HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina. Células madre embrionarias humanas son artefactos de cultivo celular, y tienden a adquirir las anomalías del cariotipo con duplicaciones de población. Pases adecuada es esencial para el mantenimiento de una sana, las tonalidades diferenciadas, cariotipo normal de madre humanas embrionarias cultivo de células. En primer lugar, una cultura en expansión se lava con PBS para eliminar los medios de comunicación residuales y los desechos celulares, y luego las células se cubren con un volumen mínimo de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA. Tripsina se deja en las células durante un máximo de cinco minutos, luego las células se desprendió suavemente con una pipeta serológica 2 ml. La suspensión celular se recoge y se mezcla con una gran cantidad de medios tonos, y luego las células se recogieron por centrifugación suave. La mezcla de los medios de comunicación inactiva la tripsina se elimina, y las células se resuspendieron en pre-calentado los medios tonos. Una relación de separación adecuada se calcula (en general, 1:10-01:20), y las células re-chapada en una placa de 1-2 días de edad que contiene una monocapa de células embrionarias de ratones irradiados fibroblastos de alimentación. La placa recién sembrado HUES la cultura se deja en reposo durante 48 horas, entonces el medio se cambia todos los días a partir de entonces. Es importante no trpsinize hasta una suspensión de células individuales, ya que esto aumenta el riesgo de introducir alteraciones del cariotipo.

Protocol

General

Se recomienda descongelar no más de una muestra en un momento dado para facilitar la manipulación. El operario debe tener cuidado de no dejar a temperatura ambiente, las culturas y las bajas emisiones de CO2 durante largos períodos de tiempo. Todos los centrifugación de las células vivas se realiza a 500-600 g durante 5 min a temperatura ambiente.

MEFs (células embrionarias de ratón alimentador)

  1. Pre-caliente el MEF los medios de comunicación a 37 ° C. Retire el vial MEF de -80 ° C e inmediatamente se sumerge la parte inferior del tubo en un baño de agua 37 ° C. Se debe tener unos 30-45 segundos antes de que las células son del 80% descongelado (pequeña porción de helado a la izquierda).
  2. Llevar rápidamente el tubo a la campana de flujo laminar, rocíe con el 70% de alcohol, y la transferencia de células pre-calentado a los medios de comunicación.
  3. Aspirar la solución de gelatina a partir de placas preparado con anterioridad.
  4. Alícuota de 2 ml de solución de MEF en una caída de manera inteligente en cada uno de los seis pozos. Asegúrese de distribuir el MEFs uniformemente sobre el bien. Fecha de la placa de MEF, y colocar en una incubadora a 37 ° C durante la noche para permitir que MEFs para conectar a la placa.
  5. Después de 6 horas MEFs se une a la placa. Lo mejor es utilizar placas MEF 24-48 horas después de la siembra. NO use una placa de MEF que tiene más de 4 días.
  6. Pre-cálidos tonos medios y el 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C Bajo el capó, prelabel un tubo estéril de 50 ml cónicos.
  7. Con cuidado aspirar los medios de comunicación tonalidades de la cultura que se divide. Lave suavemente los pocillos con 2 ml de solución tampón fosfato 1X (PBS) por pocillo. Aspirar el PBS. Añadir 0,75 ml 0,05% de tripsina / EDTA al pozo.
  8. Vuelva a colocar la tapa, y observar las células bajo un aumento de 4x. El MEFs alrededor de las colonias HUES debería comenzar a retraerse. Cuando el MEFs son lo suficientemente redondeadas y las fronteras de las colonias Las tonalidades son ásperas, devolver la placa a la capilla. Este proceso debe tomar alrededor de 5 minutos, absolutamente no más de 10 minutos, o sus células no volverá a crecer.
  9. Pipeta suavemente hacia arriba y abajo, lavando el fondo del pozo, hasta que el MEF ha monocapa completamente separado (monocapa es pegajosa y puede permanecer en una sola pieza).
  10. La transferencia de la suspensión de células a un tubo cónico de 50 ml que contienen los medios de comunicación HUES adicionales. Girar el tubo de células 500xg durante 5 minutos, se aspira de los medios de comunicación, tenga cuidado de no perturbar el sedimento celular.
  11. A la placa en un nuevo plato de MEFs, agregar el volumen adecuadamente determinado de células de los medios de comunicación HUES adicionales, y la pipeta la solución 5-7 veces con una pipeta automática.
  12. Retire el papel MEF a partir de una placa fresca de MEFs.
  13. Alícuota de la caída de HUES solución inteligente a cada pocillo, asegurándose de que la distribución de las gotas uniformemente sobre el bien. Sin mover la placa, con cuidado retorno a las células a una incubadora a 37 ° C durante la noche para dejar la semilla HUES colonias.
  14. Células HUES saliendo de una división debe comportarse de manera similar a los que salen de un deshielo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En este vídeo se demuestra la forma en que habitualmente HUES paso humano líneas de células madre embrionarias en nuestro laboratorio. División eficaz y regular y pases es esencial para mantener un saludable humano línea de células madre embrionarias. Paso de la tripsina mediada es una ventaja significativa de las líneas de células HUES, sin embargo, es importante no trypsinize sobre las culturas o de tener una gran proporción de células individuales durante la re-lotificación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats