgのです)を下回ってはいけません。試行錯誤の末、我々は、 表2に詳述するように、高い標識効率と特異性を得るために変数5-HMCの存在量と様々な組織からのゲノムDNAの開始量を最適化している。

要約すると、我々の手法は、それ下流次世代シーケンシングアッセイの感度、特異性の点でうまくいっているプロトコル作り、正確にゲノムの5-HMCにラベルを付け、具体的には5-HMC-含有フラグメントを捕捉するために修飾されています。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgements

この研究は、米国国立衛生研究所(CHとNS051630/MH076090/MH078972にPJにGM071440)によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
5M Sodium chloride (NaCl) Promega V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5 Invitrogen 15567-027)
HEPES 1M, pH7.4 Invitrogen 15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M Ambion AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate Click Chemistry Tools A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure Invitrogen 15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen 28304
Micro Bio-Spin 6 Column Bio-Rad 732-6222
Dynabeads MyOne Invitrogen 650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
UDP-6-N3-glucose Active Motif 55013
Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT) New England Biolab M0357
Equipment
Sonication device Covaris
Desktop centrifuge
Water bath Fisher Scientific
Gel running apparatus Bio-Rad
NanoDrop1000 Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker Barnstead
Labquake Tube Shaker Thermolyne
Magnetic Separation Stand Promega Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).

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