बढ़ते Axons साथ murine श्वान सेल विकास का विश्लेषण

Neuroscience

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Summary

यहाँ हम एक श्वान (SC) सेल प्रवास परख में जो अनुसूचित जातियों के साथ का विस्तार axons विकसित करने में सक्षम हैं का वर्णन करता है.

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Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

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Abstract

परिधीय नसों का विकास एक पेचीदा प्रक्रिया है. न्यूरॉन्स axons बाहर भेजने के लिए विशिष्ट लक्ष्य है, जो इंसानों में अक्सर 100 से अधिक सेमी न्यूरॉन सोमा से दूर कर रहे हैं अंदर आना. विकास के दौरान अस्तित्व Neuronal लक्ष्य व्युत्पन्न वृद्धि कारकों पर भी श्वान कोशिकाओं (एससी) के समर्थन पर निर्भर करता है. Synapse या neuromuscular जंक्शन neuronal सोम (या केंद्रीय से परिधीय तंत्रिका तंत्र के संक्रमण) के क्षेत्र से यह अंत अनुसूचित जाति ensheath axons. श्वान कोशिकाओं तंत्रिका शिखा के डेरिवेटिव हैं और उभरते axons साथ व्यापारियों के रूप में विस्थापित जब तक पूरे अक्षतंतु अनुसूचित जातियों के साथ कवर किया जाता है. यह परिधीय तंत्रिका तंत्र के विकास के लिए अनुसूचित जाति के माइग्रेशन के महत्व को दर्शाता है और इस प्रक्रिया की जांच की आवश्यकता को रेखांकित. आदेश में अनुसूचित जाति के विकास का विश्लेषण करने के लिए, एक सेटअप की जरूरत है, जो अनुसूचित जातियों के लिए आगे भी उनके प्रवास के लिए शारीरिक सब्सट्रेट, अक्षतंतु शामिल. अंतर्गर्भाशयी विकास के कारण (mus मस्कुलस). इस नाकाम करने के लिए, हम बेहतर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि (एससीजी) explant तकनीक रूपांतरित किया. तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के साथ इलाज करने पर एससीजी explants axons बाद, अनुसूचित जाति axons साथ नाड़ीग्रन्थि से परिधि के लिए पलायन व्यापारियों द्वारा विस्तार. इस प्रणाली की खूबसूरती यह है कि अनुसूचित जाति अंतर्जात अनुसूचित जाति के एक पूल से प्राप्त कर रहे हैं और वे अपने स्वयं के शारीरिक axons है जो एक ही समय में बढ़ रहे हैं विस्थापित साथ. इस प्रणाली को विशेष रूप से पेचीदा है, क्योंकि axons साथ अनुसूचित जाति के विकास के समय चूक इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, आगे की संभावनाओं को खोलने के लिए अनुसूचित जाति प्रवास में अंतर्दृष्टि लाभ.

Protocol

1. कोलेजन जैल तैयार

  1. एक शेयर के माध्यम तैयार, 455 μl 10x सदस्य, 112 μl 7.5% 3 NaHCO, 50 μl glutamine और NaOH युक्त. एकाग्रता और NaOH की राशि चूहा पूंछ कोलेजन (1.2 देखें) तैयारी, स्टॉक +१००० μl मध्यम के अंतिम मात्रा पर निर्भर करता है.
  2. Ebendal (1) के अनुसार चूहे पूंछ कोलेजन तैयार. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजन समाधान स्टोर कोलेजन समाधान की गिरावट को देखा नहीं जा सकता है. एक नया बैच की तैयारी के बाद, NaOH शेयर माध्यम के लिए आवश्यक एकाग्रता (1.1 देखें) का अनुमान है. NaOH की राशि और एकाग्रता की अनुमापन के लिए माध्यम के पीएच सूचक का उपयोग करें. 800 μl अम्लीय कोलेजन चूहे पूंछ जब शेयर माध्यम के 210 μl के साथ मिश्रित करने के लिए लाल रंग का एक छाया बारी है. यदि NaOH की एकाग्रता बहुत कम है कोलेजन समाधान पीले रंग की बारी, मध्यम पीएच सूचक के कारण होगा. मध्यम और मिश्रण को ठेस बिना कोलेजन जोड़ेंबुलबुले ucing. बर्फ पर इन चरणों को पूरा करें. polymerization 2 घंटे के भीतर होता है के बाद कोलेजन समाधान और स्टॉक मध्यम मिलाया गया है और नए समाधान 37 डिग्री सेल्सियस में incubated है एक प्रयोग शुरू करने से पहले यह टेस्ट. 1.3) शेयर माध्यम के 210 μl (1.2 देखें) के साथ मिक्स कोलेजन समाधान के 800 μl. एक 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड के कुओं में इस समाधान के 100 μl. 37 में स्लाइड्स सेते डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और आर्द्र परिस्थितियों एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में. एक सेल संस्कृति बेंच और बाँझ शर्तों के तहत कोलेजन जैल तैयार. 2 घंटे के भीतर कोलेजन gelatinizes.

2. भ्रूण SCGs के विच्छेदन

  1. गर्भाशय से समय गर्भवती (E16-18) चूहों और उन्हें पीबीएस में रखने के लिए जब तक आगे की जरूरत के हार्वेस्ट भ्रूण.
  2. भ्रूणावरण से एक भ्रूण काटना. अक्षकीय स्तर के भ्रूण दुम का सिर काटना. एक सिलिकॉन नीचे पकवान पर "कीट सुइयों" के साथ सिर को ठीक करें. सिर के उदर पक्ष आप सामना करने के लिए एक हैआप अवअधोहनुज क्षेत्र को देखने के लिए होगा. नियतन आसान तैयारी के लिए सक्षम बनाता है.
  3. अवअधोहनुज बाएँ और दाएँ क्षेत्र की त्वचा निकालें और इसके साथ उप cutaneous संयोजी ऊतक.
  4. अपने स्थान से अवअधोहनुज लार ग्रंथियों को दूर करने के लिए कंठिका, infrahyoidal मांसपेशियों और sternocleidomastoid मांसपेशी पर दृश्य साफ.
  5. इन मांसपेशियों को सावधानी से निकालें गला और ट्रेकिआ पर दृश्य साफ. ट्रेकिआ और गला निकालें. मन्या धमनियों तो प्रेवेर्तेब्रल मांसपेशियों पर दोनों पक्षों पर दिखाई दे रहे हैं. एससीजी मन्या धमनियों के बंटवारे में स्थित है और एक अंडाकार आकार है. ध्यान ganglia हटाने और पीबीएस में उन्हें जगह. Ganglia धीरे विच्छेदन उपकरण से निकालें अगर वे उन से चिपके हुए हैं. यह करने के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक सुई एससीजी हटाने के लिए एक "कीट सुई" के साथ घुड़सवार धारक संदंश का उपयोग करने के लिए फायदेमंद है.
  6. पीबीएस में एक बार, कमरे के तापमान पर पीबीएस में ganglia जब तक आप enou dissected स्टोरgh ganglia. फिर रक्त वाहिकाओं और संयोजी ऊतक से ganglia साफ. एससीजी और एक विदारक एक लामिना का प्रवाह बेंच के तहत रखा खुर्दबीन के नीचे विच्छेदन सफाई प्रदर्शन.
  7. अंत में, gelatinized कोलेजन जैल पर सिरिंज आसान से निपटने के लिए एक सिरिंज पर घुड़सवार सुइयों की मदद साथ explanted ganglia जगह है.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में gelatinized कोलेजन पर एससीजी explants 5% सीओ 2 और आर्द्र परिस्थितियों के साथ सेते हैं.

3. एससीजी explants के उपचार

  1. 1-2 घंटा ऊष्मायन के बाद, 100 μl Neurobasal सेल संस्कृति B27 पूरक glutamine, और एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मध्यम के साथ एससीजी कोलेजन युक्त explant कवर. अब कक्ष स्लाइड्स के कुओं 200 μl (100 μl जेल और 100 μl मध्यम) का एक मात्रा में होते हैं. माध्यम की एक और 200 μl जोड़ें, लेकिन अब NGF (60 एनजी / एमएल) युक्त axonal विकास की सुविधा. तदनुसार अंतिम NGF एकाग्रता 30 एनजी / एमएल है.
    1. SC प्रवास की शुरुआत की जांच करने, अतिरिक्त कारकों सीधे 0 इन विट्रो (DIV0) में दिन में जोड़ने के लिए. डबल जरूरत एकाग्रता (2) में NGF युक्त मध्यम में कारकों भंग.
    2. क्रम में अनुसूचित जाति, जो पहले से ही axons साथ पलायन शुरू कर दिया है पर प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, DIV3 DIV4 (प्रयोग की संभावित बंद) जब तक अतिरिक्त कारकों जोड़ने. यह अंत करने के लिए, ध्यान से समाधान के 180 μl को हटा दें, DIV3 में, और 200 μl नई मध्यम युक्त NGF और डबल एकाग्रता (2) में ब्याज के अतिरिक्त कारकों जोड़ें.

4. समय चूक इमेजिंग

विश्लेषण के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. विभिन्न उद्देश्यों, इस्तेमाल किया जा सकता है, को देखने और बढ़ाई के क्षेत्र को परिभाषित. एक महत्वपूर्ण पहलू है, लेकिन इस्तेमाल के उद्देश्य से काम दूरी है, के रूप में एससीजी explants के इमेजिंग गिलास स्लाइड और कोलेजन के माध्यम से किया जाता हैजेल. 1/10-30 मिनट की रिकॉर्डिंग फ्रेम दर अच्छे परिणाम (2) से पता चला. हालांकि, इस पहलू वैज्ञानिक सवाल को समायोजित किया जा है. एक सामान्य सीसीडी कैमरा छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. समय चूक इमेजिंग के लिए एक सेल संस्कृति ऊष्मायन चैम्बर माइक्रोस्कोप के चरण के लिए संलग्न किया जा है. इमेजिंग के दौरान 5% सीओ 2 और आर्द्र परिस्थितियों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में ऊतक सेते हैं. इमेजिंग के शुरू होने से पहले ऊष्मायन प्रणाली एक घंटे से शुरू करो. यह चैम्बर स्लाइड सहित खुर्दबीन भागों (जैसे उद्देश्य) तापमान को समायोजित करने की अनुमति देता है और तापमान प्रेरित drifts रोकता है. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर की मदद और एक सॉफ्टवेयर नियंत्रित एससीजी explants अलग लागू शर्तों के साथ - साथ विश्लेषण के लिए motorized चरण (multiposition सेटअप) के साथ विश्लेषण के विशिष्ट क्षेत्रों (explant पर भीतर और विभिन्न explants के बीच) को परिभाषित करें. समय चूक इमेजिंग wildtype के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक जानवरों से ऊतक ऊतक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(3) (GFP s100b) अनुसूचित जाति अनुसूचित अंकन. इमेजिंग fluorophores के लिए एक फ्लोरोसेंट रोशनी स्रोत micropscope सेटअप में लागू किया जाना है. मानक फिल्टर का प्रयोग करें.

5. SC प्रवास दूरी की मात्रा

  1. अंत बिंदु (DIV4 उदाहरण के लिए), 4% पीएफए ​​के साथ 3-4 घंटे के लिए चैम्बर स्लाइड में कोलेजन जैल तय कर लो. लगातार कोलेजन जैल पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 5 बार धो लो. (2) immunocytochemistry के लिए मानक प्रोटोकॉल लागू. यदि आप SCGs की तैयारी के लिए नए हैं, tyrosine hydroxylase के खिलाफ एक immunohistochemistry द्वारा सहानुभूति नाड़ीग्रन्थि (HI) catecholaminergic कोशिकाओं के लिए एक आम मार्कर के रूप में नाड़ीग्रन्थि की पहचान की पुष्टि. Immunohistochemistry के दौरान (प्राथमिक एंटीबॉडी के बाद), 24 अच्छी तरह प्लेटें, जो अधिक से अधिक मात्रा में है, जो जैल धोने के लिए फायदेमंद है explant युक्त कोलेजन जैल हस्तांतरण.
  2. Immunohistochemistry के बाद, गिलास स्लाइड पर ध्यान कोलेजन जैल जगह. सावधानी सेशेष समाधान निकालने और कोलेजन सूखी / दो आयामों के लिए हटना. यह दूरी (2) के आसान माप की अनुमति देता है. इस के बाद, नमूने माउंट.
  3. अंत में, फिजी (एनआईएच) सॉफ्टवेयर की मदद के साथ प्रवास दूरी को मापने के. यह अंत करने के लिए कोई विशेष plugins की जरूरत है. सुक्ष्ममापी में सही माप की अनुमति देने के लिए सही इमेजिंग मेटाडाटा और फिजी के तहत सेटिंग्स, छवि और बड़े पैमाने की जांच. फिजी भी उपयोग कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए.

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Representative Results

Axonal विकास NGF (4) (फिल्म योजना S1 चित्रा 1 योजना) के साथ इलाज पर explants एससीजी से की है. इस प्रक्रिया को आसानी से किसी भी उलटा माइक्रोस्कोप से दिखाई देता है और समय चूक इमेजिंग (S2 फिल्म) द्वारा पीछा किया जा सकता है. यदि एक वैज्ञानिक माउस भ्रूण से एससीजी विदारक के लिए नया है, हम दृढ़ता से एक सरल विरोधी tyrosine (ध) hydroxylase immunohistochemistry द्वारा तकनीक का सत्यापन की सलाह देते हैं. वें catecholaminergic न्यूरॉन्स (सहानुभूति न्यूरॉन्स इस मामले में) के लिए एक आम मार्कर है और करता भी लेबल axons (चित्रा 2B). इस तरह से axonal लंबाई इस प्रणाली (2) में विश्लेषण किया जा सकता है.

महत्वपूर्ण बात है, बाद axonal विकास को प्रेरित किया गया, पलायन कोशिकाओं की एक लहर (फिल्म S2 और S3) मनाया जा सकता है. पलायन कोशिकाओं S100 इम्युनो सकारात्मक SC (2) के रूप में मान्य किया गया. इसके अलावा एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन है, जो GFP मानव s10 के नियंत्रण के तहत0B प्रमोटर टुकड़ा (3) को सीधे लेबल SC (2) जनसंख्या (फिल्म S4 और S5) का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस ट्रांसजेनिक लाइन की मदद से इन प्रयोगों भी confocal या प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी (प्रदर्शन यहाँ नहीं) के साथ किया जा सकता है.

प्रवास के दौरान अनुसूचित जाति के विश्लेषण के लिए, हम एक कम axonal घनत्व (1 DIV3 और DIV4 ऊपर बंद चित्रा) और इस तरह विश्लेषण के क्षेत्र के प्रति एक अनुसूचित जाति की एक छोटी सी आबादी के साथ विश्लेषण के एक क्षेत्र को सलाह देते हैं. यह सबसे अच्छा संभावित जगह सेल आकारिकी और सेलुलर व्यवहार (फिल्म S3) देखने की सुविधा है.

SC प्रवास दूरी एक प्रयोग (DIV4 उदाहरण के लिए) के अंत में मापा जा सकता है. यह अंत करने के लिए DAPI परमाणु लेबलिंग प्रमुख अनुसूचित जाति नाभिक से निश्चित ऊतक और दूरी पर प्रदर्शन किया जा सकता है explant की सीमा (NIH सॉफ्टवेयर) फिजी (चित्रा 2 योजना और DAPI लेबलिंग) (2) की मदद से मापा जा सकता है.इसके अलावा अनुसूचित जाति प्रसार या अनुसूचित जाति मौत विश्लेषण किया जा सकता है. यह अंत immunohistochemistry के लिए pHH3 या सक्रिय कस्पासे 3 के लिए उदाहरण के लिए किया जा सकता है, mitotic या apoptotic कोशिकाओं की पहचान क्रमश: (2).

चित्रा 1
चित्रा 1: योजना समय पर एक explanted एससीजी (DIV0 - DIV4) से axonal वृद्धि दिखा. बी / सी: brightfield छवियों, समय चूक इमेजिंग DIV3 (बी) और DIV4 (सी) (पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी) एससीजी explant के एक क्षेत्र के निकट अप दिखा के दौरान दर्ज की गई.

चित्रा 2
चित्रा 2: योजना विस्तारित (ग्रे) axons, DIV3 और DIV4 (हल्का नीला) एक explanted एससीजी से हो साथ अनुसूचित जाति (नीला) दिखा. प्रवासन दूरी DAPI परमाणु लेबल नमूनों पर मापा जा सकता है प्रमुख अनुसूचित जाति के नाभिक से कई स्थानों पर explanted एससीजी की सीमा (सी) के लिए दूरी को मापने के द्वारा. TH immunohistochemistry (DIV4) अगर एक वैज्ञानिक विच्छेदन एससीजी के लिए नया है किया जाना चाहिए. एक सकारात्मक लेबलिंग स्पष्ट रूप से एक सहानुभूति नाड़ीग्रन्थि (बी) के रूप में explanted नाड़ीग्रन्थि को पहचानती है. TH immunohistochemistry भी explanted SCGs से हो axons की विश्लेषण में सक्षम बनाता है.

मूवी S1. योजना इन विट्रो में कई दिनों में एक explanted एससीजी से axonal वृद्धि दिखा. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी S2 Axonal और एक NGF से अनुसूचित जाति के प्रवास विकास explant एससीजी का इलाज किया. इमेजिंग Div2 पर शुरू कर दिया. रिकॉर्डिंग फ्रेम दर / 30 1 मिनट था. स्केल - बार = 100 सुक्ष्ममापी. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

ntent "> मूवी S3. एक एससीजी explant के एक परिधीय क्षेत्र के ऊपर एक कम axonal घनत्व एकल SC आसानी से विश्लेषण कर सकते हैं. जा इमेजिंग शुरू DIV3 थी. रिकॉर्डिंग फ्रेम दर / 10 1 मिनट था. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी के कारण बंद है. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी S4. Brightfield और प्रतिदीप्ति संयोजन S100 GFP सकारात्मक अनुसूचित जातियों और axons के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. रिकॉर्डिंग फ्रेम दर / 10 1 मिनट था. स्केल - बार = 100 सुक्ष्ममापी. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

S5 मूवी एक एससीजी explant के सीमा पर अनुसूचित जाति के प्रवास. यहाँ केवल प्रतिदीप्ति चैनल S100 GFP सकारात्मक अनुसूचित जातियों के लिए आसान व्याख्या सक्षम दिखाया गया है. रिकॉर्डिंग फ्रेम दर / 10 1 मिनट था. स्केल - बार = 100 सुक्ष्ममापी./ 50016/50016movieS5.avi "लक्ष्य ="> _blank "फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

परिधीय तंत्रिका तंत्र के विकास के लिए एक रोमांचक प्रक्रिया है. जब विकास पूरा हो गया है, axons पूरी लंबाई, है, जो मनुष्यों में अक्सर 100 सेमी से अधिक के साथ अनुसूचित जातियों द्वारा ensheathed कर रहे हैं. यह अंत करने के लिए आवश्यक अनुसूचित जातियों की सही संख्या के लिए विकास के दौरान स्थापित किया गया है और अनुसूचित जातियों को भी करने के लिए साथ विस्तार axons परिधि पूरा axonal कवरेज सुनिश्चित करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए किया है. यह लेकिन यह भी myelinated के लिए unmeylinated axons के लिए सच है. दोनों ही मामलों में सभी axons अनुसूचित जातियों के साथ संपर्क में हैं और उनके समर्थन पर निर्भर करते हैं. अनुसूचित जाति के विकास का अध्ययन करने के लिए, assays की जरूरत है जो खाते में axonal डिब्बे ले और इसलिए खरोंच assays की तुलना में एक बेहतर हद तक (5) vivo विकास में नकल, Boyden (6) assays या कक्ष assays कर सकते हैं. कुछ assays में axonal डिब्बे खाते में पहले से ही लिया गया था. उदाहरण के लिए sciatic नसों के वर्गों मार्गों के रूप में अनुसूचित जातियों के लिए इस्तेमाल किया गया माइग्रेट करने केसाथ (7, 8), अनुसूचित जातियों या न्यूरॉन्स axons जिसके साथ वे माइग्रेट मनाया गया (9) के साथ सह - सुसंस्कृत थे.

एससीजी explant SC प्रवास परख, तथापि, भी अधिक लाभ है. यह विशेष रूप से दिलचस्प है क्योंकि अनुसूचित जातियों को अपने स्वयं के शारीरिक axons के साथ विकसित कर रहे हैं, और इन कर रहे हैं खुद को अभी भी बढ़ रहा है. इसके अलावा तकनीक जानने के लिए आसान है और केवल तकनीकी विच्छेदन कौशल की एक बिट की आवश्यकता है और न्यूरॉन्स और अनुसूचित जातियों की एक जटिल प्रणाली सह संस्कृति की आवश्यकता नहीं है. एक काफी समान सेटअप है, लेकिन प्रयोग नहीं, बल्कि SCGs DRGs Gumy और उनके सहयोगियों ने (10) द्वारा प्रस्तावित किया गया था. हालांकि, ऐसे परख की पूर्ण संभावनाओं का दोहन करने के लिए, एक उलटा माइक्रोस्कोप सेटअप समय चूक इमेजिंग सक्रिय करने की जरूरत है. यह महत्वपूर्ण है कि "बहु स्थिति प्रयोगों" करने की संभावना है, ताकि differentially इलाज एससीजी explants, एक चैम्बर स्लाइड में स्थित का विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए एक ही समय में,समय, की ओर से इष्टतम नियंत्रण पक्ष के साथ ब्याज (2) के कारकों के साथ काम करने को सक्षम करने से. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए हम केवल पारंपरिक प्रकाश और पारंपरिक (GFP चूहों ट्रांसजेनिक s100b) प्रतिदीप्ति का इस्तेमाल किया. तकनीक, हालांकि, यह भी आसानी से confocal या भी प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी (प्रदर्शन यहाँ नहीं) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. समय चूक रिकॉर्डिंग माइग्रेशन के दौरान विशिष्ट सेलुलर गुण / व्यवहार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अब तक केवल wildtype और ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया गया है (2). हालांकि, अनुसूचित जातियों और आरएनएआई के साथ जिससे रास्ते में से एक उदाहरण के लिए परिवर्तन के अभिकर्मक संभव होना चाहिए. इस तकनीक के साथ यह भी संभव हो सकता है एक या पड़ोसी अक्षतंतु पर सामान्य और बदल अनुसूचित जाति के अनुसूचित जाति अक्षतंतु परस्पर क्रिया का विश्लेषण कर सकता है. प्रवास दूरी, अनुसूचित जाति प्रसार और अनुसूचित जाति के अस्तित्व के बारे में, अंत बिंदु विश्लेषण आसानी DAPI परमाणु लेबलिंग और फिजी सॉफ्टवेयर (एनआईएच) के साथ immunohistochemistry द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. हालांकि, अंत में भी जीवन - रेपोप्रसार (11) और कोशिका मृत्यु (12, 13) के लिए rter, इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे इमेजिंग के दौरान प्रत्यक्ष readout सक्षम.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एक कोलेजन प्रोटोकॉल और Jutta मरनेवाला और उर्सुला Hinz साझा करने के लिए Urmas Arumae शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. इसके अलावा हम ईसाई एफ Ackermann, उल्रिके Engel और Nikon इमेजिंग सेंटर हीडलबर्ग विश्वविद्यालय में और भी Joachim Kirsch कृपया वीडियो shoting के लिए मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. काम आंशिक रूप से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (592 SFB) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

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References

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6, (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24, (49), 10999-11009 (2004).
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Comments

2 Comments

  1. There's a problem with recommending this page, please help. Thanx

    Reply
    Posted by: Muhammed A.
    November 26, 2012 - 2:49 AM
  2. Dear Muhammed,
    sorry, but I do not exactly get what you mean by recommending. Are you not able to see the content?
    best, Stephan

    Reply
    Posted by: stephan h.
    November 30, 2012 - 4:24 AM

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