Hippocampus Insulin mikroinjeksjon og

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Modulering av hippocampally-avhengige romlig arbeidshukommelse ved direkte intrahippocampal mikroinjeksjon, ledsaget og fulgt av

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glukose metabolisme er en nyttig markør for lokal nerveaktivitet, danner grunnlaget for metoder for eksempel 2-deoxyglucose og funksjonell magnetisk resonans imaging. Imidlertid kan bruk av slike metoder i dyremodeller krever anestesi og dermed begge endrer hjernen staten og forhindrer atferdstiltak. En alternativ metode er bruk av in vivo mikrodialyse å ta kontinuerlig måling av hjernen ekstracellulær væske konsentrasjoner av glukose, laktat, og relaterte metabolitter i våken, uhemmet dyr. Denne teknikken er spesielt nyttig når den kombineres med oppgaver for å stole på bestemte områder av hjernen og / eller akutt farmakologisk manipulasjon, for eksempel hippocampus målinger i løpet av en romlig hukommelsen oppgave (spontan veksling) viser en dukkert i ekstracellulær glukose og økning i laktat som er kan tyde på økt glykolyse 1,2, og intrahippocampal insulin administrasjon både forbedrer hukommelsen og øker hippocampus glykolYsis 3. Stoffer som insulin kan leveres til hippocampus via samme mikrodialyse sonden som brukes for å måle metabolitter. Bruken av spontan alternering som mål på hippocampus funksjon er utformet for å unngå forvirre fra stressende Motivatorer (f.eks footshock), beherskelse, eller belønninger (f.eks mat), som alle kan endre både utførelsen av oppgaver og metabolisme; denne oppgaven gir også en måle av motorisk aktivitet som tillater kontroll for uspesifikke effekter av behandlingen. Sammen gir disse metodene tillater direkte måling av nevrokjemiske og metabolske variabler som regulerer atferd.

Protocol

1. Kirurgi Forberedelse

  1. Håndtering. Dyr (som oftest rotter eller mus, selv om metoden for mikrodialyse og kombinasjon med atferdsmessige testing er i stor grad en generell ett med noen nødvendige artsspesifikke tilpasninger som trengs, for eksempel for anestesi) håndteres i minst 10 min / dag i minst to dager før operasjonen. Omfattende håndtering har vist seg å la dyrene i en trykklett tilstand på tidspunktet for testing, unngå mulig forvirre 2,4,5. Vi vil bruke rotter gjennom denne protokollen som et eksempel arter. Håndtering må gjøres uten stress forårsaket av å trekke på pelsen fra f.eks latex eller nitrilhansker: Dette kan best oppnås ved hjelp av bare hendene, i samråd med anlegget veterinær og ansatte helsemyndigheter. Hvis dette ikke er mulig, bør myke bomullshansker bæres over barriere hansker for å unngå å trekke på rottenes pels.
  2. Sterilt område forberedelse. Før start kirurgi, Surgical område fremstilles, et sterilt felt fremstilt rundt stereotaksiske anordning og en steril drapere plassert over anordningen, som dekker en varmepute som er brukt til å opprettholde rotte kroppstemperaturen. En sirkulerende varmt vann puten med nøyaktig termostat blir brukt for å hindre overoppheting av dyret.
  3. Anestesi induksjon. Den isofluran vaporizer kontrolleres å inneholde optimale nivåer av isofluran og koblet til induksjon kammeret. Tilkoblinger er sjekket for å bekrefte en lukket sløyfe. The air-håndtering vakuumsystem er sjekket for å være operativt. Isofluran Fordampingsanlegg er slått på og dyret plassert i induksjon kammeret ved hjelp av en 5% isofluran i oksygen blanding: som er, 5% isofluran lagt inn i en strøm av 100% oksygen og levert til induksjon kammeret.
  4. Plassering i apparatet. Dyr er sikret i stereotaksiske apparat med earbars og en tann bar. Riktige earbar plassering resultater i en immobile hode og ører som ligger flatt langs earbars. Dyrraskt sikret og nesen satt inn i en hensiktsmessig utformet bedøvelse nosecone; produksjonstid av fordampet isofluran skiftes fra induksjon kammer til det nosecone og bedøvelsen mix justert til å levere 2-3% isofluran i oksygen strømmen går til nosecone.
  5. Bekreftelse av anestesi. En kirurgisk bedøvelse flyet bekreftes ved å levere en hard klype til foten og en blåse luft til øyet, heller ikke skulle forårsake noen respons. Disse testene gjentas med omtrent 15 minutters mellomrom i hele operasjonen for å bekrefte vedlikehold av et kirurgisk anestesi flyet. Håret er fjernet fra såret nettstedet før du går inn i sterile feltet.

2. Kirurgi

  1. Animal første behandling. Oftalmisk salve påført hvert øyeeplet å forhindre uttørking. 1 ml sterilt saltvann gis fm å forhindre dehydrering under operasjonen, og kroppen er dekket med et sterilt drapere. Betadine brukes til hodebunnen, og penslet fra sentrumut med en bomullsdott, 70% etanol er penslet tilsvarende, og de to swabbing trinnene gjentas ytterligere to ganger for å sikre en hensiktsmessig innsnitt området. Hud kontakttid for Betadine og alkohol bør være minst 3 min før innsnitt. Anestesi vedlikeholdes og kontrolleres regelmessig gjennom kirurgi, en enkelt subkutan injeksjon av karprofen 5 g / kg) er gitt for å initiere analgesi, og aseptisk teknikk brukes. Analgesi er gitt etter induksjon av anestesi å minimere stress fra injeksjon.
  2. Innsnitt og skalle forberedelse. En 3-4 cm kutt er gjort sagitally i sentrum av skallen. En 1:1 blanding av bupivicaine: adrenalin brukes topically å gi ytterligere analgesi og minimere blødning. Hodebunnen er holdt unna snittet hjelp kirurgiske klipp og sterile vattpinner brukes til å fjerne overliggende membraner fra skallen. Koordinater for boring måles ved hjelp bregma som et referansepunkt, merket med steril bor (eller, alternativt, en håndholdt cautery device), og re-bekreftet for nøyaktighet før boring starter. Koordinater for bestemte områder av hjernen av interesse (f.eks her hippocampus) bestemmes ved hjelp av en hjerne atlas. For hippocampus mikrodialyse, bruker vi en borestedet på 5,6 mm posteriort bregma, 5,0 lateral, og 3,0 ventral fra dura.
  3. Boring. Tre hull er boret gjennom skallen, med omsorg blir tatt for å søke kun minimal kraft slik at traumer til dura og underliggende membraner er minimal eller fraværende. Ett hull er på målte stedet kanylen innsetting, de to andre er plassert som praktisk for innsetting av skull skruer. Formålet størrelse skruer (f.eks 1,17 mm selvgjengende skruer, Fin Science Tools) er satt inn i disse hullene uten at det påvirker hjernen under, og brukes som ankerpunkt for senere dental sement programmet.
  4. Kanyle plassering og nedleggelse. Kanylen er plassert ved innsetting koordinater, som er re-bekreftet å være stedet for hullet boret,og blir deretter langsomt senket til måldybden. Gang riktig plassert, blir kanylen festes på plass med dental sement. Hvis det er nødvendig, er en steril kirurgisk sutur brukes til å lukke såret. En stylet er satt inn i kanylen for å opprettholde åpenhet. I denne protokollen bruker vi en CMA12 sonde og guide kanyle (CMA / mikrodialyse).
  5. Akutt postoperativ omsorg. 3 ml sterilt saltvann gis fm fortsette hydrering, en enkelt subkutan injeksjon av karprofen 5 g / kg) er også gitt for å initiere analgesi. Dyr blir fjernet fra anordningen og plasseres i en oppvarmet utvinning rommet, i en ren merd, og overvåkes før de er fullt utvinnes fra anestesi. Full gjenoppretting er vurdert av restaurering av refleks og normal bevegelse. Dyr blir deretter returnert til sine hjem buret og regelmessig holde rommet.
  6. Short-term oppfølging. Merdene av dyr som har gjennomgått kirurgi er merket med dato for operasjonen. Dyr blir kontrollert minst en gang hver dag i minst three dager etter operasjonen, og gitt en karprofen tyggetablett (2 mg) på dagen etter operasjonen og hver av de to følgende dagene. Hvis dyrene ikke forbruke karprofen, kan injiserbare karprofen gis for å sikre adekvat analgesi. Overvåke både den generelle helsen til dyr og staten sårstedet (for infeksjon, rødhet, etc.) etter institusjonelle dyr omsorg retningslinjer og ber om hjelp eller råd fra dyr omsorg ansatte eller veterinær om nødvendig. Viktigere oppmerksom på at riktig håndtering og akklimatisering til eksperimentator er viktig: dyr skal håndteres mye, inkludert manipulering av kanylen, til ingen tegn til nervøsitet eller stress forblir når det brukes av eksperimentator.
  7. Påfølgende dyr omsorg og behandling. Dyr vil følge passende tester og aktiv dødshjelp prosedyrer i henhold til godkjent protokoll og deres spesifikke eksperimentelle gruppen.

3. Mikrodialyse (MD)

  1. Perfusspiste forberedelse. Kunstig ekstracellulær væske (aECF) er laget med 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl 1,25 mM glukose, buffret ved pH 7,4 6 MERK at nøyaktig væske sammensetning er viktig:. Unøyaktigheter eller bruke av andre, mindre fysiologiske væsker som Ringers eller PBS for mikrodialyse vil resultere i markert feilaktige resultater 6. Spesielt, oppmerksom på at ionesammensetning av ekstracellulær væske (ECF) er ikke den samme som av CSF, som vi viste i en 2004 detaljert studie av hippocampus ECF 6. På dagen for testing, bovint serumalbumin (BSA) bør tilsettes ved 2% vekt / vekt og fullstendig oppløst, og dette reduserer tap av peptider slik som insulin fra tilslutning til røret, og også reduserer risikoen for væsketap (ultrafiltrasjon) på sonden membran. Etter klargjøring bør perfusatet bli filtrert gjennom et 0,2 um filter.
  2. Hvis en behandling, for eksempel insulin er å bli levert til BHi området av interesse (her hippocampus), forberede denne behandling ved hjelp av en alikvot av den tilberedte aECF med riktig legemiddelkonsentrasjonen. For insulin, har en konsentrasjon på 400 nM (66,7 μU / ul) for levering via revers mikrodialyse blitt vist å påvirke hippocampus metabolske og kognitiv funksjon 7. Merk at den resulterende vev konsentrasjonen av insulin er ikke her målt og forblir ukjent.
  3. Sette opp mD probe og linjer. Utarbeide en fersk mikrodialyse sonde og linje dagen før testing. Opprette to separate linjer for "tilsig" og "strøm". Bruk PE50 rør for å koble to 1 meter lange stykker av FEP rør og sikre at det er minimal dead space mellom linjene. Koble innstrømningen slangen til en 1 ml Hamilton sprøyte fylt med sterilt-filtrert, avionisert H 2 0 (dH 2 0), og deretter festes til proben.
  4. Mikrodialyse svivel. Å tillate fri dyr bevegelse når du tar målinger, kobler du en flytende svivel til jegnflow og utstrømning linjer, nær pumpen, ved hjelp av ekstra FEP tubing. Huske å ta det interne volumet av dette svingbare og produksjonsrør i betraktning ved vurderingen timing av prøvetaking (nedenfor).
  5. Sette opp mD pumpe. Slå på mD pumpen og kjøre på 1,5 pl / min til du ser dH 2 0 avslutter utstrømningen røret på sonden. Deretter, mens pumpen er slått av, kobler den andre linjen mellom utstrømningen rør og en prøvetaking tube. Kjøres 5 ml gjennom røret og plasser-probe i en ampulle som inneholder steril dH 2 0 over natten; sikre at sondespissen alltid forblir våt.
  6. Pre-sondering testperson. 24 timer før testing, fjern dummy stylet fra rotte hode og sette inn en mD probe (brukes kun for dette formålet, ikke for prøvetaking) i 10 min. Deretter erstatte dummy stylet og sette rotte tilbake i buret sitt. Denne prosedyren er laget for å minimere effekten av reaktiv gliosis på dagen for å teste 8 og i våre hender, gir dette god results som samsvarer data fra andre teknikker og synes å gjenspeile hippocampus aktivering 2,5,7,9, andre har brukt en lignende tilnærming som forlater sonden på plass i 24 timer før måling, som også er en god tilnærming når skade på sonde natten kan unngås.
  7. Probe ekvilibrering. På dagen for mikrodialyse, fyll Hamilton sprøyten og scintillasjonskyvette med filtrert aECF og pumpe gjennom til stabilisering i 1 time. Hvis nødvendig, fylle en andre Hamilton sprøyte med forberedt behandling (for eksempel insulin-aECF) og fyll i sprøytepumpen.
  8. Probe innsetting. Når ekvilibrering er fullført, fjerner dummy stylet og forsiktig inn likevekt mD steketermometeret inn i rotte hjernen via kanyle. Plasser rotte i en klar plast boks som inneholder noen av rotte hjem sengetøy. Husk å motvekt slangen: feste en 1,6 ml mikrosentrifugerør fylt med vann til røret utenfor buret på en slik måte at tyngdekraften holder microdialysis linjer unkinked men ikke stram. La sonde ekvilibrere i rotte i 2 timer. Ved starten av denne perioden, bekrefter at flyten av perfusatet er frigjort: Dette gjøres enklest ved å samle perfusatet strøm over en definert periode og veiing prøven for å bekrefte at forventet volum på vei ut av systemet. Enhver sonde som gir <90% av forventet volum, og ikke selv riktig etter fjerning og re-innsetting, bør erstattes (ellers ødem på sonden spissen vil resultere). Hvis strømmen er vedvarende lav eller fraværende, sjekk alle tilkoblinger for lekkasje, i motsatt fall koble slangen i etapper for å se om blokkeringen kan isoleres. Hvis problemet ikke er identifisert, må du bytte sonden, hvis problemet ikke løser, kan det være nødvendig å starte på nytt med ny sonde og linjer fra punkt 3.3. Den to timer ekvilibreringsperiode tillater blod-hjerne barrieren å forsegle rundt sonden og unngå akutte effekt av sonde innsetting.
  9. Prøvetaking. Sørg for at correlation mellom prøven dialyse (fra hjernen) og samling (i rør) er nøyaktig beregnet. For eksempel, ved hjelp av to meter FEP slangen mellom svivel og sonde, er det et totalt volum mellom sonde og samling av 30 pl og dermed det tar 20 min ved 1,5 pl / min strømningshastighet for prøven å passere gjennom sonden, rør, kontakter og sving å komme til slutten av slangen for samlingen. Når prøvetaking sikrer at du samler nok volum til å ha konsentrasjon er nødvendig for analyser. Her vil vi bruke 5 min sample hyller, og dermed samle 7.5 ul dialysatet i hver samling rør.
  10. Baseline prøver. Når ekvilibrering er fullført, begynner prøvetaking. Samle minst tre prøver mens rotte er i ro i hjemmet kammeret for å etablere en stabil grunnlinje av målinger
  11. Behandling timing. Ta vare å beregne nødvendig timing for oppstart av behandling før forsøket: husk at akkurat som det er et etterslep mellom dialyseog prøvetaking, er det en forsinkelse (vanligvis identiske) mellom perfusatet forlater sprøyten og ankommer dyrets hippocampus. Derfor, i vår oppsett med en 30 pl volum mellom sprøyte og sonde, endre sprøyten til at inneholder behandling-perfusatet 20 min før du ønsker behandling for å begynne ankommer hippocampus.
  12. Endre sprøyter. En flytende bryteren kan brukes hvis ønskelig, men er ikke nødvendig: på riktig tidspunkt, bare å koble innstrømningen linje fra kontroll-perfusatet sprøyte og raskt kobles til behandling-perfusatet sprøyte. Dette bør ikke ta mer enn 5 sekunder for å unngå betydelig avbrudd i perfusatet flyt. MERK at denne prosessen skal reverseres etter ønsket dosering er levert, hvis en tidsbegrenset levering av behandling er ønskelig. Alternativt kan behandlingen fortsette for varigheten av prøvetaking (se Figur 2). Luftbobler må ikke bli innført i rørledningen under veksling avsprøyter, da de kan samle på dialysemembran og redusere probe effektivitet.
  13. Behavioral testing. Hvis du utfører et atferdsmessig oppgave, følger den prosedyren (se pkt. 4 nedenfor). MERK at samordning med levering av behandling til hippocampus er viktig. For eksempel bør levering av insulin være tidsbestemt til å skje 10 min før start testing 10. Derfor bør bryteren til en insulin-inneholdende perfusatet forekomme 30 min før atferdsmessige testing (20 min for perfusatet å passere gjennom linjer pluss 10 min ønsket leveringstid foran testing).
  14. Gjennomføring av prøvetaking. Etter å samle de ønskede prøvene, forsiktig fjerne sonden fra dyrets hode, igjen huske å ta hensyn til etterslep mellom dialyse og prøvetaking. Returner dyret til sitt hjem bur og observere nøye for eventuelle post-eksperimentell endring i helse eller atferd før dyret er drept og hjernen fjernet for å bekrefte riktigprobe plassering. Hvis offer vil ikke skje umiddelbart, returnere dummy stylet til kanylen for å unngå en eventuell innføring av fremmed materiale.
  15. Analyse. Den analytisk metodikk vil variere avhengig av analytten (e) av interesse. Fordi dialyse prøvetaking ikke tillater fullstendig analytt ekvilibrering på sonden membran, bør prøven konsentrasjoner korrigeres å gi ECF konsentrasjoner ved hjelp null-net-fluks metode 11,12.

4. Behavioral Testing

  1. Plassering på labyrint. Etter baseline prøvene (dvs. etter minst tre prøver har fullført dialyse, men kan fortsatt være i utløpet slangen samles), forsiktig flytte rotte inn i atferdsmessige testapparat. Hvilken som helst passende oppgave kan brukes, dataene i Figur 1 ble oppsamlet ved hjelp av en fire-arm plus-formet labyrint og måling spontan veksling, som er et mål på romlig hukommelsen: rat er i utgangspunktet plasseres i center av labyrinten og lov til å utforske fritt 9,13. Fordi noen atferdsmessige testen kan brukes, er fokus for denne protokollen ikke på den spesifikke oppgaven brukt som et eksempel her (som er detaljert andre steder 9,14,15), men i korte trekk, er dyr lov til å utforske labyrinten (perioden den grå boksen i figur 1), og bruk hippocampally-avhengige prosesser å bevare minnet hvorav armene nylig har vært besøkt.
  2. Dialyse tubing bevegelse under testing. Hold slangen slik at den beveger seg fritt, verken hindering rotte bevegelser nor tillates å bevege seg i foran dyret og distrahere den. Bo på plass og minimere egen bevegelse, slik at du ikke påvirker rotte atferd.
  3. Fortsatt prøvetaking. Som under baseline, flytter utstrømningen slangen til en ny samling rør hvert 5. min.
  4. Veksling testing. At dyret kan fritt utforske labyrinten i 20 min. Registrere sekvensen og timing av arm oppføringer brukeret videoopptak eller for hånd for senere oppgave analyse 9,15.

5. Post-testing

  1. Endelig prøvetaking. Etter testing, fjerne rotte forsiktig fra labyrinten og gå tilbake til styre kammer. Fortsett mikrodialyse prøvetaking i minst fire prøver å dekke perioden utvinning fra utføring av oppgaver.
  2. Probe fjerning. Etter alle prøvene er samlet inn, forsiktig fjerne sonden fra dyrets hode og sted inn i en lagringsplass hetteglass, sende dyret tilbake til sitt hjem buret.
  3. Probe lagring. Etter retur dyr til hjemmet buret og fullføre samlingen av gjenstående dialysatet, skyll sonden grundig med dH 2 0 og oppbevar i en scintillasjonskyvette fylt med dH 2 0 og dekket med parafilm. Skyll slangen ved å bytte til en sprøyte som inneholder en oppløsning av 1:10.000 Kathon i dH 2 0 for å hindre mikrobe vekst. Følere kan gjenbrukes så lenge de opprettholder god flyt og haringen skade på membranen, med forsiktighet dette bør rutinemessig være i overkant av ti bruksområder.
  4. Histologi. Drepe dyret og ta hjernen. Stykke på kryostaten og bruke standard histologiske teknikker (f.eks Cresyl fiolett flekker) for å bekrefte riktig probe plassering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rotter bør komme seg raskt fra kirurgi og være på vakt, bevegelige og aktiv innen 30 min etter seponering av anestesi. Virkningen av kanylen hetten skal være minimal dersom operasjonen er utført rent og minimal tannsement brukes. Hvis noen tegn på infeksjon er lagt merke til i løpet av postoperativ overvåking, eller rotte er på noen måte viser tegn på stress eller ubehag, umiddelbart avslutte forsøket, og dette bør være svært sjeldne. Under håndtering før testing, bør dyrene være på vakt, fritt bevegelige, vennlig og nysgjerrige. Godt håndteres dyr bør ha vesentlige ingen observerbar stresset gjenværende fra kirurgi, postoperative utvinning, eller tilstedeværelse av experimenter, og dette kan om ønsket bekreftes ved måling av plasma stresshormoner (adrenalin, glukokortikoider) og / eller glukose 2,4 , 5.

Brain ECF glukose er typisk i området 0,5 til 1,5 mM, varierende etter hjernen regionen, selv om høyere verdierkan ses i diabetiske dyr, i hippocampus, baseline glukosekonsentrasjonen er på nær størrelsesorden 1,25 mm 6,12. I fravær av eksogen behandling, bør en dukkert i ECF glukose (og ofte, en økning i ECF laktat) bli sett, ved utføring av oppgaver, i områder av hjernen som er involvert i formidling som oppgave (se figur 1 for eksempel): Dette gjenspeiler økt metabolsk aktivitet indusert av den kognitive belastningen 9,14,16. Lignende endringer kan tas som bevis på at en bestemt behandling øker lokal metabolisme, som sett for eksempel etter akutt administrering av insulin via tillegg til perfusatet 7 (figur 2).

Generelt bør en godt håndteres dyr utføre atferdsmessige testing med ingen tegn til ubehag og uten noen tegn til bevissthet om mikrodialyse tubing: tegn til overdreven grooming, immobilitet, noen indikasjon på smerte eller forsøk fra dyret å fjerne sonden indikerersannsynlig utilstrekkelig håndtering og / eller infeksjon rundt sonden området, og bør tas som en indikasjon for å avslutte eksperimentet.

Dyr som får insulin administrasjon skal, i tillegg til forhøyet hippocampus metabolisme, viser markert forbedret romlig minne 7. Kontroll, bør ubehandlede dyr har gjennomsnittlig veksling ytelse på 4-arm labyrint av mellom 65 og 75% 7,9,14.

Figur 1
Figur 1. Oppgave-forbundet dukkert i hippocampus ECF glukose (tilpasset fra 9). Grey boksen er den perioden av labyrinten testing på spontan veksling (SA). Lilla linje viser hippocampus glukose hos dyr uten labyrint testing (men som ellers var håndtert likt). Røde linjen er målinger på dyr som utfører 4-arm SA oppgave, oransje linjen viser målinger i dyr utfører enklere3-arm versjon av SA.

Figur 2
Figur 2. Endringer i hippocampus glukose og laktat etter administrering av insulin via inkludering i perfusatet (tilpasset fra 7). Insulin når hippocampus ved punktet indikert ved pil og administreres kontinuerlig etterpå. Dyr ble testet i deres hjem bur, med ingen atferdsmessige manipulasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle løsninger som brukes i mikrodialyse bør filtreres umiddelbart før bruk ved hjelp av en 0,2 mikrometer filter. Etter innsetting av sonden inn i føringen kanylen, observere for å bekrefte at strømmen er uhindret og prøvetaking skjer. Dersom vannstrømmen stopper etter innsetting, er den mest sannsynlige årsaken til skade på sonden membranen forårsaket av utilstrekkelig omsorg på innsetting, og en fersk sonde må erstattes.

Som nevnt ovenfor, er en viktig fordel med disse metodene mangel på forvirre, tillater både atferdsmessige og nevrokjemiske tiltak i våken, fritt bevegelige dyr: å dra nytte av dette, er omfattende håndtering før testing avgjørende for at dyret skal unstressed under målinger. Den ekvilibreringsperiode er generelt tilstrekkelig til å tilveiebringe en stabil metabolsk inklusjon, men maten kan fjernes for 1-2 hr før testing om ønsket for å sikre enhetlige blodsukkernivået tvers dyr.

The to mest betydelige begrensninger av mD som en sampling teknikk er (i) begrenset størrelse av analytt, og (ii) potensial for tap av analytt grunnet vedheft i slangen. Førstnevnte kan lindres i noen grad ved bruk av MD prober med et større molekylvekt cut-off. Typiske kommersielle prober tillater cutoffs opptil 100 kD, slik at molekyler av opptil kanskje 50 kD vil passere gjennom forholdsvis uhindret, men bruk av lavere cutoff membraner anbefales der mulig å minimere enhver prøvetap via ultrafiltrering ved sondespissen. Vedheft av målmolekylene til slangen er et problem først og fremst i tilfeller av peptid målinger, hvorav mange vil tendere til å følge FEP rør og dermed redusere både analytten utvinning og nøyaktighet. Dette problemet kan bli minimalisert ved (i) forbehandling av det indre av produksjonsrøret ved hjelp av en perfusatet som 2% bovint serumalbumin er lagt, som fungerer som en blokkerende middel, og (ii) ved å minimere lengden av avkastningen slange: hvis needed, kan en lett samling hetteglass være festet nær utstrømmingen av sonden, men dette utgjør ytterligere utfordringer i veksling samling rør uten å forstyrre dyret, spesielt under atferdsmessige testing. En fordel ved teknikken er at prøvene er fremstilt i en form fri for cellulært avfall eller store molekyler slik som enzymer, og er generelt egnet for direkte analyse via injeksjon i HPLC, MS eller andre analytiske maskineri som den er, uten behov for ytterligere rensing , dette tillater også i mange tilfeller den analyse av flere analytter i hver prøve (for eksempel glukose og laktat målinger vist i figur 2).

En variant til bruk av omvendt mikrodialyse å levere farmakologiske behandlinger er å bruke doble mikroinjeksjon-mikrodialyse sonder, tilgjengelig fra flere kilder. Imidlertid er boringen i injeksjonsporten generelt svært smale og utsatt for blokkering, og det kan være vanskelig å nøyaktigstyre tidspunktet og / eller volum av behandling produksjonstid. Dette alternativet er derfor kun anbefalt for behandlinger som ikke er mottagelig for levering via inkludering i perfusatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDDK (DK077106 til ECM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics