ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הפיתוח של עצבים היקפיים הוא תהליך מרתק. הנוירונים שולחים אקסונים לinnervate מטרות ספציפיות, אשר בבני אדם הן לעתים קרובות במרחק יותר מ 100 סנטימטרים מסומה של תא העצב. הישרדות עצבית במהלך התפתחות תלויה בגורמי גדילה המופקים מהיעד, אלא גם על התמיכה של תאי שוואן (SCS). לאקסונים קצה זה SC ensheath מאזור סומה העצבית (או המעבר ממרכז למערכת עצבים היקפית) לסינפסה או צומת neuromuscular. תאי שווא הם נגזרים של הרכס העצבי ונודדים כמבשרים לאורך האקסונים המתפתחים עד שכל האקסון מכוסה בSCS. זה מראה את החשיבות של SC הגירה להתפתחות מערכת העצבים ההיקפית ומדגיש את הצורך לחקור את התהליך הזה. על מנת לנתח את SC פיתוח, התקנה יש צורך שליד SCS כולל גם המצע שלהם הפיזיולוגי להגירה, לאקסון. בשל התפתחות תוך רחמית (mus musculus). כדי לעקוף את זה, התאמן גנגליון טכניקת צוואר הרחם המעולה (SCG) explant. לאחר הטיפול בגורם גדילה עצבי (NGF) explants SCG להאריך האקסונים, ואחרי מבשרי SC הנודדים לאורך האקסונים מגנגליון לפריפריה. היופי של שיטה זו הוא שSC נגזר מברכה של SC אנדוגני ושהם נודדים לאורך האקסונים הפיסיולוגיים שלהם שצומחים באותו הזמן. מערכת זו היא מעניינת במיוחד, משום שפיתוח SC לאורך האקסונים יכול להיות מנותח על ידי הדמית זמן לשגות, פתיחת אפשרויות נוספות כדי לקבל תובנה לתוך הגירת SC.

Protocol

1. הכנת ג'לי קולגן

  1. הכן בינוני מניות, המכיל 455 MEM μl 10x, 3 112 μl 7.5% NaHCO, גלוטמין μl 50 וNaOH. הריכוז וכמות NaOH תלוי בהכנת עכברוש זנב קולגן (ראה 1.2), הנפח הסופי של מדיום המנייה להיות μl 1000.
  2. הכן קולגן עכברוש זנב פי Ebendal (1). אחסן את פתרון קולגן ב 4 ° C. שפלה של קולגן הפתרון לא יכולה להיות שנצפתה. לאחר ההכנה של קבוצה חדשה, להעריך את ריכוז NaOH דרוש למדיום המניות (ראה 1.1). השתמש כאינדיקטור של pH של המדיום לטיטרציה של הכמות והריכוז של NaOH. 800 קולגן חומצי μl עכברוש זנב צריך להפוך גוון אדום כאשר מעורבב עם 210 μl של מדיום המניות. אם הריכוז של NaOH הוא נמוך מדי פתרון קולגן יהפוך צהוב, בשל מדד החומציות של המדיום. הוסף קולגן לבינוני ומערבבים ללא לדרבןucing בועות. בצע את השלבים הבאים על קרח. פילמור מתרחש בתוך 2 שעות לאחר פתרון קולגן ובינוני המנייה היו מעורבים והפתרון החדש הודגרו ב 37 ° C. בדיקה זו לפני תחילת ניסוי. 1.3) מערבבים 800 μl של פתרון קולגן עם μl 210 מתוך מניות בינוניות (ראה 1.2). 100 μl המקום של פתרון זה בבארות של שקופיות קאמריות 8 היטב. דגירת השקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ותנאי לחות בתא תרבות חממה. הכן את ג'לי קולגן תחת ספסל תרבית תאים ותנאים סטריליים. קולגן gelatinizes בתוך 2 שעות.

2. נתיחה של SCGs העוברי

  1. עוברים של עכברי קציר זמן הריון (E16-18) מהרחם ולשמור אותם בPBS, עד לביצוע הנדרש.
  2. לנתח שעוברים אחד מamnion. לערוף את זנב העובר של רמת clavicular. תקן הראש על צלחת תחתית סיליקון עם מחטים "חרקים". צד הגחון של הראש יש לך להתמודדד יש לך לראות את אזור הלסת התחתון. הקיבעון מאפשר הכנה קלה יותר.
  3. הסר את העור באזור הלסת התחתון ימינה ושמאלה ועימו רקמת חיבור תת עורית.
  4. הסר את בלוטות רוק הלסת תחתונות מהמיקום שלהם כדי לנקות את התצוגה על גבי הלשון ו, שרירי infrahyoidal ושרירי sternocleidomastoid.
  5. הסר את השרירים האלה בזהירות כדי לנקות את התצוגה על הגרון וקנה נשימה. הסר את קנה הנשימה והגרון. עורקי הראש הם אז גלויים משני הצדדים על שרירי prevertebral. SCG ממוקם בהסתעפות של עורקי הראש ויש צורת אליפסה. מוציא בזהירות את הגרעינים ולמקם אותם בערוץ המדע. הסר את הגרעינים בעדינות מכלי הנתיחה אם הם דבוקים אליהם. זה מועיל כדי להשתמש במלקחיים וכן מחזיק מחט רכובה עם "מחט חרק" להסרת SCG.
  6. פעם ב PBS, לאחסן גרעינים בטמפרטורת החדר בPBS עד שנתחת enouגרעיני gh. ואז לנקות את הגרעינים מכלי דם ורקמות חיבור. לבצע נתיחה וניקוי SCG תחת מיקרוסקופ לנתח תחת ספסל זרימה למינרית.
  7. לבסוף, מקם גרעיני explanted על גבי ג'לי קולגן gelatinized בעזרת מחטי מזרק רכובים על מזרק לטיפול קל יותר.
  8. דגירת explants SCG על קולגן gelatinized בתא תרבות חממה על 37 מעלות צלזיוס, עם CO 2 ולחים תנאי 5%.

3. טיפול בexplants SCG

  1. לאחר הדגרת 1-2 שעות, לכסות קולגן המכיל explant SCG עם מדיום 100 μl Neurobasal תא התרבות המכיל תוסף B27, גלוטמין ואנטיביוטיקה. עכשיו את הבארות של השקופיות הקאמריות מכילות נפח של 200 μl (ג'ל 100 μl ובינוני μl 100). הוסף 200 μl אחר של המדיום, אולם בה עכשיו NGF (60 ng / ml) כדי להקל על צמיחת אקסונלית. בהתאם לריכוז NGF הסופי הוא 30 ng / ml.
    1. כדי לחקור את ההתפרצות של SC הגירה, להוסיף גורמים נוספים ישירות ביום במבחנת 0 (DIV0). ממס את הגורמים במדיום המכיל NGF בריכוז הכפול צורך (2).
    2. על מנת לנתח את ההשפעה על SCS, שכבר נכתב על הנדידה לאורך האקסונים, להוסיף גורמים נוספים בDIV3 עד DIV4 (תחנת פוטנציאל של הניסוי). לשם כך, להסיר בזהירות 180 μl של הפתרון, בDIV3, ולהוסיף NGF 200 μl החדש בינוני מכיל וגורמים הנוספים של ריבית בריכוז הכפול (2).

4. הדמית זמן לשגות

השתמש במיקרוסקופ הפוך לניתוחים. יעדים שונים ניתן להשתמש, מגדיר את שדה הראיה והגדלה. היבט חשוב אחד, עם זאת, הוא מרחק העבודה של המטרה בשימוש, כמו הדמיה של explants SCG מתבצעת באמצעות שקופית הזכוכית וקולגןג'ל. במסגרת שיעור ההקלטה של 1/10-30 דקות הראתה תוצאות טובות (2). עם זאת, היבט זה צריך להיות מותאם לשאלה המדעית. מצלמת CCD רגילה יכולה לשמש לרכישה של תמונה. לזמן לשגות הדמית תא דגירת תרבות תא יש שיצורף לשלב של המיקרוסקופ. דגירת הרקמה במהלך הדמיה על 37 מעלות צלזיוס, עם CO 2 ולחים תנאי 5%. התחל שעה אחת מערכת הדגירה לפני תחילת ההדמיה. זה מאפשר את חלקי מיקרוסקופ (אובייקטיבי למשל) כולל שקופיות הקאמריות להסתגל לטמפרטורה ומונע מרחף טמפרטורה מושרה. להגדיר אזורים ספציפיים של ניתוחים (בתוך בexplant ובין explants השונה) עם העזרה של תוכנת מיקרוסקופ ושלב תוכנת שליטה ממונעת (התקנת מספר מיקומים) עבור ניתוחים בו זמניים של תנאים מיושמים שונים לexplants SCG. לרקמת זמן לשגות הדמית wildtype כמו גם רקמות מבעלי חיים מהונדסים יכול לשמשסימון SCS (s100b: GFP) (3). לfluorophores הדמית מקור אור ניאון צריך להיות מיושם בהתקנת micropscope. השתמש במסננים סטנדרטיים.

5. כימות של מרחקי SC הגירה

  1. בנקודת הסיום (DIV4 למשל), לתקן את ג'לי קולגן עם 4% PFA בשקופית החדר לשעתי 3-4. רצף לשטוף את ג'לי קולגן 5 פעמים למשך 10 דקות עם PBS. החל פרוטוקולים סטנדרטיים לimmunocytochemistry (2). אם אתה חדש להכנת SCGs, לאמת את הזהות של גנגליון כגנגליון אוהד ידי אימונוהיסטוכימיה נגד hydroxylase טירוזין (TH) סמן משותף לתאי catecholaminergic. במהלך אימונוהיסטוכימיה (לאחר הנוגדן הראשוני), להעביר את ג'לי קולגן המכיל explant ל 24 גם צלחות, שיש נפח גדול יותר, שהוא מועיל לשטיפה בג'לי.
  2. לאחר אימונוהיסטוכימיה, למקם את ג'לי קולגן בזהירות על שקופיות זכוכית. זהירותלהסיר את הפתרון שנותר ולתת לקולגן לייבש / להתכווץ לשני ממדים. זה מאפשר מדידות קלות של מרחקים (2). אחרי זה, יעלה את הדגימות.
  3. לבסוף, למדוד מרחקי נדידה עם העזרה של תוכנת פיג'י (NIH). לא נמצא תוספים מיוחדים דרושים למטרה זו. כדי לאפשר למידות נכונות במיקרומטר, בדוק את מטה הנכונים הדמיה ואת ההגדרות תחת פיג'י, תמונה וקנה המידה. השתמש בפיג'י גם לכימות של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צמיחת axonal היא הקל מSCG explants על טיפול עם NGF (4) (מזימת סרט ערכת S1 איור 1). תהליך זה נראה בקלות על ידי כל מיקרוסקופ הפוך ויכול להיות מלווה בזמן לשגות הדמיה (סרט S2). אם מדען הוא חדש לביתור SCG מעוברי עכברים אנו ממליצים אימות של הטכניקה על ידי hydroxylase אנטי טירוזין פשוט (TH) אימונוהיסטוכימיה. TH הוא סמן שכיח לנוירונים catecholaminergic (במקרה זה נוירונים סימפטים) ועושה גם אקסונים תווית (איור 2 ב '). בדרך זו אורכי axonal ניתן לנתח בשיטה זו (2).

חשוב מכך, לאחר צמיחת axonal הוצמחה, גל של תאים נודדים ניתן לראות (סרט S2 ו S3). תאים נודדים היו תוקף S100 החיסוני החיובי SC (2). בנוסף קו עכבר מהונדס, שבי GFP הוא תחת שליטתו של אדם S10בר האמרגן 0b (3) יכול לשמש ישירות לנתח אוכלוסיית שכותרת SC (2) (הסרט S4 וS5). בעזרתו של קו מהונדס זה הניסויים האלה יכולים גם להתבצע עם מיקרוסקופיה confocal גיליון או אור (לא בצע כאן).

לניתוחים של SC במהלך הנדידה, אנו ממליצים על שטח של ניתוח עם צפיפות נמוכה אקסונלית (איור 1 התקריב DIV3 וDIV4) ובכך אוכלוסייה קטנה של SC לאזור הניתוח. זה מקל על האפשרויות הטובות ביותר לראות מורפולוגיה תא והתנהגות סלולרית (S3 סרטים).

מרחקי SC הגירה ניתן למדוד בסוף הניסוי (למשל DIV4). לשם כך תיוג גרעיני DAPI יכול להתבצע על רקמה ומרחקים קבועים מגרעיני SC המובילים לגבול של explant ניתן למדוד בעזרת פיג'י (NIH תוכנה) (2 תכנית האיור וDAPI תיוג) (2).בנוסף גם ניתן לנתח SC התפשטות או מות SC. לשם כך אימונוהיסטוכימיה לpHH3 או להופעל 3 caspase יכול להתבצע לדוגמה, זיהוי המיטוטי או תאים אפופטוטיים בהתאמה (2).

איור 1
איור 1:. תכנית מראה צמיחת axonal מSCG explanted לאורך הזמן (DIV0-DIV4). B / C: תמונות brightfield, נרשמו במהלך הדמית זמן לשגות מראה תקריב של אזור אחד של explant SCG בDIV3 (B) וDIV4 (ג) (בהיקף של בר = 100 מיקרומטר).

איור 2
איור 2:. תכנית מראה SC (כחול) לאורך האקסונים מורחבים (אפור), גדלו מ SCG explanted (אור הכחול) ובDIV3 DIV4. מרחקי הגירה ניתן למדוד על דגימות DAPI הגרעיני שכותרת- על ידי מדידת המרחק מהגרעין של SC מוביל לגבול של SCG explanted במקומות רבים (C). TH אימונוהיסטוכימיה (DIV4) צריכה להתבצע אם מדען הוא חדש SCG נתיחה. תיוג חיובי מזהה בבירור גנגליון explanted כגנגליון סימפתי (B). אימונוהיסטוכימיה TH גם מאפשרת ניתוח של אקסונים גדלו מ SCGs explanted.

S1 קולנוע. תכנית מראה צמיחת axonal מSCG explanted על פני כמה ימים במבחנה. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט צמיחת S2. Axonal והגירת SC מNGF טופלו SCG explant. ההדמיה החלה בDIV2. במסגרת שיעור הקלטה הייתה דקות 1/30. קנה מידה בר = 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

ntent "S3> סרטים. התקריב של אזור היקפי של explant SCG. בשל צפיפות נמוכה axonal הבודד SC קלות ניתן לנתח. תחילת ההדמיה הייתה DIV3. מסגרת שיעור ההקלטה היה דקות 1/10. סולם בר = 100 מיקרומטר . לחץ כאן לצפייה בסרט.

S4 סרט. שילוב של brightfield ופלואורסצנטי מאפשר הדמיה של SCS S100 GFP החיובי ואקסונים. במסגרת שיעור הקלטה הייתה דקות 1/10. קנה מידה בר = 100 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט S5. הגירת SC בגבול explant SCG. כאן רק ערוץ פלואורסצנטי מוצג מאפשר פרשנות קלה של SCS החיובי S100-GFP. במסגרת שיעור הקלטה הייתה דקות 1/10. קנה מידה ברה = 100 מיקרומטר."Target =" / 50016/50016movieS5.avi _blank "> לחץ כאן לצפייה בסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התפתחותה של מערכת העצבים ההיקפית היא תהליך מרתק. כאשר הפיתוח יושלם, אקסונים הensheathed ידי SCS לאורך כל האורך, אשר יכול, בבני אדם, לעתים קרובות יהיה מעל 100 סנטימטר. לצורך כך את המספר הנכון של SCS הנדרש יש שיוקם במהלך הפיתוח וSCS גם צריך לנוע לאורך האקסונים מתארכים לפריפריה כדי להבטיח כיסוי מלא אקסונלית. זה נכון גם לגבי אקסונים unmeylinated myelinated אלא גם ל. בשני המקרים כל האקסונים נמצאים בקשר עם SCS ותלוי בתמיכתם. ללמוד פיתוח SC, מבחנים דרושים שייקחו את תא אקסונלית בחשבון ולכן לחקות בפיתוח vivo למידה טובה יותר ממבחני גירוד (5), מבחני Boyden (6) או מבחנים קאמריים יכולים לעשות. במבחנים מסוימים תא axonal נלקח בחשבון כבר. לדוגמא סעיפים של עצבי sciatic שמשו כמסלולים לSCS להגריחד (7, 8), או SCS היה שיתוף תרבותי עם הנוירונים לאורך האקסונים שהם נצפו להגר (9).

Assay SCG explant SC ההגירה, לעומת זאת, יש גם יתרונות נוספים. זה מעניין במיוחד בגלל SCS מתפתחים לאורך האקסונים הפיסיולוגיים שלהם, ואלה הם עצמם עדיין גדלו. יתר על כן הטכניקה קלה ללימוד ודורשת רק מעט כישורי נתיחה טכניים ואינו דורשת מערכת שיתוף תרבות מורכבת של תאי עצב וSCS. התקנה דומה למדי, אך לא באמצעות SCGs אלא DRGs, הוצעה על ידי Gumy ועמיתים (10). עם זאת, כדי לנצל את האפשרויות המלאות של בדיקה כזו, התקנת מיקרוסקופ הפוכה יש צורך מאפשרת הדמית זמן לשגות. חשוב יש את האפשרות לעשות "ניסויים רבה עמדה", כדי להיות מסוגל לנתח explants טופל באופן דיפרנציאלי SCG, הממוקם בשקופית קאמרית, באותוזמן, מה שמאפשר עבודה עם צד שולט אופטימלי על ידי צד עם הגורמים בעלי עניין (2). למנתח הייתי אור וקונבנציונלי פלואורסצנטי הקונבנציונלי (למהונדס s100b: GFP עכברים) רק מיקרוסקופיה. טכניקה, לעומת זאת, יכולה גם לשמש בקלות עם מיקרוסקופיה confocal גיליון, או אפילו אור (לא בצע כאן). הקלטות זמן לשגות יכולות לשמש כדי לזהות את המאפיינים סלולריים ספציפיים / התנהגויות במהלך נדידה. עד כה עכברים מהונדסים wildtype ורק היו בשימוש (2). עם זאת, transfection של SCS וכך שינוי של מסלולים עם RNAi לדוגמה צריך להיות ריאלי. בעזרת טכניקה זו את זה אפילו יכול להיות אפשרי לנתח את יחסי גומלין SC-האקסון של SC הרגיל ושינה באותו או שכן האקסון. לגבי מרחקי הגירה, SC הפצה והישרדות SC, ניתוחי נקודת סיום יכולים להתבצע בקלות על ידי אימונוהיסטוכימיה עם DAPI הגרעיניים תיוג ותוכנת פיג'י (NIH). עם זאת, סופו של דבר אפילו חיים ריפהrter עבור הפצה (11) ומוות של תאים (12, 13) יכול לשמש, ובכך מאפשר readout ישיר במהלך ההדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

אנו רוצים להודות Arumae Urmas לשיתוף קולגן פרוטוקול ויוטת פיי ואורסולה Hinz לקבלת סיוע טכני מעולה. כמו כן אנחנו רוצים להודות לכריסטיאן פ אקרמן, אולריקה אנגל וניקון מרכז ההדמיה באוניברסיטת היידלברג וגם יואכים קירש לחביבות לעזור לshoting הווידאו. העבודה מומנה באופן חלקי באמצעות Forschungsgemeinschaft דויטשה (SFB 592).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6, (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24, (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46, (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34, (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181, (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16, (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37, (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133, (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Comments

2 Comments

  1. There's a problem with recommending this page, please help. Thanx

    Reply
    Posted by: Muhammed A.
    November 26, 2012 - 2:49 AM
  2. Dear Muhammed,
    sorry, but I do not exactly get what you mean by recommending. Are you not able to see the content?
    best, Stephan

    Reply
    Posted by: stephan h.
    November 30, 2012 - 4:24 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics