トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

このビデオでは、我々の研究室は、日常的にトリプシンとの色合いのヒト胚性幹細胞株を通路方法を示します。

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

このビデオでは、我々の研究室は、日常的にトリプシンとの色合いのヒト胚性幹細胞株を通路方法を示します。ヒト胚性幹細胞は、細胞培養の成果物であり、高い人口倍加した核型異常を取得する傾向がある。適切な継代は、健康、未分化、karyotypically正常な色合いのヒト胚性幹細胞培養を維持するために必須です。最初に、拡大培養は残留メディアや細胞破片を除去するためにPBSで洗浄し、次いで細胞は温かい0.05%トリプシン- EDTAの最小限のボリュームでオーバーレイされます。トリプシンは、最大5分間までのセルに残って、その後、細胞を穏やかに2mLの血清学的ピペットで外れています。細胞懸濁液は、その後、細胞を穏やかな遠心分離によって収集され、色相のメディアの大容量で採取し、混合される。不活化トリプシンメディアの混合物を除去し、細胞は、予め温めておいた色合いのメディアに再懸濁されている。適切なスプリット比は、(一般的には1:10〜1:20)に計算されます、そして放射線照射マウス胎児線維芽細胞のフィーダー細胞の単層を含む1から2日目のプレートに再播種した細胞。新たに接種した色合いの培養プレートを48時間静置され、その後メディアはその後、毎日変更されます。これは核型異常を導入するリスクを増加させるとそれは、単一の細胞懸濁液にダウンtrpsinizeことが重要です。

Protocol

一般

我々は、容易な取り扱いを確保するために与えられた一度に1つ以上のサンプルを解凍することをお勧めします。ハンドラは、長時間室温と低CO2で培養を残さないよう注意する必要があります。生細胞の全ての遠心は室温で5分間、500〜600 × gで行われます。

MEFを(マウス胚性フィーダー細胞)

  1. 37〜プレ暖かいMEFのメディア℃の-80から直ちに° Cおよび37 ° Cの水浴中に浸し、チューブの下半分をMEFバイアルを取り外します。細胞が80%(左の小さな冷凍部分)に解凍する前に、これは30〜45秒ほどかかります。
  2. 迅速に、層流フードへのチューブをもたらす70%アルコールでダウンスプレー、と予め温めておいた培地に細胞を移す。
  3. 前の準備プレートからゼラチン溶液を吸引除去する。
  4. sixのウェルの各々に滴下方法でMEFの溶液のアリコート2ミリリットル。よく約均等にMEFのを配布してください。 MEFのは、プレートにアタッチできるように一晩MEFプレート、および37℃のインキュベータ内の場所を日付。
  5. 6時間後のMEFは、プレートに添付されます。 24〜48時間、めっき後MEFプレートを使用するのが最良です。 4日以上経過であるMEFのプレートを使用しないでください。
  6. 37にメディア及び0.05%トリプシン/ EDTA ° Cボンネット、prelabel下の1滅菌50 mlコニカルチューブプリ暖かい色合い。
  7. 慎重に分割する文化から色相の培地を吸引除去する。優しく1Xリン酸緩衝液(PBS)ウェルあたりの2mLのでウェルを洗浄。 PBSを吸引除去する。ウェルに0.75ミリリットル0.05%トリプシン/ EDTAを追加。
  8. 蓋を交換し、4倍で細胞を観察します。色相のコロニーを周囲のMEFは撤回を開始する必要があります。 MEFのは十分に丸められると色相のコロニーの境界線が荒いときは、フードにプレートを返します。このプロセスは、まったくの10分より長くしたり、細胞がしない再成長、約5分かかりますありません。
  9. MEFの単分子層が完全に(単層が固定して、1つの部品のままとなる場合がある)切り離されるまで、静かに、井戸の底を洗い、上下にピペッティングし。
  10. 追加の色合いのメディアを含む50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。メディアをオフ吸引、5分間500xg細胞のチューブをスピン、細胞ペレットを乱さないように注意してください。
  11. MEFの新しいプレート上にプレートに、追加の色合いのメディアへの細胞の適切に定める量を追加し、自動化されたピペットでソリューション5〜7倍のピペット。
  12. MEFの新鮮なプレートからMEFメディアを取り出します。
  13. 分注し、各ウェルに賢明な色合いのソリューションのドロップを、よくに関して均等にドロップを配布することを確認すること。プレートを振とうすることなく、慎重な色合いのコロニーのシードように一晩37℃のインキュベーターにセルを返します。
  14. スプリットから出てくる色合いの細胞は、雪解けから出てくるものと同様に動作する必要があります。

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Discussion

このビデオでは、我々の研究室でどのように日常的に通過の色合いヒト胚性幹細胞株を示した。効率的かつ定期的に分割し、継代は、健康なヒト胚性幹細胞株を維持するために必須です。トリプシンを介した通路は、色相の細胞株の大きな利点である、しかし、それは上の文化をトリプシンしたり、再platting中の単一細胞の大部分を持たないことが重要です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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