海马胰岛素显微注射和

Neuroscience

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Summary

调制的hippocampally依赖空间工作记忆直接海马显微注射,其次是

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McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

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Abstract

葡萄糖代谢是一个有用的标记为本地的神经活动,如2 - 脱氧葡萄糖和功能磁共振成像的方法形成的基础。然而,使用这样的方法在动物模型中需要麻醉,因此既改变了大脑状态并防止行为的措施。另一种方法是利用体内微透析,采取连续测量脑细胞外液浓度的葡萄糖,乳酸和相关的代谢物清醒,奔放的动物。这种技术是与任务相结合,依赖于特定的大脑区域和/或急性药理操作时特别有用,例如在空间工作记忆任务中(自发的交替)的测量表明,海马浸在细胞外葡萄糖和乳酸上升,暗示增强糖酵解1,2和海马胰岛素给药,提高记忆力和增加海马乙二醇ysis 3。 (如胰岛素)的物质,可以通过相同的微透析探针用于测量代谢物传递到海马。作为衡量的海马功能的自发交替使用,目的是为了避免任何混淆紧张的激励( 例如电击),约束,或奖励( 食品),所有这一切都可以改变任务的性能和代谢的任务也提供了一个衡量非特异性治疗的效果,可以控制电机的活动。 ,这些方法可直接测量的神经化学和代谢调节行为的变量。

Protocol

1。术前准备

  1. 处理。动物(最常用的是,大鼠或小鼠,虽然主要是使用任何所需的特定物种适应需要一般1微透析的方法,和组合与行为测试, 例如用于麻醉)至少为10分钟/天的最小处理手术的前两天。广泛的处理已被证明在测试的时候,让动物在无应力状态,以避免可能的混淆2,4,5。我们将用大鼠在本协议作为一个例子物种。处理必须做到无应力引起的拉毛皮, 例如从乳胶手套或丁腈手套:这可以最好的实现用裸露的双手,在设施的兽医和雇员的卫生官员的协商。如果这是不可能的,柔软的棉手套应戴过垒手套,以避免拉扯对老鼠的皮毛。
  2. 无菌现场准备工作。之前开始手术,surgic的的制备人区域,周围的立体定位的装置和对整个装置下无菌被单制备无菌字段,覆盖的加热垫,用来维持大鼠体温。提供准确的恒温器的循环温水垫使用的动物,以防止过热。
  3. 麻醉诱导。异氟醚蒸发器检查包含异氟醚的最佳水平,并连接到感应室。连接进行检查,以确认一个闭环。空气处理真空系统进行检查,操作。异氟醚汽化接通和动物放入感应室使用5%的异氟醚的氧组合:即加入5%异氟烷成100%的氧气流,并传送到感应室。
  4. 放置到设备。动物固定在立体定位仪使用earbars和齿杆。的正确earbar下配售结果在一个不动的头和平整的沿着earbars的耳朵。动物正在迅速固定和鼻子插入一个专门设计的麻醉鼻锥;交付汽化的异氟醚是从感应室切换的nosecone和调整,以提供2-3%的异氟烷​​入氧气流去的nosecone麻醉组合。
  5. 麻醉确认。一种外科手术的麻醉平面证实了将硬捏脚和一团空气的眼睛,也不应该造成任何回应。在整个手术大约每隔15分钟重复这些测试,以确认维修的外科麻醉平面。头发从之前的切口部位进入无菌区。

2。手术

  1. 动物初始治疗。眼软膏被施加到每个眼球,以防止干燥。 1毫升无菌生理盐水给出SC,以防止在手术过程中的任何脱水,并用无菌的悬垂体覆盖。聚维酮碘涂在头皮上,并从中心擦洗出,用棉签,70%乙醇擦洗同样,和两个拭子步骤重复两次以上,以确保适当的切口部位。聚乙烯吡咯酮碘和酒精的皮肤接触的时间应该是至少3分钟前切口。维持麻醉,并定期检查整个手术;卡布洛芬5克/公斤)的一个单一的皮下注射给发起的镇痛作用,并使用无菌技术。镇痛麻醉诱导后,以尽量减少任何压力注射。
  2. 切口和颅骨准备。 A 3-4厘米处剪下了得sagitally中心的头骨。 1:1组合的布比卡因肾上腺素局部应用提供进一步的镇痛,减少出血。头皮是从切口处采用手术的剪辑和无菌棉签是用来清除覆盖膜,从头骨。用于钻井的坐标测量使用囟作为一个参考点,标志着使用无菌的钻头(或,可替换地,一个手持烧灼德维CE),并重新确认的准确性钻前开始。使用脑图谱确定为特定的大脑区域的利益( 海马)的坐标。海马微透析,我们使用了演练现场5.6毫米后的前囟门,+5.0横向,和3.0腹侧硬膜。
  3. 钻井。通过颅骨钻三个孔,关心的问题是只适用于很小的力,创伤硬脑膜及相关膜是很少或没有。在测量现场的套管插入一个孔,另外两个被定位为方便插入颅骨螺钉。目的尺寸的螺钉( 例如 1.17毫米自攻螺钉;精细科学工具)插入这些孔而不影响下面大脑,并使用作为随后的牙科用粘固剂应用程序的锚点。
  4. 套管的位置和关闭。被定位在所述套管插入坐标,这是重新确认的部位的孔钻出,然后慢慢地降低到目标深度。一旦正确地定位,套管代替用牙科用粘固剂固定。如果需要,一个单一的无菌手术用缝合线用于闭合伤口。钢丝插入的导管保持通畅。在这个协议中,我们使用一个CMA12(CMA /微透析)探针和导管的。
  5. 急性手术后的护理。 3毫升无菌生理盐水SC继续水化,一个单一的皮下注射卡洛芬5克/公斤)也启动镇痛。动物从设备中删除,并放置在加热恢复室,在一个干净的笼子里,和监控,直到它们完全从麻醉中恢复。评估完全恢复恢复翻正反射和正常的运动。动物,然后返回自己的家乡笼,并定期举行房间。
  6. 短期后续治疗。动过手术的动物的笼子都标有日期的手术。动物每天至少监测一次,至少THREE天手术后,以下两个天手术后,每一个卡洛芬咀嚼​​片(2毫克)的日子。如果动物不消耗卡洛芬,可注射的卡洛芬可能被以确保有足够的镇痛作用。监控的整体健康的动物和国家机构动物护理指导原则和寻求援助或从动物保健工作人员或兽医的意见,如果需要的话,伤口部位的感染,红肿等。更重要的是,要注意适当的处理和驯化的实验者是必不可少的:动物应该处理广泛,包括操作的套管,直到没有任何迹象仍然是当被实验者处理时的紧张或压力。
  7. 随后的动物护理和治疗。根据批准的协议,以及各自具体的实验组,的动物将按照适当的测试和安乐死程序。

3。微透析(MD)

  1. Perfus吃的准备。人工细胞外液(AECF)153.5毫米的Na,K,4.3毫米0.41 mM的镁,钙0.71毫米,139.4毫米氯,葡萄糖1.25毫米,在pH值7.4 6缓冲。 注意 ,准确的流体成分是必不可少的:不准确或使用,生理体液,如林格氏液微透析PBS将导致明显错误的结果6。要特别注意,离子组成的细胞外液(ECF)是不一样的CSF,我们发现在2004年的详细研究海马ECF 6。在一天的测试,牛血清白蛋白(BSA)应在2%重量/重量加入,并完全溶解,这减少了损失的肽,如胰岛素从遵守油管,并且也降低了风险的流体损失(超滤)在探头的膜。准备完毕后,灌流液应通过一个0.2微米的过滤器过滤。
  2. 如果是被传递到胸罩如胰岛素治疗在感兴趣的区域(这里的海马),准备使用的等分试样的制备AECF这种治疗与适当的药物浓度。胰岛素的浓度为400 nM(66.7μU个/μl)已被证明影响通过反向微透析交付海马代谢和认知功能7。请注意,将所得的组织浓度胰岛素不测量这里仍然不明。
  3. 设置MD探头和线。准备一个新鲜的微透析探针和线测试的前一天。创建两条线“流入”和“流出”。使用PE50管材连接两个1米长的的FEP管件,并确保有最小的死线之间的空间。连接的流入管连接到一个1毫升的Hamilton注射器充满无菌过滤,用去离子水(dH的2 0 2 0),然后将附加到探针。
  4. 微透析旋转。为了让免费动物的运动进行测量时,连接液体旋转的inflow和流出线,关闭泵,使用额外的FEP管。记得要考虑这个旋转和管内部容积在考虑采样时间(见下文)。
  5. MD泵。打开MD泵和1.5μl/ min的运行,直到您看到DH 2 0退出流出管探头上。然后,当泵关闭时,流出管和一个样品收集管之间的连接的其他行。运行5毫升,通过该管,并把探头于小瓶中含有无菌蒸馏水2 0过夜;确保探针针尖始终保持湿润。
  6. 预探测测试对象。在测试前24小时,从大鼠的头移除虚设钢丝,并插入一个:毫达西探针(仅用于此目的,而不是为采样)10分钟。然后替换虚拟钢丝和到它的笼子里,把老鼠。此过程是为了尽量减少任何影响胶质细胞增生测试8日,在我们的手中,这提供了良好的resulTS其他技术相匹配的数据,似乎反映了海马激活2,5,7,9;他人已经使用了类似的方法,离开探头在24小时之前测量,这也是一个很好的方法,如果损坏可避免探针过夜。
  7. 探头平衡。在当天的微透析技术,填补了汉密尔顿注射器和过滤AECF闪烁小瓶和泵通过平衡1小时。如果需要的话,填充第二个Hamilton注射器与制备的治疗(例如,胰岛素AECF)和放入注射器泵。
  8. 探针插入。平衡是完成时,删除虚拟钢丝和通过导管轻轻插入的平衡MD探测到老鼠的大脑中。将大鼠成一个透明的塑料盒,其中包含一些老鼠的家居床上用品。 ,以抗衡确保管:连接一个1.6毫升的离心管中装满水的管笼子外面在这样一种方式,重力保持microdi“辩线unkinked,但不紧。让探针平衡2小时大鼠。在这一时期开始,确认,灌流液的流动是畅通的,这是最容易做到在规定的时间内,通过收集灌流液流出,称量样品,以确认预期的体积退出系统。任何产量预期量的90%,和不正确的拆卸和重新插入后,应更换探头(否则在探针水肿会导致)。如果流量持续低或没有,检查各连接处的渗漏,做不到这一点,断开管道的阶段,看是否可以隔离堵塞。如果没有发现问题,更换探头,如果这个问题不解决的话,可能需要重新开始新的探头和线第3.3节。在两小时的平衡期后允许探头周围的重新密封,避免探针插入的急性影响任何的血 - 脑屏障。
  9. 采集样本。确保合作diesel。关联关系的样品透析(大脑)和收集(管),精确计算。比如,使用2米转体和探头之间的FEP管,有30微升的总体积之间的探头和收集,因此它需要20分钟,在1.5微升/分钟的流速样本通过探头,油管,连接器和旋转的管道收集到了最后。收集样品时确保你收集到足够的量有您的分析所必需的浓度。在这里,我们将使用5分钟取样桶,从而在每个收集管收集的透析液7.5μL。
  10. 基线样本。一旦平衡后,开始收集样品。收集至少三个样品,而大鼠家庭室中处于静止状态时,建立了稳定的基线测量
  11. 治疗时机。小心计算所需的时间开始治疗之前的实验:请记住,只是有一个时间滞后之间的透析和样品收集,离开注射器和到达动物的海马的灌流液之间有一个滞后(通常是相同​​的)。因此,在我们30μl的注射器和探头之间的音量设置,改变注射器含治疗灌流前20分钟你想治疗开始到达的海马。
  12. 改变注射器。如果需要的话,可以使用一种液体开关,但不是必需的:在适当的时间,只需断开控制灌流液的注射器的流入线路从和快速连接到治疗灌流液的注射器。这应该不超过5秒,以避免重大中断的灌注流量。 注意 ,此过程所需剂量已交付后,如果提供治疗所需的时间有限,应予以冲回。可选地,处理可以继续采样的持续时间(参见图2)。不应引入进线切换时的气泡注射器,因为它们可能会积聚在透析膜和降低探头效率。
  13. 行为测试。如果执行行为的任务,按照该程序(见下文第4节)。 注意协调提供治疗的海马是很重要的。例如,胰岛素交付时间应发生前10分钟开始测试10。因此,含胰岛素灌注的开关应该发生的行为测试前30分钟(20分钟灌流通过线加上10分钟的测试所需的交付时间提前)。
  14. 完成样品采集。收集所需的样品后,轻轻取出,将探针从动物的头,再次记住透析和样品采集到之间的时间间隔。动物的饲养笼,并密切观察任何实验后的健康或行为的变化,直到动物被杀害,并且在大脑中删除,确认无误探头的位置。如果牺牲不会立即发生,返回假心针的套管,以避免任何引进外资的材料。
  15. 分析。的分析的方法会有所不同,取决于感兴趣的分析物(s)的。由于透析取样不允许进行完整的分析在探头膜的平衡,样品浓度应予以纠正利用零净通量法11,12给ECF浓度的。

4。行为测试

  1. 放置在迷宫中。在基线样本( 至少三个样本后,已经完成了透析,但仍可能在的流出管收集),轻轻移动老鼠到行为测试设备。可以使用任何合适的任务,在图1中的数据,收集使用的四臂加形的迷宫和测量自发交替,它是衡量空间工作记忆:大鼠最初放置在中心,后的迷宫,并允许自由探索9,13。由于可以使用任何行为测试,此协议的焦点是不作为这里的一个例子(其他部分详述9,14,15),但简单的具体任务,动物被允许探索迷宫(期间最近被浏览的灰色方块图1),使用hippocampally依赖过程保留这些武器的内存。
  2. 透析管在测试过程中的运动。握住管子,使得它可自由移动,既不影响大鼠的运动也被允许在前面的动物移动和分散。留在原地,并尽量减少自己的动作,这样你就不会影响老鼠的行为。
  3. 续样品的采集。在基线期间,流出管移动到新的收集管中,每5分钟。
  4. 交替测试。让动物自由地探索迷宫20分钟。记录的顺序和时间的手臂条目,或者使用视频记录或由专人为以后的工作性能分析9,15。

5。测试后

  1. 最后的样本集合。以下测试,取出老鼠轻轻地从迷宫和返回控制腔。继续收集微透析样品至少有四个样本,涵盖的时间执行任务的复苏。
  2. 探针清除。所有样品已收集后,轻轻地取下探头从动物的头部和地点到存储瓶,返回它的首页笼的动物。
  3. 探针存储。回国后,动物的饲养笼和完成任何剩余透析液的收集,彻底清洗电极,用dH 2 0和存储在闪烁瓶用dH 2 0填充和封口膜覆盖。冲洗管,通过切换到一个注射器中含有的溶液为1:10,000的Kathon dH的2 0,以防止微生物的生长。探头可以重新使用,只要它们保持良好的流动性,并具有无损伤膜护理这应定期在超过10用途。
  4. 组织学研究。杀死的动物和消除大脑。片上低温恒温器,并使用标准的组织学技术( 甲酚紫染色),以确认正确的探头的位置。

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Representative Results

大鼠应迅速从手术中恢复,并提高警觉,麻醉停止后30分钟内能动的和积极的。插管帽应该是最小的影响,如果在手术进行清洁和最小的牙科用粘固剂使用。手术后的监测过程中发现任何感染迹象,或以任何方式的痛苦或不适的迹象,立即终止实验的老鼠,这应该是极为罕见的。在处理测试前,动物应警惕,可以自由活动的,友好和好奇的。基本上应该有良好的处理的动物从手术,手术后的恢复,或存在的实验者剩余没有可观察到的应力,这可以确认如果需要的话通过测量血浆应激激素(肾上腺素,糖皮质激素类)和/或葡萄糖2,4 ,5。

脑ECF葡萄糖的通常是在范围0.5 - 1.5毫摩尔,由大脑区域变化,虽然更高的值可以看出,在糖尿病动物海马,基线血糖浓度为1.25 mm的紧密排列6,12。一个在ECF葡萄糖畅游(,通常,增加在ECF乳酸),在没有任何外源性的治疗,应该可以看出,在执行任务的大脑区域的参与调解任务(例如, 见图1):这反映了增加代谢活动引起的认知负荷9,14,16。作为一个特定的治疗急性给药的胰岛素后,通过另外的灌流液7( 图2)的实例,如看到的局部代谢增加的证据表明,可以采取类似的变化。

在一般情况下,一个管理良好的动物进行行为测试,没有任何迹象的困扰,并没有任何迹象微透析管的意识过多的修饰,行动不便,痛苦的任何指示或由动物中取出探头时表示:标志可能不足,处理和/或感​​染探头周围的站点,并应采取的指示终止该实验。

接收胰岛素给药的动物,在除了海马新陈代谢升高,显示显着增强的空间存储器7。控制未经处理的动物应该有四臂迷宫的65至75%之间,7,9,14平均交替的性能。

图1
图1。任务的相关浸在海马的的ECF葡萄糖(改编自9)。灰色方块是自发交替(SA)的迷宫测试期间。紫色线显示海马葡萄糖在动物实验中没有的迷宫测试(但以其他方式处理相同)。红线是测量在四臂SA任务的动物表演,橙色线显示测量动物表演容易3-ARM版本的SA。

图2
图2。改装的海马葡萄糖和乳酸的胰岛素给药后通过灌流液中的夹杂物(改编自7)。胰岛素达到了海马箭头的点,此后连续给药。动物试验在自己的笼子里,没有行为的操作。

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Discussion

微透析中使用的所有的解决方案应该被过滤在即将使用前,使用一个0.2微米的过滤器。后插入导管的探讨,观察,以确认流的畅通和样品采集。如果流插入后停止,最可能的原因是在探头的膜护理不足所造成的插入损坏,也必须以一个新的探头。

如上所述,这些方法的主要优点是缺乏的混淆,允许在清醒,自由活动动物行为和神经化学的措施:利用测试之前,广泛的处理是必要的,以便重读在动物测量。平衡期一般是足以提供一个稳定的代谢基线,但食物可能被除去之前1-2小时测试,如果需要,以确保均匀的血糖水平横跨动物。

钍两个最显着局限性毫达西作为抽样技术为(i)分析物和(ii)潜在损失的分析物,由于附着在油管的限制大小。前者可在一定程度上缓解由毫达西探针与更大范围内的分子量截留值的使用。典型的商业探针允许多达截断到第100 kD的,使多达分子或许50 kD的将通过相对畅通的,但是,使用较低的截止膜建议在可能的情况下,以尽量减少在探头尖通过超滤任何样品损失。给油管的目标分子的粘附性是一个问题,主要是在肽的测量的情况下,其中许多将倾向于坚持FEP管,从而减少了分析物的回收和测量精度。此问题可以通过(i)预先处理的管子的内部用灌流液,2%牛血清白蛋白已经添加,作为封端剂,及(ii)通过返回管的长度最小化:最小化如果NEeded,一个轻量级的收集瓶中可以连接接近探头的流出,虽然这会造成额外的挑战,在收集管切换,而不会干扰的动物,特别是在行为测试。该技术的优点之一是,样品中得到的一种形式的细胞碎片或大的分子,如酶,而且一般都是通过注射到HPLC中适合直接分析,MS或其他分析机械而不需要进行进一步的纯化这还允许在许多情况下,在每个样品中的多种分析物的分析(如葡萄糖和乳酸测量, 如图2中所示)。

利用反向微透析提供药物治疗的一个变化是使用双显微注射微透析探针,可从几个来源。然而,孔的注射端口通常是非常狭窄,容易堵塞,并且它可以是难以精确地控制的定时和/或体积的治疗交付。本项选择,因此仅推荐用于治疗送货列入灌流液中是不适合的。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作得到了美国国立卫生研究院/ NIDDK(DK077106到ECM)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

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References

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