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利用颅窗口,在可视化的大脑中动脉内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞

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Summary

本文介绍了一种方法,可视化的大鼠大脑中动脉通过颅窗颞部颅骨切除术,以大脑中动脉近端部分(

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Regenhardt, R. W., Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Mecca, A. P. Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (72), e50015, doi:10.3791/50015 (2013).

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Abstract

颅窗口的创建是一个方法,可以直接可视化结构的大脑皮质表面1-3。这种技术可以覆盖的大鼠大脑在许多地方进行,但最容易地进行通过创建一个去骨瓣在容易获得额叶或顶叶骨头。最经常的是,我们已经使用了这种技术,组合与内皮素-1的大脑中动脉闭塞模型的缺血性中风的大脑中动脉的血管直径的变化所发生的脑实质与内皮素-1注入到相邻的近端MCA量化4,5。为了形象化在内皮素-1诱导的缺血的MCA的近端部分中,我们使用一种技术,以通过颞骨大鼠颅骨外侧面( 图1)上建立一个颅窗。脑动脉可与硬脑膜完整或与硬脑膜切开retra的的可视化反恐执行局。最常见的是,我们离开硬脑膜完整过程的可视化,因为内皮素1诱导脑缺血涉及到脑实质内的血管收缩肽交付。这将绕过切开硬脑膜直接在可视化血管药物输送的需要。该协议将介绍如何创建一个颅窗的可视化脑动脉一个逐步的时尚,以及如何避免许多关于这种方法的潜在缺陷。

Protocol

机构动物管理和使用委员会(IACUC)在佛罗里达大学和批准该协议是符合“指南的照顾和使用的实验动物”(第八版,美国国家科学院,2011年)。

物料

  1. 动物:8周龄,雄性,只SD大鼠(查尔斯河农场,威​​尔明顿,MA,USA),体重250〜300克,手术时间。
  2. 麻醉
    1. 吸入麻醉系统(VetEquip公司,普莱森顿,CA,USA)
    2. 异氟醚麻醉剂(巴克斯特制药,迪尔菲尔德,IL,USA)
  3. 立体定位系统(大卫KOPF工具,图洪加,CA,USA)
    1. 小动物立体定位系统
    2. 非破裂大鼠耳棒
    3. 气体麻醉大鼠头支架
  4. 温度调节
    1. BAT-12探针温度计(世界精密仪器公司,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)
    2. T / PUMP,TP600热毯(Gaymar工业公司,果树园公园,NY,USA)
  5. 手术器械
    1. 梅岑鲍姆剪刀,虹膜钳,斗牛犬钳拉钩,10μl注射器,26号斜口针,Bovie烧灼试剂盒(世界精密仪器公司,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)
    2. 微电机钻(Stoelting,伍德戴尔,IL,USA)
    3. 0.8毫米的圆形钻牙钻(Roboz手术仪器有限公司,公司,盖瑟斯堡,MD,USA)
    4. STORZ,波恩缝合钳(博士伦公司,罗切斯特,NY,USA)
  6. 手术用品
    1. 3.0尼龙线(绿洲,Mettawa,IL,USA)
    2. 棉拭子,Puralube的眼膏(默飞世尔科技,匹兹堡,PA,USA)
    3. 手术点和条(Xomed公司,杰克逊维尔,佛罗里达州,美国美敦力公司)
    4. 电推剪(奥斯特,普罗维登斯,RI,USA)
    化学制品
    1. 内皮素-1(美国多肽,桑尼维尔,CA,USA)
    2. 洗必泰2%(Agrilabs,圣若瑟,MO,USA)
  7. 可视化设备
    1. 手术显微镜(塞勒仪器及制造,圣路易斯,MO,USA)
    2. 索尼HDR-SR12(索尼,千代田区,东京,日本)
    3. 光纤照明器(TechniQuip公司,利弗莫尔,CA,USA)
  8. 测量血管直径
    1. VLC媒体播放器(巴黎,法国)
    2. Image J软件(ImageJ的1.42q软件,美国国立卫生研究院,贝塞斯达,MA,USA)

1。术前步骤

  1. 手术前,老鼠被安置在一个12:12的光/暗周期,可免费使用水和啮齿动物州城。
  2. 麻醉诱导用4%的异氟醚在100%O 2的混合气体的感应室中。
  3. 乌鸦 n的头被剃电推剪。
  4. 大鼠置于俯卧趴在一个温度控制的操作表面(隔热层)和头部被放置在与放置气体麻醉面罩的立体定向装置开始位置上的吸收垫。
  5. 接着,耳棒被插入并拧紧。
  6. 在手术过程中麻醉维持在100%O 2的混合气体,用2%异氟烷。
  7. 眼科润滑软膏的双眼,眼皮被关闭,以防止眼睛干燥,在手术过程中。
  8. 探针插入直肠温度为37±0.5℃下,以保持恒定的动物核心温度
  9. 与头牢固地保持在立体定位设备的麻醉大鼠的手术区是洁净其交替的洗必泰和盐水洗涤三次。

2。前颅窗准备

ontent颅创建一个窗口之前,应准备大鼠的任何其他所需的硬件植入实验,并应接受必要的外科手术。对于这个协议,我们先前已经植入了导套管内皮素-1(ET- 1)诱导脑缺血的配套出版物,题为“内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞模型缺血性中风激光多普勒血流仪在大鼠指导。”

3。创建颅窗

放置的导向套管或设备所需的实验后,颅窗口创建直接可视化在行程过程中的中脑动脉的近端部分。

  1. 首先,剪刀是用来覆盖开始向内侧颞肌和工作横向切开皮肤。
  2. 颞肌使用电一分为二,然后缩回,用3.0尼龙线visua利泽的颞骨鳞状部分。
  3. 约3-4平方毫米的鳞状部分颞骨尾鳍的轨道和卓越的颧突的基础上绘制的,因为它反映的颞骨。
  4. 使用的钻头,逐步削减的轮廓从颞骨的骨片。应小心避免钻头施加太大的压力,因为它有可能损坏硬脑膜或大脑皮质。
  5. 经常用无菌生理盐水进行冲洗,提高外科领域的可视化和防止经济过热的头骨。
  6. 在一个松散的角落,开始的一块的temoporal骨被小心取出用细鼠齿钳,同时确保不与硬脑膜撕裂任何船只。
  7. 硬脑膜原封不动和碎片用无菌盐水冲洗掉。

4。记录大脑中动脉收缩

帐篷“>为了演示如何捕获实时图像中,一个正在经历ET-1诱导脑缺血大鼠用于本协议。

  1. 血管活性化合物的应用程序之前,应该记录的基准视频至少1分钟。对于ET-1诱导缺血,基线记录一旦针已进入脑实质降低,但是之前的ET-1的注射。
  2. 开始注射的注射器泵,并记录为1小时,或直至所需的端点。针在视频录制期间,留在原地为了防止干扰焦平面。
  3. 根据批准的协议,此过程应该是深度麻醉大鼠和安乐死。

5。图像分析

可确定血管直径的可视化MCA的任何部分。作为一个例子,我们将使用的MCA的一个分支,测量血管的直径在时间点前后ET-1注射。性病会从视频帧被捕获在1分钟的时间间隔,使用VLC媒体播放器(VideoLAN的)。

  1. 安装VLC播放器并打开。
  2. 通过选择工具,然后选择Preferences,将设置更改为“全部”下的“显示设置”。
  3. “视频”菜单“中展开左侧边栏和”输出模块“,然后扩大。 “场景过滤器”带来现场视频滤镜菜单中选择。
  4. “场景”中键入文件名前缀的框。
  5. 目录路径前缀定义。这是保存静止帧。
  6. 被选择的记录比基于静止帧捕获所需的速率。如果被抓获的视频每秒29帧,然后在“1749”(29帧/秒×60秒/分钟)应的方框中输入保存一个静止帧,每1分钟。所有的更改,然后保存。
  7. 在VLC播放器,然后打开所需的视频自动保存静帧,每1分钟。
  8. 然后,使用这些测量血管直径图像。首先,ImageJ软件(NIH)被打开。
  9. 然后,你将测量的静帧,打开ImageJ的。
  10. 选择“分析”菜单,“设置测量”,然后打开所有的箱子都没有选中。
  11. 接着,将直线工具被选中。
  12. 键盘快捷键的“Ctrl +”是用来在需要放大,一条线被置于垂直于容器路径测量血管直径。
  13. 最后,船的长度是通过选择“分析”菜单,然后“措施”(Ctrl + M),以获得船只长度。
  14. 这个过程被重复至少3次,取平均值为测量每个测量容器,在每个静止帧。
  15. 被标准化为在每个时间点的血管直径,使基线血管直径的比较可以使用多个大鼠。要做到这一点,使用公式当前直径/基准直径×100%来计算的每艘船舶%的基准直径。

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Representative Results

静止图像捕获的视频显示取自脑动脉直径的变化后ET-1注射可以容易地理解,使用此颅窗技术( 图2)。 ET-1注射在几分钟之内,该船将开始收缩。最终,船只将是很难想象的脑组织会变得苍白。大约20分钟后,ET-1的影响将减少,血管开始扩张,逐渐恢复到基线直径约45分钟后。除了发生比较明显的血管收缩,ET-1后管理,皮质表面变得苍白。如果需要的话,它可以在容器直径计算的绝对变化与一个校准的显微镜掩模版。对于多个大鼠之间的比较,我们计算血管直径的相对变化的过程中发生的过程。这些测量完成使用ImageJ的软件(NIH)。图代表相对积极行动在容器的直径的变化,随着时间的推移,然后,可以构造( 图3)。

图1
图1。颞去骨瓣的位置。图此图描绘的大鼠颅骨前壁面向左侧的骨骼解剖结构。颞肌有其沿侧头骨脊的起源。这肌肉必须脱离这个脊,并以可视化的颞骨鳞状部分一分为二。后方的轨道和优于基地颧过程在此位置,因为它反映颞骨去骨瓣可以执行一个大约3-4毫米。大箭头的位置进行骨瓣。 3小箭头指示在MCA及其分支机构。所有动脉在此位置将MCA和动脉分支,它们的非曲折的外观和对血管活性化合物的敏感性,可以区别于静脉。

图2
图2。颅窗,ET-1注射后,ET-1注射前和再灌注后,从左边开始,通过颅窗MCA分支的代表图像显示。动脉可以通过它们的形态。相对直的MCA进入在左下角的字段,并在此图像中有一个主要的分支点。其他船舶在这些图片是脑静脉可以通过其更深层次的音调和曲折的外观。在闭塞动脉会迅速收缩,组织会变得苍白。慢慢地,动脉扩张,恢复到基线直径。


图3。随着时间的推移,使用一个简单的公式,当前的直径/基线直径×100% 代表血管直径的,随着时间的推移,可以计算出一个单一的大鼠百分比基线直径。这是可以做到的任何血管活性化合物。

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Discussion

总之,这种颅窗制备技术是非常通用的,因为它可以被改变,以满足许多实验与细微的修改4,5。例如,我们已经成功地监测脑血流量在特定的MCA分支,使用激光多普勒血流仪集中在一个的颅骨窗口(麦加AP 2009和2011年)通过观察大脑中动脉。此外,与硬脑膜阴刻类似的制剂可以使用血管活性化合物的局部给药,以创建一个在体内血管反应槽3。有几个因素应予以考虑。制备颅窗口,以便为这种技术减少了故障率。这些因素都与脑动脉取得了良好的可视化。首先,必须小心,使覆盖它的硬脑膜或血管骨瓣不会中断与钻头时创建的。这是最好的实现经常用无菌生理盐水清洗,以清除杂物和冷却的头骨。其次,骨片段应轻轻抬起时,它被删除。如果该片段不容易拉远,那么钻头应用于切去更多的骨质。最后,少量的血液或脑脊液颅窗口的外观在此过程中可以很容易地改变。的去骨瓣执行提供在颅骨上的开口,是大于所需的可视化。因此,很容易将在从属的外科手术部位,以防止流体从存积部的几个吸湿海绵。这些海绵是可以改变的,如果护理不妨碍外科手术工具的窗口。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

这项工作是支持由美国心脏协会大中华区东南亚联盟(09GRNT2060421),美国医学协会,并从大学的佛罗里达州的临床与转化科学研究所的资助。亚当麦加是一个NIH / NINDS,NRSA博士前研究员(F30 NS-060335)。高血压(T32 HL-083810)从佛罗里达州的多学科培训计划的大学,博士前奖学金罗伯特·Regenhardt收到支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inhalation anesthesia system VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA 901806
Isoflurane anesthetic Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA 1001936060
Small animal stereotaxic system David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 900
Non-rupture ear bars, rat David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 957
Rat gas anesthesia head holder David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 1929
BAT-12 microprobe thermometer World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 501254
Iris forceps World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 15915
Bulldog clamp retractors World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 14119-G
10 μl syringe 26-gaugue World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 500392
Rat tooth forceps 0.12 Stotz E1811
Micromotor drill Stoelting, Wood Dale, IL, USA 51449
0.8 mm round drill bur Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0 Oasis, Mettawa, IL, USA MV-663
Cotton swabs Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 22-029-488
Puralube eye ointment Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA NC0138063
Electric hair clippers Oster, Providence, RI, USA 78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS American Peptide, Sunnyvale, CA, USA 88-1-10A
Chlorhexidine, 2% Agrilabs, St. Joseph, MO, USA 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA Evolution xR6
Sony Handycam Sony, Minato, Tokyo, Japan HDR-SR12
Fiber optic illuminator TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA FO1–150
VLC media Player (Paris, France)
Image J software U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA

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References

  1. Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
  2. Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
  3. Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
  4. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  5. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).

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