Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

Neuroscience

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Summary

Qui descriviamo una delle cellule di Schwann (SC) saggio transizione, in cui SC sono in grado di sviluppare lungo gli assoni si estendono.

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Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

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Abstract

Lo sviluppo dei nervi periferici è un processo intrigante. I neuroni inviano assoni per innervare obiettivi specifici, che negli esseri umani sono spesso più di 100 cm di distanza dal soma del neurone. Sopravvivenza neuronale durante lo sviluppo dipende destinazione fattori di crescita derivati ​​ma anche sul supporto di cellule di Schwann (SC). A questo fine assoni ensheath SC della regione del soma neuronale (o il passaggio dalla centrale per il sistema nervoso periferico) alla sinapsi o giunzione neuromuscolare. Le cellule di Schwann sono derivati ​​della cresta neurale e la migrazione come precursori lungo gli assoni emergenti fino a quando l'assone è coperto con SCS. Ciò dimostra l'importanza di SC migrazione per lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sottolinea la necessità di studiare questo processo. Al fine di analizzare lo sviluppo SC, una messa a punto è necessario che accanto alle SC comprende anche la loro substrato fisiologico per la migrazione, l'assone. Grazie allo sviluppo intrauterino (mus musculus). Per ovviare a questo, abbiamo adattato il ganglio cervicale superiore (SCG) tecnica di espianto. Dopo il trattamento con il fattore di crescita nervosa (NGF) espianti SCG estendere assoni, seguiti da precursori SC migrano lungo gli assoni dal ganglio alla periferia. La bellezza di questo sistema è che la SC sono derivati ​​da un pool di SC endogena e che migrano lungo i loro assoni proprie fisiologici che crescono contemporaneamente. Questo sistema è particolarmente interessante, in quanto lo sviluppo SC lungo gli assoni possono essere analizzati con time-lapse imaging, aprendo ulteriori possibilità di acquisire conoscenze in migrazione SC.

Protocol

1. Preparazione del gel di collagene

  1. Preparare un mezzo magazzino, contenente 455 microlitri MEM 10x, 112 microlitri NaHCO 7,5% 3, 50 microlitri glutammina e NaOH. La concentrazione e la quantità di NaOH dipende dalla coda di topo preparazione collagene (vedere 1.2), il volume finale del mezzo magazzino essendo 1.000 microlitri.
  2. Preparare coda di topo collagene secondo Ebendal (1). Conservare la soluzione di collagene a 4 ° C. Una degradazione del collagene soluzione non poteva essere osservato. Dopo la preparazione di un nuovo gruppo, valutare la concentrazione di NaOH necessaria per il mezzo stock (vedere 1.1). Utilizzare il pH del mezzo indicatore per la titolazione della quantità e concentrazione di NaOH. 800 microlitri acido coda di topo collagene deve girare una tonalità di rosso quando miscelato con 210 ml di mezzo di brodo. Se la concentrazione di NaOH è troppo bassa la soluzione di collagene diventa giallo, per l'indicatore di pH del mezzo. Aggiungi il collagene al mezzo e mescolare senza prodottiucing bolle. Eseguire questi passaggi su ghiaccio. La polimerizzazione si verifica entro 2 ore dopo la soluzione di collagene e il mezzo magazzino sono stati mescolati e la nuova soluzione viene incubata a 37 ° C. Prova questo prima di iniziare un esperimento. 1.3) Mescolare 800 ml di soluzione di collagene con pl 210 di media stock (vedi 1.2). Posto 100 pl di questa soluzione in pozzetti di una slitta 8 camera bene. Incubare i vetrini a 37 ° C, 5% di CO 2 e umido in una cella incubatore. Preparare i gel di collagene sotto un banco di coltura cellulare e condizioni sterili. Il collagene gelatinizes entro 2 ore.

2. Dissezione di SCGS embrionali

  1. Harvest embrioni di topo gravide tempo (E16-18) dall'utero e tenerli in PBS fino a nuovo necessario.
  2. Staccare un embrione dalla membrana amniotica. Decapitare il caudale dell'embrione del livello clavicolare. Fissare la testa su un piatto fondo di silicio con "insetto-aghi". Il lato ventrale della testa deve affrontare a voi und si deve vedere la regione sottomandibolare. Il fissaggio per un facile preparazione.
  3. Rimuovere la pelle della regione sottomandibolare destra e sinistra e con essa la sottocutaneo tessuto connettivo.
  4. Rimuovere le ghiandole salivari sottomandibolari dalla loro posizione per cancellare la vista sulla ioide, i muscoli infrahyoidal e il muscolo sternocleidomastoideo.
  5. Rimuovere questi muscoli con attenzione per eliminare la vista sulla laringe e della trachea. Rimuovere la trachea e la laringe. Le arterie carotidi sono quindi visibili da entrambi i lati sui muscoli prevertebrali. Il SCG si trova nella biforcazione delle arterie carotidee e ha una forma ovale. Rimuovere con attenzione i gangli e metterli in PBS. Rimuovere i gangli delicatamente dagli strumenti di dissezione se sono aderiscano. E 'vantaggioso utilizzare pinze nonché un porta aghi montato con un "ago insetto" per la rimozione SCG.
  6. Una volta in PBS, memorizzare i gangli a temperatura ambiente in PBS fino sezionato enougangli gh. Quindi pulire i gangli dai vasi sanguigni e tessuto connettivo. Eseguire la dissezione SCG e pulizia sotto un microscopio da dissezione posta sotto un banco di flusso laminare.
  7. Infine, posizionare i gangli espiantato sui gel di collagene gelatinizzati con l'aiuto della siringa aghi montati su una siringa per facilitarne la movimentazione.
  8. Incubare le espianti SCG sul collagene gelificato in un incubatore per colture cellulari a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e condizioni umide.

3. Trattamento di espianti SCG

  1. Dopo 1-2 ore di incubazione, coprire il collagene espianto SCG contenente terreno con 100 microlitri Neurobasal coltura cellulare contenente B27 supplemento, glutammina e antibiotici. Ora i pozzetti dei vetrini camera contiene un volume di 200 pl (100 microlitri gel e 100 microlitri media). Aggiungere altri 200 pl di mezzo, ma ora contenenti NGF (60 ng / ml) per facilitare la crescita assonale. Di conseguenza la concentrazione finale NGF è di 30 ng / ml.
    1. Per studiare l'insorgenza di SC migrazione, aggiungere ulteriori fattori direttamente al giorno in vitro 0 (DIV0). Sciogliere i fattori a medio NGF, contenenti, in doppia concentrazione necessaria (2).
    2. Al fine di analizzare l'impatto sulla SC, che ha già iniziato la migrazione lungo gli assoni, aggiungere ulteriori fattori a DIV3 fino DIV4 (fermata potenzialità dell'esperimento). A tal fine, rimuovere attentamente 180 microlitri della soluzione, a DIV3, e aggiungere 200 microlitri NGF nuovo mezzo e contenente gli elementi complementari di interesse a doppia concentrazione (2).

4. Time-lapse imaging

Utilizzare un microscopio invertito per le analisi. Vari obiettivi possono essere utilizzati, definire il campo di vista e l'ingrandimento. Un aspetto importante, tuttavia, è la distanza di lavoro dell'obiettivo utilizzato, come l'imaging degli espianti SCG viene eseguita attraverso il vetrino e il collagenegel. Il frame rate di registrazione di 1/10-30 minuti ha mostrato buoni risultati (2). Tuttavia, questo aspetto deve essere adattata alla domanda scientifica. Una telecamera CCD normale può essere utilizzato per l'acquisizione dell'immagine. Per l'imaging time lapse una coltura cellulare camera di incubazione deve essere attaccata alla fase del microscopio. Incubare il tessuto durante l'esposizione a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e condizioni umide. Avviare il sistema di incubazione uno ora prima dell'inizio imaging. Ciò consente alle parti microscopio (es. obiettivo) compresa la camera di scorrimento per regolare la temperatura e impedisce derive termiche indotte. Definire le aree specifiche di analisi (entro il espianto e tra espianti diversi) con l'aiuto del software microscopio e con un programma di controllo fase motore (installazione multiposizione) per le analisi simultanee di diverse condizioni applicate agli espianti SCG. Per time-lapse immagini dei tessuti di tipo selvatico e tessuti di animali transgenici può essere utilizzatosegnando la SC (S100B: GFP) (3). Per fluorofori immagini una sorgente di luce fluorescente deve essere attuata nel setup micropscope. Utilizzare i filtri standard.

5. Quantificazione dei SC distanze di migrazione

  1. Al punto finale (DIV4 per esempio), fissare il gel di collagene con il 4% PFA nella scatola di controllo per ora 3-4. Consecutivamente lavare i gel di collagene 5 volte per 10 minuti con PBS. Applicare protocolli standard per l'immunoistochimica (2). Se siete nuovi alla preparazione di SCGS, verificare l'identità del ganglio come un ganglio simpatico di immunoistochimica contro la tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per le cellule catecolaminergici comune. Durante immunoistochimica (dopo l'anticorpo primario), trasferire i contenenti gel di collagene explant a piastre da 24 pozzetti, che hanno un volume maggiore, che è vantaggioso per il lavaggio del gel.
  2. Dopo immunoistochimica, posizionare con attenzione il gel di collagene su vetrini. Attentamenterimuovere la soluzione restante e lasciare asciugare il collagene / ridursi a due dimensioni. Questo permette facili misurazioni di distanze (2). Dopo questo, montare i campioni.
  3. Infine, misurare le distanze di migrazione con l'aiuto di Figi (NIH) software. Nessun plugin speciali sono necessari a tal fine. Per consentire misurazioni corrette in pm, controllare i metadati corretto imaging e le impostazioni con il Fiji, l'immagine e la scala. Utilizzare Fiji anche per la quantificazione delle cellule.

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Representative Results

Crescita assonale è facilitato dal SCG espianti seguito al trattamento con NGF (4) (regime film S1 Figura 1 schema). Questo processo è facilmente visibile da qualsiasi microscopio invertito e può essere seguito da time-lapse imaging (film S2). Se uno scienziato è una novità per la dissezione SCG da embrioni di topo si consiglia vivamente una validazione della tecnica da un semplice anti-tirosina idrossilasi (TH) immunoistochimica. TH è un marker comune per i neuroni catecolamine (in questo caso neuroni simpatici) e fa anche assoni etichette (Figura 2B). In questo modo lunghezze assonale può essere analizzato in questo sistema (2).

È importante sottolineare che, dopo la crescita assonale è stato indotto, un'ondata di cellule migranti si può osservare (film S2 e S3). Migrazione di cellule sono stati validati come S100 immuno positivo SC (2). Inoltre una linea di topi transgenici in cui GFP è sotto il controllo della umana s10Frammento di promotore 0b (3) può essere utilizzato per analizzare direttamente la popolazione marcato SC (2) (film S4 e S5). Con l'aiuto di questa linea transgenica questi esperimenti possono essere eseguite anche con microscopia confocale-foglio o luce (non eseguita qui).

Per le analisi di SC durante la migrazione, si consiglia una zona di analisi con una bassa densità assonale (Figura 1 close-up DIV3 e DIV4) e, quindi, una piccola popolazione di SC per area di analisi. Questo facilita migliori possibilità di vedere la morfologia cellulare e il comportamento cellulare (S3 film).

SC distanze di migrazione può essere misurato al termine di un esperimento (es. DIV4). A tal fine etichettatura DAPI nucleare può essere effettuata sul tessuto fisso e distanze dai nuclei leader SC al confine della espianto può essere misurata con l'aiuto di Fiji (NIH software) (Figura 2 schema di etichettatura e DAPI) (2).Inoltre anche la proliferazione o la morte SC SC possono essere analizzati. A tal fine per immunoistochimica pHH3 o per caspasi 3 attivata può essere eseguita per esempio, identificare mitotica o cellule apoptotiche rispettivamente (2).

Figura 1
Figura 1 A:. Schema che mostra la crescita assonale da un SCG espiantato nel corso del tempo (DIV0-DIV4). B / C: chiaro, le immagini registrate durante il time-lapse imaging che mostra i primi piani di una regione di un espianto SCG a DIV3 (B) e DIV4 (C) (scala-bar = 100 micron).

Figura 2
Figura 2:. Schema che mostra SC (blu) lungo gli assoni estesi (grigio), coltivati ​​da una SCG espiantato (luce blu) e DIV3 DIV4. Distanze di migrazione può essere misurata su nucleare DAPI-etichettati campioni misurando la distanza dal nucleo del SC che conduce al confine del SCG espiantato in più posizioni (C). TH immunoistochimica (DIV4) dovrebbe essere eseguita se uno scienziato è nuova per SCG dissezione. Una etichettatura positiva identifica chiaramente il ganglio espiantato come un ganglio simpatico (B). Immunoistochimica TH consente anche una analisi degli assoni cresciuti da SCGS espiantati.

S1 film. Schema che mostra la crescita assonale da un SCG espiantato per diversi giorni in vitro. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie S2. Crescita assonale e la migrazione da un SC NGF trattati SCG espianto. Imaging iniziato a DIV2. Frame rate di registrazione era di 1/30 min. Scale-bar = 100 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .

S copi "> Film S3. Primo piano di una zona periferica di un espianto SCG. causa di una bassa densità assonale singoli SC possono essere facilmente analizzati. inizio Imaging era DIV3. velocità di registrazione è stato di 1/10 min. Scala-bar = 100 micron . Clicca qui per visualizzare filmati .

S4 Movie. La combinazione di campo chiaro e fluorescenza consente la visualizzazione di S100 SC GFP positive e gli assoni. Frame rate di registrazione è stato di 1/10 min. Scale-bar = 100 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie S5. Migrazione SC al confine di un espianto SCG. Qui solo il canale di fluorescenza viene mostrato consentire un più facile interpretazione S100 SC GFP positive. Frame rate di registrazione è stato di 1/10 min. Scale-bar = 100 micron./ "Target =" _blank 50016/50016movieS5.avi "> Clicca qui per visualizzare filmati.

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Discussion

Lo sviluppo del sistema nervoso periferico è un processo eccitante. Quando l'elaborazione è completata, assoni sono ensheathed da SCS per tutta la lunghezza, che può, in esseri umani, spesso oltre 100 cm. A tal fine il numero corretto dei SCs necessari deve essere stabilito durante lo sviluppo e la SCS devono anche muoversi lungo assoni si estendono verso la periferia per garantire la copertura completa assonale. Questo vale per assoni unmeylinated mielinizzati ma anche per. In entrambi i casi tutti assoni sono in contatto con SCS e dipendono dal loro sostegno. Per studiare sviluppo SC, sono necessari saggi che prendono il compartimento assonale in considerazione e quindi simulare la sviluppo in vivo in misura migliore di saggi vinci (5), saggi di Boyden (6) o saggi camera può fare. In alcuni saggi compartimento assonale stato preso in considerazione già. Per esempio sezioni di nervo sciatico sono stati utilizzati come percorsi per le SC di migrarelungo (7, 8), o SCS erano co-coltura con neuroni lungo cui assoni sono state osservate per la migrazione (9).

Il SCG espianto SC test di migrazione, tuttavia, ha anche altri vantaggi. E 'particolarmente interessante perché SCs stanno sviluppando lungo i loro assoni propri fisiologici, e questi stessi sono ancora in crescita. Inoltre la tecnica è facile da apprendere e richiede solo un po 'di competenze tecniche di dissezione e non richiede un complesso sistema di co-coltura di neuroni e SCS. Una configurazione molto simile, tuttavia, non utilizzando SCGS ma piuttosto DRG, è stato proposto da Gumy e colleghi (10). Tuttavia, per sfruttare le possibilità complete di tale saggio, una configurazione inversa è necessario un microscopio permette time-lapse imaging. È importante avere la possibilità di fare "multi posizione esperimenti", in modo da poter analizzare differenzialmente trattati espianti SCG, situato in una diapositiva camera, alla stessatempo, consentendo il lavoro con laterale ottimale i controlli a fianco con i fattori di interesse (2). Per le analisi abbiamo usato solo luce convenzionale e fluorescenza convenzionale (per transgenico S100B: topi GFP) microscopia. La tecnica, tuttavia, può anche essere facilmente utilizzato con microscopia confocale-foglio o anche luce (non eseguita qui). Time-lapse può essere utilizzato per identificare specifiche proprietà cellulari / comportamenti durante la migrazione. Finora solo di tipo selvatico topo e transgenici sono stati utilizzati (2). Tuttavia, trasfezione di SCS e quindi alterazione di percorsi con RNAi ad esempio, dovrebbe essere fattibile. Con questa tecnica potrebbe anche essere possibile analizzare la SC-assone gioco di SC normale e alterato il assone stesso o limitrofo. Per quanto riguarda le distanze di migrazione, proliferazione e sopravvivenza SC SC, analisi del punto finale può essere facilmente eseguita da immunoistochimica con DAPI nucleare etichettatura e Fiji (NIH) software. Tuttavia, alla fine anche la vita-reporter di proliferazione (11) e la morte cellulare (12, 13) possono essere utilizzati, consentendo una lettura diretta durante l'imaging.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Vogliamo ringraziare Arumae Urmas per la condivisione di un protocollo di collagene e Jutta Fey e Ursula Hinz per un'eccellente assistenza tecnica. Inoltre vogliamo ringraziare Christian F. Ackermann, Ulrike Engel e la Nikon Imaging Center presso l'Università di Heidelberg e anche per Joachim Kirsch aiuto gentile per il Shoting video. Il lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6, (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24, (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46, (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34, (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181, (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16, (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37, (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133, (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Comments

2 Comments

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    Reply
    Posted by: Muhammed A.
    November 26, 2012 - 2:49 AM
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    sorry, but I do not exactly get what you mean by recommending. Are you not able to see the content?
    best, Stephan

    Reply
    Posted by: stephan h.
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