Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heermann, S., Krieglstein, K. Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons. J. Vis. Exp. (69), e50016, doi:10.3791/50016 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Periferik sinirlerin gelişimi ilginç bir süreçtir. Nöronlar insanlarda 100'den fazla cm uzaklıkta nöronun soma gelen genellikle belirli hedeflere, innerve aksonlar gönderir. Gelişme sırasında nöronal hayatta kalma hedef türevi büyüme faktörleri üzerinde değil, aynı zamanda Schwann hücreleri (SC'ler) bir desteğe bağlıdır. Sinaps veya nöromuskuler kavşağa nöronal soma (veya merkezi periferik sinir sistemine geçiş) bölgesinden Bu amaçla SC ensheath aksonlar için. Schwann hücreleri nöral krest türevleri ve tüm akson SC'ler ile kaplıdır kadar çıkan aksonlar boyunca habercileri olarak göç ederler. Bu periferik sinir sisteminin gelişimi için SC göçün önemini göstermektedir ve bu sürecin araştırılması gerekliliğini vurgulamaktadır. SC gelişme analiz etmek için, bir ayar da geçiş için onların fizyolojik alt tabaka, akson içeren SCs yanında olan ihtiyaç vardır. Intrauterin gelişme nedeniyle (Mus musculus) fare gibi plasental omurgalılarda mümkün değildir. Bunu aşmak için, biz üstün servikal ganglion (SCG) eksplant tekniği uyarlanmıştır. Sinir büyüme faktörü (NGF) ile tedavi üzerine SCG eksplantlar gangliyondan çevreye aksonları boyunca göç SC öncüleri takip aksonlar uzatmak. Bu sistemin güzelliği SC endojen SC bir havuz ve onlar aynı anda büyüyor kendi fizyolojik aksonlar boyunca göç ettiğini elde olmasıdır. Aksonlar boyunca SC gelişimi SC göç içgörüler kazanmak için başka imkanların açıldığı, time-lapse görüntüleme ile analiz edilebilir, çünkü bu sistem, özellikle şaşırtıcıdır.

Protocol

1. Kollajen Jeller hazırlanması

  1. 455 ul 10x MEM, 112 ul% 7.5 NaHCO3, 50 ul glutamin ve NaOH içeren bir stok ortamı hazırlayın. Konsantrasyon ve NaOH miktarı sıçan kuyruğu kolajeni hazırlanması (1.2), 1.000 ul olmak stok orta son hacmine bağlıdır.
  2. Ebendal (1) 'e göre-fare kuyruk kolajeni hazırlayın. 4 ° C'de depolayın Kolajen çözeltisi Kollajen çözümün bir bozulma gözlenmemektedir. Yeni bir toplu hazırlandıktan sonra, (1.1) stok ortam için gerekli olan NaOH konsantrasyonunun tahmin. NaOH miktarı ve konsantrasyon titrasyonu için ortamın pH gösterge kullanın. 800 ul asidik fare kuyruk kolajeni stok orta 210 ul karıştığında kırmızı bir gölge çevirmek zorunda. NaOH konsantrasyonunun çok düşük ise kolajen çözeltisi ortamın pH gösterge dolayı, sarı dönecektir. Eşya olmadan ortam ve karışım için kolajen eklemekabarcıklar ucing. Buz üzerinde bu adımları uygulayın. Polimerizasyon kolajen çözeltisi ve stok orta karıştırıldıktan sonra 2 saat içinde meydana gelir ve yeni çözelti 37 ° C de kuluçkaya bırakılır Bir deneme başlamadan önce bunu sınayın. 1.3) stok orta 210 ul (1.2) ile kollajen solüsyonu 800 ul karıştırın. 8 de kamara slayt kuyularda bu çözüm yeri 100 ul. 37 slaytlar inkübe ° C,% 5 CO2 ve bir hücre kültürü inkübatöründe nemli koşullar. Bir hücre kültür tezgah ve steril koşullar altında kolajen jellerin hazırlanması. Kollajen 2 saat içinde gelatinizes.

2. Embriyonik SCGs diseksiyonu

  1. Kez hamile rahim fareler (E16-18) ve daha fazla ihtiyaç kadar PBS saklayın Harvest embriyolar.
  2. Amniyon itibaren bir embriyo teşrih. Klavikula düzeyinde kaudal embriyo başını kesmek. "Böcek-iğne" ile Silikon alt yemeğin üzerine başını düzelt. Başın ventral tarafında bir size karşı karşıya bulunmaktadırEğer submandibuler bölgede görmek olurdu. Fiksasyon daha kolay hazırlanmasını sağlar.
  3. Sol ve sağ submandibular bölgedeki cilt çıkarın ve deri altı bağ dokusu ile.
  4. Hyoid, infrahyoidal kas ve SKM kas üzerine görünümünü temizlemek için kendi konumdan submandibular tükrük bezleri çıkarın.
  5. Gırtlak ve nefes borusu üzerine görünümünü temizlemek için dikkatle bu kaslar çıkarın. Trakea ve larinks çıkarın. Karotis arterler sonra prevertebral kaslar üzerinde her iki tarafta görülür. SCG karotid arterlerin çatallanma bulunan ve oval bir şekil vardır. Dikkatlice ganglionlar kaldırmak ve PBS koyun. Onları yapışmasını iseniz diseksiyon araçları yavaşça ganglionlarda çıkarın. Bu forseps hem de SCG çıkarılması için bir "böcek iğne" ile monte edilmiş bir iğne tutucuya kullanmak için faydalıdır.
  6. Eğer enou parçalara kadar bir kez PBS içinde, PBS içinde oda sıcaklığında saklayın gangliyongh ganglionlarda. Sonra kan damarları ve bağ dokusundan ganglionlarda temizleyin. Bir laminer akış tezgah altına yerleştirilen bir diseksiyon mikroskobu altında SCG diseksiyonu ve temizlik yapın.
  7. Son olarak, daha kolay kullanım için şırınga üzerine monte şırınga iğne yardımıyla jelatinize kollajen jeller üzerine eksplante ganglionlarda yerleştirin.
  8. % 5 CO2 ile nemli koşullar ile, 37 ° C 'de bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde jelatinleştirilmiş kollajen SCG eksplantlar inkübe edin.

3. SCG Eksplantlarından Tedavisi

  1. 1-2 saat inkübasyondan sonra, B27 takviyesi, glutamin ve antibiyotik içeren 100 ul Neurobasal hücre kültür ortamı ile SCG eksplant içeren kollajen kapsamaktadır. Artık oda slaytların kuyular 200 ul (100 ul ve 100 ul jel orta) bir hacmi içerir. , Besiyerinin bir 200 ul ekle ancak şimdi akson büyümesini kolaylaştırmak için NGF (60 ng / ml) içeren. Buna uygun olarak, NGF, nihai konsantrasyon 30 ng / ml 'dir.
    1. SC göç başlangıçlı araştırmak için, in vitro 0 (DIV0) gün doğrudan ek faktörler ekleyin. Gerekli olan çift konsantrasyonu (2) 'de NGF içeren medyumda faktörler çözülür.
    2. Zaten aksonlar boyunca göç başladı SC'ler, üzerindeki etkisini analiz etmek amacıyla, DIV4 (deney potansiyel durağı) kadar DIV3 ilave faktörler ekleyin. Bu amaçla, dikkatlice DIV3 de çözelti 180 ul kaldırmak ve 200 ul yeni ortamı içeren NGF ve çift konsantrasyonu (2) çıkar ve ek faktörler ekleyin.

4. Time-lapse Görüntüleme

Analizler için bir inverted mikroskop kullanın. Çeşitli amaçları görünümü ve büyütme alanını tanımlayarak, kullanılabilir. SCG eksplant görüntüleme cam slayt ve kollajen ile gerçekleştirilir olarak önemli bir yönü ise, ikinci amacı çalışma mesafesijel. 1/10-30 dakika kayıt kare hızı iyi sonuçlar (2) gösterdi. Bununla birlikte, bu görünüş bilimsel soruya ayarlanmak zorundadır. Normal bir CCD kamera ile görüntü elde etmek için de kullanılabilir. Zaman atlamalı görüntüleme için bir hücre kültürü inkübasyon odası mikroskop aşamasına bağlı olmak zorundadır. % 5 CO2 ile nemli koşullar ile, 37 ° C de görüntüleme sırasında doku inkübe edin. Görüntüleme başlamadan önce kuluçka sistemi bir saat başlatın. Bu odaya slayt dahil mikroskop parçaları (örneğin objektif) sıcaklığa ayarlamanızı sağlar ve sıcaklık kaynaklı sürüklenir önler. Mikroskop yazılım yardımı ve SCG eksplantlar farklı uygulanan koşulların eşzamanlı analizleri için bir yazılım kontrollü motorize aşaması (Çok pozisyonlu ayar) ile analizler belirli alanlarda (eksplant üzerinde olan ve farklı eksplant arasında) tanımlayın. Kullanılabilir hızlandırılmış görüntüleme yabani-tip doku hem de transjenik hayvanlardan elde edilen doku için(3): SC'ler (GFP S100B) markalama. Görüntüleme floroforlar için bir floresan ışık kaynağı micropscope kurulum uygulanacak vardır. Standart filtreleri kullanın.

5. SC göç mesafeleri kantifikasyonu

  1. Son nokta (örneğin DIV4) az, 3-4 saat boyunca odasında slayt% 4 PFA ile kollajen jeller sabitleyin. Ardışık olarak PBS ile 10 dakika için kolajen jellerin 5 kez yıkayın. Immünsitokimya (2) için standart protokoller uygulayın. Eğer SCGs hazırlanması için yeni iseniz, tirozin hidroksilaz karşı immünohistokimyasal tarafından sempatik ganglion (TH) katekolaminerjik hücreler için ortak bir belirteç olarak ganglion kimliğini doğrulamak. Immünohistokimya sırasında (birincil antikor sonra), jeller yıkama için yararlı olan daha büyük bir hacimde sahip 24 gözlü levhalar için eksplant ihtiva eden kolajen jellerin aktarın.
  2. Immünhistokimya sonra, cam slaytlar kollajen jel dikkatlice yerleştirin. DikkatliceKalan çözüm kaldırmak ve kollajen kurulayın / iki boyut için küçültmek sağlar. Bu mesafe (2) kolayca ölçümleri sağlar. Bundan sonra, örnekleri monte.
  3. Nihayet, Fiji (NIH) yazılımı yardımıyla göç mesafeleri ölçmek. Hiçbir özel eklentileri bu amaçla ihtiyaç vardır. Um içinde doğru ölçümler sağlamak için, doğru görüntüleme metadata ve Fiji altındaki ayarları, görüntü ve ölçek kontrol edin. Hücrelerin ölçümü için de Fiji kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aksonal büyüme NGF (4) (film düzeni S1 Şekil 1 düzeni) ile muamele üzerine ikinci eksplantlar SCG kolaylaştırılır. Bu işlem herhangi bir inverted mikroskop ile görülebilen ve time-lapse görüntüleme (film S2) takip edilebilir. Bir bilim adamı fare embriyoları SCG diseksiyon için yeni ise şiddetle basit bir anti-tirozin hidroksilaz (TH) immünohistokimyasal olarak tekniğin bir doğrulama öneririz. TH etiketi aksonlar (Şekil 2B) katekolaminerjik nöronlar (bu durumda sempatik nöronlar) için ortak bir göstergedir ve yapar. Bu sayede aksonal uzunlukları bu sistem (2) içinde analiz edilebilir.

Aksonal büyüme olusup sonra Önemlisi, göç hücrelerinin bir dalga (film S2 ve S3) görülebilir. Geçiş hücreleri S100 bağışıklığı pozitif SC (2) olarak değerlendirilmiştir. Buna ek olarak, transgenik fare çizgi, içinde GFP insan S10 kontrolü altındadır0b promoter fragmanı (3) direk olarak etiketlenmiş SC nüfus (2) (film S4 ve S5) analiz etmek için de kullanılabilir. Bu transgenik hat yardımı ile bu deneylerde de konfokal-tabaka ya da hafif mikroskopi (burada yapılmaz) ile gerçekleştirilebilir.

Göç sırasında SC analizleri için, düşük aksonal yoğunluk (close-up DIV3 ve DIV4 Şekil 1) ve böylece analiz alanı başına SC küçük bir nüfusa sahip analizi bir alan öneririz. Bu hücre morfolojisi ve hücresel davranışı (film S3) görmek için en iyi imkanları kolaylaştırır.

SC geçiş mesafeleri bir deney (örn. DIV4) sonunda ölçülebilir. Bu amaca yönelik olarak DAPI nükleer etiketleme Fiji (NIH yazılım) (Şekil 2 düzeni ve DAPI etiketleme) (2) yardımı ile ölçülebilir eksplant sınırına lider SC atom çekirdeklerinden gelen sabit doku ve mesafeler üzerinde gerçekleştirilebilir.Buna ek olarak, aynı zamanda SC çoğalma veya SC ölüm analiz edilebilir. Bu son için, immünohistokimya pHH3 için ya da aktive edilmiş kaspaz 3 için sırasıyla (2), mitotik veya apoptotik hücrelerin belirlenmesi, örneğin, gerçekleştirilebilir.

Şekil 1
Şekil 1 A:. Scheme zamanla Eksplante SCG (DIV0-DIV4) gelen aksonal büyüme gösteriyor. B / C: DIV3 (B) ve DIV4 (C) (ölçek bar = 100 mikron) bir SCG eksplant biri bölgenin yakın çekimler gösteren time-lapse görüntüleme sırasında kaydedilen aydınlık görüntüler.

Şekil 2,
Şekil 2 A:. Scheme DIV3 ve DIV4 bir eksplante SCG (açık mavi) büyüdü uzatılmış aksonlar (gri), birlikte SC (mavi) gösteren. Göç mesafeler DAPI nükleer etiketli örnekler üzerinde ölçülebilir birden çok yerde eksplante SCG sınır (C) önde gelen SC çekirdekten mesafeyi ölçerek. Bir bilim adamı diseksiyon SCG yeni ise TH immünohistokimya (DIV4) yapılmalıdır. Pozitif etiketleme açıkça sempatik ganglion (B) olarak eksplante ganglion tanımlar. TH immünhistokimya da eksplante SCGs büyüdü aksonların analizine olanak sağlar.

Film S1. Vitro olarak birkaç gün içinde bir eksplante SCG gelen aksonal büyüme gösteren şema. filmi görmek için buraya tıklayın .

Bir NGF Movie S2. Aksonal büyüme ve SC göç eksplant SCG tedavi. Görüntüleme DIV2 başladı. Kayıt hızı 1/30 dk. Ölçek bar = 100 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .

ntent "> Film S3. bir SCG eksplant bir periferik bölgede kadar kapatın. düşük aksonal yoğunluk tek SC kolaylıkla analiz edilebilir. Görüntüleme başlangıç ​​DIV3 oldu. Kayıt hızı 1/10 dk. Ölçek bar = 100 mikron nedeniyle . filmi görmek için buraya tıklayın .

Film S4. Aydınlık ve floresan kombinasyonu S100 GFP pozitif SC'ler ve akson görselleştirme sağlar. Kayıt hızı 1/10 dk. Ölçek bar = 100 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film S5. Bir SCG eksplant sınırında SC göç. Burada sadece floresans kanal S100 GFP pozitif SC'ler daha kolay yorumlanmasına olanak gösterilir. Kayıt hızı 1/10 dk. Ölçek bar = 100 mikron./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> filmi görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Periferik sinir sisteminin gelişimi heyecan verici bir süreçtir. Gelişimi tamamlandıktan sonra, aksonların, insanlarda, sık sık, 100 cm olabilir tüm uzunluğu boyunca, SKS ile ensheathed edilir. Bu amaca yönelik olarak, gerekli SCs sayısı doğru gelişme sırasında oluşturulmalıdır ve SCs da tam kapsamı sağlamak aksonal için çevre uzanan akson boyunca hareket etmek zorunda. Bu miyelinli hem de için unmeylinated aksonlar için de geçerlidir. Her iki durumda da tüm aksonların SCs ile temas halinde olan ve destek bağlıdır. SC gelişme incelemek için, deneyler dikkate aksonal bölme almak ve bu nedenle çizik deneyleri daha iyi bir ölçüde (5) ile in vivo gelişme olarak taklit ihtiyaç bulunmaktadır, Boyden analizi (6) ya da oda deneyleri yapabilir. Bazı testler ise aksonal bölmesi zaten dikkate alınmıştır. Örneğin, siyatik sinir kesitleri geçirmek için SCs için yollar olarak kullanılmıştırboyunca (7, 8), ya da SCs geçirmek için gözlemlendiği akson boyunca nöronlar (9) ile birlikte kültive edildi.

SCG eksplant SC göç deneyi, ancak, hatta daha çok avantajları vardır. SC'ler kendi fizyolojik aksonlar boyunca gelişmekte olduğundan özellikle ilginçtir ve bu hala büyüyen kendileridir. Ayrıca tekniği öğrenmesi kolay ve teknik diseksiyon becerilerin sadece biraz gerektirir ve nöronların ve SC'ler karmaşık bir ko-kültür sistemi gerektirmez. Bir oldukça benzer kurulum Ancak SCGs ziyade DRG'ler kullanarak değil, Gumy ve arkadaşları (10) tarafından önerilmişti. Bununla birlikte, bu tür tahlil imkanların faydalanmak için, bir ters mikroskop setup hızlandırılmış görüntüleme sağlayarak ihtiyaç vardır. Bu aynı zamanda, bir odacık slayt yer ayirt tedavi SCG eksplantlar, analiz edebilmek için, "multi-pozisyon deneyler" yapmak olanağına sahip olmak önemlidirzaman, ilgi (2) faktörler ile yan optimum kontroller ile yan çalışma olanak tanır. Mikroskopi: analiz için biz sadece konvansiyonel ışık ve geleneksel floresan (GFP fareler transgenik S100B için) kullanılır. Bu teknik, ancak, aynı zamanda kolaylıkla konfokal-ya da ışık mikroskobu levha (burada yapılmaz) ile birlikte kullanılabilir. Time-lapse kayıt göç sırasında spesifik hücresel özellikleri / davranışları tanımlamak için kullanılır. Şimdiye kadar sadece yabani-tip ve transgenik fareler (2) kullanılmıştır. Bununla birlikte, örneğin, SKS ve RNAi ile yollar ve böylece değiştirme sırasında transfeksiyonundan uygun olmalıdır. Bu teknik ile bile aynı veya komşu aksonu üzerinde normal ve değişmiş SC SC-akson etkileşimleri analiz etmek mümkün olabilir. Göç mesafeleri, SC çoğalması ve SC sağkalım ile ilgili olarak, uç nokta analizleri kolayca DAPI nükleer etiketleme ve Fiji (NIH) yazılımı ile immünohistokimyasal olarak yapılabilir. Ancak, sonunda hatta hayatı repoproliferasyonu (11) ve hücre ölüm (12, 13) için rter böylece görüntüleme sırasında doğrudan bir okuma sağlayan kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz mükemmel teknik destek için bir kollajen protokol ve Jutta Fey ve Ursula Hinz paylaşmak için Urmas Arumae teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca biz nazik Video Atış için yardım için Hıristiyan F. Ackermann, Ulrike Engel ve Heidelberg Üniversitesi Nikon Görüntüleme Merkezi ve ayrıca Joachim Kirsch teşekkür etmek istiyorum. Çalışma kısmen Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592) yoluyla finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x MEM Gibco 21430
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080
Glutamine Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R&D#556-NG-100
Neurobasal Medium Gibco 21103
B27 Supplement Gibco 17504
antibiotics Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
insect needles FST 26002-20
syringe needle Braun BD # 300013
8 well chamber slide Lab tek 177402

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6, (12), e28692 (2011).
  3. Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24, (49), 10999-11009 (2004).
  4. Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46, (3), 373-384 (1960).
  5. Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34, (1), 39-51 (2001).
  6. Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181, (2), 351-365 (2008).
  7. Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (7), 2795-2799 (1994).
  8. Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16, (15), 4673-4683 (1996).
  9. Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (23), 8774-8779 (2004).
  10. Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37, (2), 298-311 (2008).
  11. Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
  12. Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133, (9), 2832-2835 (2011).
  13. Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).

Comments

2 Comments

  1. There's a problem with recommending this page, please help. Thanx

    Reply
    Posted by: Muhammed A.
    November 26, 2012 - 2:49 AM
  2. Dear Muhammed,
    sorry, but I do not exactly get what you mean by recommending. Are you not able to see the content?
    best, Stephan

    Reply
    Posted by: stephan h.
    November 30, 2012 - 4:24 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics