Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

Neuroscience

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Summary

Aquí se describe una célula de Schwann (CS) ensayo de migración en el que las SC son capaces de desarrollar a lo largo de los axones se extienden.

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Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

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Abstract

El desarrollo de los nervios periféricos es un proceso intrigante. Las neuronas envían axones inervan a los objetivos específicos, que en los seres humanos son a menudo más de 100 cm de distancia del soma de la neurona. La supervivencia neuronal durante el desarrollo depende de factores de crecimiento derivados de meta-, sino también sobre el soporte de las células de Schwann (SCS). Para este axones ensheath finales SC de la región del soma neuronal (o la transición de la central en el sistema nervioso periférico) a la sinapsis o unión neuromuscular. Células de Schwann son derivados de la cresta neural y migran como precursores a lo largo de los axones emergentes hasta el axón está cubierto con SCS. Esto muestra la importancia de la SC de migración para el desarrollo del sistema nervioso periférico y subraya la necesidad de investigar este proceso. Con el fin de analizar SC desarrollo, una configuración que se necesita al lado de los SCS también incluye su sustrato fisiológico para la migración, el axón. Debido al desarrollo intrauterino (Mus musculus). Para evitar esto, hemos adaptado el superior ganglio cervical (SCG) Técnica de explante. Tras el tratamiento con factor de crecimiento nervioso (NGF) explantes SCG extender axones, seguido de precursores SC migran a lo largo de los axones del ganglio de la periferia. La belleza de este sistema es que el SC se derivan de una piscina de SC endógeno y que migran a lo largo de sus axones propios fisiológicos que están creciendo, al mismo tiempo. Este sistema es especialmente interesante, ya que el desarrollo SC largo de los axones pueden ser analizados por time-lapse, abriendo nuevas posibilidades para obtener información sobre la migración SC.

Protocol

1. Preparación de geles de colágeno

  1. Preparar un medio de acción, que contiene 455 l MEM 10x, 112 l 7,5% NaHCO 3, 50 y glutamina l NaOH. La concentración y la cantidad de la solución de NaOH depende de la preparación de colágeno de cola de rata (ver 1,2), el volumen final del medio de archivo de ser 1.000 l.
  2. Preparar colágeno de cola de rata de acuerdo con Ebendal (1). Almacenar la solución de colágeno a 4 ° C. Una degradación de la solución de colágeno no se puede observar. Después de la preparación de un nuevo lote, estimar la concentración de NaOH necesaria para el medio de almacén (ver 1,1). Utilice el indicador de pH del medio para la valoración de la cantidad y la concentración de NaOH. 800 l ácido de cola de rata colágeno tiene a su vez un tono de rojo cuando se mezcla con 210 l de la media de valores. Si la concentración de NaOH es demasiado baja, la solución de colágeno se volverá amarilla, debido a que el indicador de pH del medio. Añadir el colágeno al medio y se mezcla sin producing burbujas. Realice estos pasos en el hielo. La polimerización se produce dentro de 2 horas después de la solución de colágeno y el medio de archivo se han mezclado y la nueva solución se incuba a 37 ° C. Pruebe esto antes de comenzar el experimento. 1,3) Mezclar 800 l de solución de colágeno con l 210 de media de valores (ver 1.2). Place 100 l de esta solución en los pocillos de una diapositiva cámara 8 también. Incubar los portas a 37 ° C, 5% de CO 2 y condiciones de humedad en una incubadora de cultivo celular. Preparar los geles de colágeno bajo un banco de cultivo celular y las condiciones estériles. El colágeno gelatiniza dentro de 2 h.

2. Disección de SCG embrionarias

  1. Cosecha embriones de ratones preñados de tiempo (E16-18) desde el útero y los mantienen en PBS hasta que se necesita más.
  2. Disecciona un embrión desde el amnios. Decapita el caudal del embrión nivel clavicular. Fijar la cabeza en una bandeja inferior de silicio con "insecto-agujas". El lado ventral de la cabeza tiene que enfrentarse a usted unad que tiene que ver la región submandibular. La fijación permite una preparación más fácil.
  3. Quitar la piel de la región submandibular izquierda y derecha, y con ella el tejido conectivo subcutáneo.
  4. Retire las glándulas salivales submandibulares de su ubicación para despejar la vista hacia el hioides, los músculos infrahyoidal y el músculo esternocleidomastoideo.
  5. Retire con cuidado estos músculos para borrar la vista hacia la laringe y la tráquea. Eliminar la tráquea y la laringe. Las arterias carótidas son entonces visible por ambos lados en los músculos prevertebral. El SCG se encuentra en la bifurcación de las arterias carótidas y tiene una forma oval. Retire con cuidado los ganglios y colocarlos en PBS. Retire los ganglios suavemente de las herramientas de disección si se adhieran a ellos. Es beneficioso el uso de fórceps, así como un soporte de aguja montada con una "aguja insecto" para la eliminación SCG.
  6. Una vez en PBS, los ganglios almacenar a temperatura ambiente en PBS hasta que se diseccionaron enoulos ganglios de la GH. A continuación, limpie los ganglios de los vasos sanguíneos y tejido conectivo. Realizar la disección de SCG y la limpieza bajo un microscopio de disección coloca bajo una cabina de flujo laminar.
  7. Finalmente, colocar los ganglios explantados en los geles de colágeno gelatinizados con la ayuda de agujas de jeringa montada en una jeringa para un manejo más fácil.
  8. Incubar los explantes CGS en el colágeno gelatinizado en una incubadora de cultivo celular a 37 º C, con condiciones de 5% de CO 2 y húmedo.

3. El tratamiento de los explantes de SCG

  1. Después de 1-2 horas de incubación, el colágeno cubrir explante SCG que contiene 100 l con medio Neurobasal cultivo celular que contenía suplemento B27, glutamina y antibióticos. Ahora los pocillos de los portaobjetos de cámara de contener un volumen de 200 l (100 gel l y 100 l medio). Añadir otra l 200 del medio, sin embargo, ahora que contiene NGF (60 ng / ml) para facilitar el crecimiento axonal. En consecuencia, la concentración de NGF final es 30 ng / ml.
    1. Para investigar la aparición de SC migración, añadir factores adicionales directamente en días in vitro 0 (DIV0). Disolver los factores en el medio que contiene NGF en la concentración necesaria doble (2).
    2. Con el fin de analizar el impacto en la SC, que ya comenzaron a emigrar a lo largo de los axones, agregan factores adicionales en DIV3 hasta DIV4 (parada potencial del experimento). Con este fin, retirar cuidadosamente 180 ml ​​de la solución, en DIV3, y añadir 200 l NGF medio nuevo que contenía y los factores adicionales de interés en la concentración doble (2).

4. Time-lapse de imágenes

El uso de un microscopio invertido para los análisis. Objetivos pueden utilizar diversos, definir el campo de visión y la ampliación. Un aspecto importante, sin embargo, es la distancia de trabajo del objetivo utilizado, como formación de imágenes de los explantes SCG se realiza a través de la lámina de vidrio y el colágenogel. La velocidad de grabación de 1/10-30 minutos mostró buenos resultados (2). Sin embargo, este aspecto tiene que ser ajustado a la pregunta científica. Un normal cámara CCD puede ser utilizado para la adquisición de imágenes. Para una imagen en tiempo lapso de un cultivo celular cámara de incubación tiene que ser unida a la platina del microscopio. Incubar el tejido durante la formación de imágenes a 37 ° C, con condiciones de 5% de CO 2 y húmedo. Iniciar el sistema de incubación de una hora antes del inicio de formación de imágenes. Esto permite que las partes de microscopio (por ejemplo objetivo), incluyendo la cámara de diapositivas para ajustar a la temperatura y evita las derivas de temperatura inducidas. Definir áreas específicas de análisis (en el explante y entre diferentes explantes) con la ayuda del software del microscopio y una etapa motorizada controlada por software (configuración multiposición) para análisis simultáneos de diferentes condiciones aplicadas a los explantes de SCG. Para el tiempo de imágenes a intervalos de tejido de tipo salvaje así como el tejido de los animales transgénicos se pueden utilizarmarcando el SCS (S100B: GFP) (3). Para fluoróforos de formación de imágenes de una fuente de luz fluorescente tiene que ser aplicado en la configuración micropscope. Usa los filtros estándar.

5. Cuantificación de SC distancias de migración

  1. En el punto final (por ejemplo DIV4), fijar los geles de colágeno con 4% de PFA en el portaobjetos para cámara de 3-4 horas. Consecutivamente lavar los geles de colágeno 5 veces durante 10 min con PBS. Aplicar protocolos estándar para inmunocitoquímica (2). Si es nuevo para la preparación de SCG, verificar la identidad del ganglio como un ganglio simpático por inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) un marcador común para las células catecolaminérgicas. Durante inmunohistoquímica (después de que el anticuerpo primario), la transferencia de los geles de colágeno que contiene explantes a placas de 24 pocillos, que tienen un mayor volumen, lo cual es beneficioso para el lavado de los geles.
  2. Después de inmunohistoquímica, coloque cuidadosamente los geles de colágeno en portaobjetos de vidrio. Cuidadosamenteeliminar la solución remanente y dejar que el colágeno seco / reducir a dos dimensiones. Esto permite facilitar las medidas de distancias (2). Después de esto, montar las muestras.
  3. Por último, medir distancias de migración con la ayuda de Fiji (NIH) de software. No hay plugins especiales son necesarias para este fin. Para permitir que las mediciones correctas en micras, comprobar los metadatos de imagen correcta y la configuración en el Fiji, la imagen y la escala. Use Fiji también para la cuantificación de las células.

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Representative Results

El crecimiento axonal se facilita de SCG explantes tras el tratamiento con NGF (4) (esquema película S1 Figura 1 esquema). Este proceso es fácilmente visible por cualquier microscopio invertido y puede ser seguido por imagen de lapso de tiempo (película S2). Si un científico es algo nuevo para la disección de SCG de embriones de ratón es muy recomendable una validación de la técnica por un simple anti-tirosina hidroxilasa (TH) inmunohistoquímica. TH es un marcador común para las neuronas catecolaminérgicas (en este caso, las neuronas simpáticas) y hace también axones etiqueta (Figura 2B). Por este medio longitudes axonales pueden ser analizados en este sistema (2).

Es importante destacar que, después del crecimiento axonal ha sido inducida, una ola de migración de las células se puede observar (película S2 y S3). La migración de las células fueron validados como inmuno positivo S100 SC (2). Además de una línea de ratón transgénico, en la que GFP está bajo el control de la humana s10Fragmento de promotor 0b (3) se puede utilizar para analizar directamente la etiqueta población SC (2) (película S4 y S5). Con la ayuda de esta línea transgénica estos experimentos también se puede realizar con microscopía confocal hoja-o luz (no se realiza aquí).

Para los análisis de Carolina del Sur durante la migración, se recomienda un espacio de análisis con una baja densidad axonal (Figura 1 primer plano DIV3 y DIV4) y por lo tanto una pequeña población de Carolina del Sur por área de análisis. Esto facilita las mejores posibilidades para ver la morfología celular y el comportamiento celular (S3 películas).

SC distancias de migración puede ser medida al final de un experimento (por ejemplo DIV4). Para este fin etiquetado nuclear DAPI se puede realizar en tejido fijado y las distancias desde el líder núcleos SC a la frontera del explante se puede medir con la ayuda de Fiji (NIH software) (Figura 2 esquema de etiquetado y DAPI) (2).Además también SC proliferación o la muerte SC puede ser analizado. Para este fin inmunohistoquímica para phh3 o para la caspasa 3 activa se puede realizar, por ejemplo, la identificación de las células apoptóticas mitótico o respectivamente (2).

Figura 1
Figura 1 A:. Esquema que muestra el crecimiento axonal a partir de un SCG explantaron con el tiempo (DIV0-DIV4). B / C: imágenes de campo claro, registrados durante time-lapse mostrando primeros planos de una región de un explante SCG en DIV3 (B) y DIV4 (C) (escala-bar = 100 mm).

Figura 2
Figura 2 A:. Esquema que muestra SC (azul) a lo largo de los axones largos (gris), obtenidas de un SCG explantado (luz azul) en DIV3 y DIV4. Distancias de migración se puede medir en DAPI nuclear marcadas muestras mediante la medición de la distancia desde el núcleo de la SC conduce a la frontera de la SCG explantado en múltiples lugares (C). TH inmunohistoquímica (DIV4) debe llevarse a cabo si un científico es nuevo SCG disección. Un etiquetado positivo identifica claramente el ganglio explantado como un ganglio simpático (B). TH inmunohistoquímica también permite el análisis de los axones crecen de SCG explantados.

Película S1. Esquema que muestra el crecimiento axonal de un SCG explantado durante varios días in vitro. Haga clic aquí para ver la película .

Película S2. Crecimiento axonal y de la migración de un SC NGF tratados SCG explante. Formación de imágenes se inició a DIV2. Velocidad de grabación marco era de 1/30 min. Scale-bar = 100 m. Haga clic aquí para ver la película .

ntent "> Película S3. Cerca de una zona periférica de un explante SCG. Debido a la baja densidad axonal individuales SC pueden ser fácilmente analizados. inicio imagen era DIV3. velocidad de cuadros de grabación fue de 1/10 min. Scale-bar = 100 m . Haga clic aquí para ver la película .

S4 película. La combinación de campo claro y fluorescencia permite la visualización de las SC S100 GFP positivos y los axones de comunicación. Velocidad de grabación marco era de 1/10 min. Scale-bar = 100 m. Haga clic aquí para ver la película .

Película S5. SC migración en la frontera de un explante SCG. Aquí sólo el canal de fluorescencia se muestra que permite una interpretación más fácil de S100 SC GFP positivos. Velocidad de grabación marco era de 1/10 min. Scale-bar = 100 m./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la película.

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Discussion

El desarrollo del sistema nervioso periférico es un proceso excitante. Cuando el desarrollo se ha completado, los axones se envainado por SCS a lo largo de toda la longitud, que puede, en los seres humanos, a menudo ser más de 100 cm. Para este fin, el número correcto de los CSs requeridas tiene que ser establecido durante el desarrollo y los SCS también tienen que moverse a lo largo de los axones que se extienden a la periferia para asegurar la cobertura completa axonal. Esto es válido para los axones mielinizados unmeylinated sino también para. En ambos casos, todos los axones están en contacto con los SC y dependen de su apoyo. Para estudiar el desarrollo de SC, se requieren ensayos que tomar el compartimiento axonal en cuenta y por lo tanto en imitar el desarrollo in vivo en un grado mejor que los ensayos de cero (5), ensayos de Boyden (6) o los ensayos de la cámara puede hacer. En algunos ensayos el compartimiento axonal fue tomada en cuenta ya. Por ejemplo, las secciones de los nervios ciáticos fueron utilizados como rutas para las castas de migrara lo largo de (7, 8), o SCS fueron co-cultivadas con las neuronas a lo largo de los axones que se observaron para migrar (9).

El SCG explante SC ensayo de migración, sin embargo, tiene aún más ventajas. Es especialmente interesante porque CSs están desarrollando a lo largo de sus axones fisiológicas propias, y éstas se siguen en aumento. Además, la técnica es fácil de aprender y requiere sólo un poco de las habilidades técnicas de disección y no requiere un complejo sistema de co-cultivo de las neuronas y SCS. Una configuración muy similar, sin embargo no se utiliza, sino más bien SCG GRD, fue propuesto por Gumy y sus colegas (10). Sin embargo, para aprovechar todas las posibilidades de tales ensayos, una configuración de microscopio inverso es necesario permitir time-lapse de imágenes. Es importante tener la posibilidad de hacer "posiciones múltiples experimentos", con el fin de ser capaz de analizar diferencialmente tratados explantes SCG, situados en un portaobjetos de cámara, en el mismotiempo, lo que permite el trabajo con controles lado a lado con óptimo de los factores de interés (2). Para los análisis sólo se utilizaron convencional de luz y fluorescencia convencional (por transgénica S100B: GFP ratones) microscopía. La técnica, sin embargo, también se pueden utilizar fácilmente con microscopía confocal hoja-o incluso luz (no se realiza aquí). Time-lapse grabaciones se puede utilizar para identificar las propiedades específicas celulares / comportamientos durante la migración. Hasta ahora sólo ratones de tipo silvestre y transgénicas se han usado (2). Sin embargo, la transfección de las SC y con ello la alteración de las vías con RNAi por ejemplo debería ser viable. Con esta técnica podría ser incluso posible para analizar la interacción SC-axón de SC normales y alterados en el axón mismo o vecino. En cuanto a distancias de migración, proliferación y supervivencia SC SC, análisis de punto final se puede realizar fácilmente mediante técnicas de inmunohistoquímica con DAPI nuclear etiquetado y software Fiji (NIH). Sin embargo, con el tiempo, incluso la vida-reporter para la proliferación (11) y la muerte celular (12, 13) se podría utilizar, lo que permite una lectura directa durante la exploración.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Queremos dar las gracias a Arumae Urmas para compartir un protocolo de colágeno y Fey y Jutta Hinz Ursula por su excelente asistencia técnica. Además queremos agradecer a Christian F. Ackermann, Ulrike Engel y la Nikon Imaging Center en la Universidad de Heidelberg y también por la amabilidad de Joachim Kirsch ayuda para el shoting video. El trabajo fue financiado parcialmente a través de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

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References

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6, (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24, (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46, (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34, (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181, (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16, (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37, (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133, (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Comments

2 Comments

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    Reply
    Posted by: Muhammed A.
    November 26, 2012 - 2:49 AM
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