قياسات الضغط البطيني الحق الانقباضي في تركيبة مع حصاد الرئة وعينات الأنسجة المناعية في الفئران

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يوصف بروتوكول معين وسريعة للتحقيق في وقت واحد الحق وظيفة القلب، والتهاب الرئة، والاستجابة المناعية ليكون أداة تعليمية. فيديو والشخصيات تصف علم وظائف الأعضاء والتقنيات تسليخ مجهري في نهج فرق التي نظمت قابل للتكيف لاستخدامها في الدراسات الصغيرة وذات الحجم الكبير.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وظيفة القلب الصحيح هو ضخ الدم عبر الرئتين، وبالتالي ربط الحق علم وظائف الأعضاء علم وظائف الأعضاء والقلب الوعائية الرئوية. هو التهاب معدل المشتركة للقلب وظائف الرئة، عن طريق وضع تسلل الخلوية، وإنتاج السيتوكينات وعوامل النمو، والشروع في عمليات إعادة عرض 1.

بالمقارنة مع البطين الأيسر، البطين الأيمن هو مضخة ذات ضغط منخفض تعمل في منطقة ضيقة نسبيا من تغيرات الضغط. وترتبط زيادة الضغوط الشريان الرئوي مع زيادة الضغط في الأوعية الدموية في الرئة السرير وارتفاع ضغط الدم الرئوي 2. وكثيرا ما يرتبط ارتفاع ضغط الدم الرئوي مع أمراض الرئة التهابات، وعلى سبيل المثال مرض الانسداد الرئوي المزمن، أو أمراض المناعة الذاتية 3. لأن ارتفاع ضغط الدم الرئوي يمنح التكهن سيئة لنوعية الحياة ومتوسط ​​العمر المتوقع، يتم توجيه الكثير من البحث من أجل فهم الآليات التي من طراز ميغHT تكون أهدافا لمدة 4 تدخل الصيدلانية. التحدي الرئيسي لتطوير أدوات الإدارة الفعالة لارتفاع ضغط الدم الرئوي لا تزال تعقد في وقت واحد فهم التغيرات الجزيئية والخلوية في قلب الحق والرئتين والجهاز المناعي.

هنا، نقدم سير العمل الإجرائية لقياس سرعة ودقة من اختلاف الضغط في قلب حق الفئران والحصاد في وقت واحد من عينات من الرئتين والقلب والأنسجة المناعية. وتستند هذه الطريقة على قسطرة المباشر من البطين الأيمن عبر الوريد الوداجي في الصدر بالقرب الفئران، للمرة الأولى في أواخر 1990s كإجراء بديل من الضغوط في الشريان الرئوي 5-13. ونظمت فريق نهج يسهل قسطرة القلب سريعة جدا الحق التقنية. هذا يجعل من الممكن إجراء القياسات في الفئران التي تتنفس هواء الغرفة تلقائيا. تنظيم تدفق العمل في مجالات العمل المتميزةيقلل الوقت وتأخير يفتح إمكانية لإجراء التجارب في وقت واحد وعلم وظائف الأعضاء حصاد الأنسجة المناعية والقلب والرئة.

يمكن تكييفها سير العمل الإجرائية المذكورة هنا لطائفة واسعة من الإعدادات المختبرات والتصاميم الدراسة، من التجارب الصغيرة المستهدفة، والكبيرة المقايسات فحص المخدرات. اكتساب علم وظائف الأعضاء في وقت واحد من البيانات القلب التي يمكن توسيعها لتشمل تخطيط صدى القلب 5،14-17 وحصاد الأنسجة القلب والرئة والجهاز المناعي يقلل من عدد الحيوانات اللازمة للحصول على البيانات التي تحرك أساس المعرفة العلمية إلى الأمام. سير العمل الإجرائية المقدمة هنا كما يقدم قاعدة مثالية لاكتساب المعرفة من الشبكات التي تربط المناعة والرئة وظيفة القلب. يمكن تكييفها نفس المبادئ الموضحة هنا لدراسة الأجهزة الأخرى أو إضافية حسب الحاجة.

Protocol

1. إعداد

  1. إعداد الحلول التالية وأنابيب (الجدول 1) على النحو التالي:
    1. هانكس الحل، لا الكالسيوم والمغنيسيوم أو مؤشر مع البنسلين (100 U / مل) / الستربتوميسين (100 ملغ / مل).
    2. الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1X، الكالسيوم لا، لا المغنيسيوم.
    3. الإيثانول و 70٪، وجعل 500 مل.
    4. مخزنة الفورمالديهايد، 7-10٪ مع PBS، وجعل 500 مل.
    5. التخدير الحلول:
      1. AVERTIN. إضافة 5 مل من بعناية بيوتانول-2-الميثيل-2 إلى 5 غ من ثلاثي بروم إيثانول، 2،2،2. حل مرة واحدة، والحفاظ على محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تأخذ 0.25 مل من محلول المخزون وتمييع مع 10 مل من 1xPBS في زجاجة أسفل الزجاج. التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم، ومكان عند 37 درجة مئوية حتى يذوب ثم قسامة إلى 5 أنابيب البولي بروبلين والحفاظ مل في الثلاجة. الحارة 1 قسامة في صباح التجربة.
      2. باربيتورات. تخفيف محلول PBS مع إعطاء 2.6٪ الباربيتورات سولution. وضع مليلتر مأخوذة أنابيب البولي بروبلين 3-4 في.
  2. تنظيم ثلاث مناطق العمل (الشكل 1).
    1. المنطقة A: ترتيب العناصر التالية: نموذج الدراسة لتسجيل رقم تعريف الدراسة، تاريخ، ووزن الجسم، والأوزان من القلب الأيمن، والأيسر قلب الحاجز؛ مقياس الدقة (0-50 ز ز في الدقة 0.01) لتحديد وزن الجسم؛ النطاق الصغير لتحديد الأوزان في دقة القلب ز 0.001؛ تزن ​​الزوارق؛ التخدير حلول (بشكل واضح)؛ ديوار صغيرة مع النيتروجين السائل؛ الحاويات المعزولة مع الثلج؛ أنابيب وكذلك لوحة 24 لجمع عينات الدم والأنسجة (الجدول 1)؛ الأدوات الجراحية ( الجدول 2، الشكل 2)، وحلول لتنظيف الأدوات (الجدول 1).
    2. B المنطقة: ترتيب العناصر التالية: تشريح المجهر، والحق قسطرة القلب متصلة الضغط وحدة التحكم التي يتصل بها مكبر للصوت وجهاز كمبيوتر محمول. يتم وضع قسطرة فيدورق يحتوي على ماء. ترتيب الأدوات الجراحية (الجدول 2)، قطعة من قطع الخيط لمدة الأمثل، ووضع في وزن القارب؛ الشريط (الشريط الأوتوكلاف هو الأمثل) قطع لطول والعرض الأمثل واصطف على مقاعد البدلاء أو مختبر المجهر لسهولة الوصول إليها؛ مسحات القطن و مزيل الشعر الحل. معايرة قسطرة في بداية الدراسة.
    3. منطقة C: ترتيب العناصر التالية: المكبر عدسة؛ قنية القصبة الهوائية؛ المحاقن 1 مل؛ قطع الخيط لمدة الأمثل، ووضع في قارب تزن؛ ديوار صغيرة مع النيتروجين السائل؛ الحاويات المعزولة مع الثلج؛ أنابيب و24 لوحة جيدا لجمع BAL وعينات الأنسجة (الجدول 1)؛ الأدوات الجراحية (الجدول 2)؛ الحلول لأداء وBAL لتنظيف القصبة الهوائية قنية والصكوك (الجدول 1).

2. الحق قسطرة القلب

  1. وزن الماوس باستخدام مقياس الدقة من خلال وضع الماوس بلطف إلى وزن بالشوفان. تأكد من التعامل مع الحيوان برفق وهدوء. تسجيل الوزن. البروتوكول يعمل على نحو أفضل وصف للفئران التي هي 20 غراما أو أكثر لأن قطر لديها حبل الوريد لاستيعاب الضغط القسطرة، بل من الممكن أن الفئران الأصغر يقثطر (17 ز أو أكثر) طالما أن الوريد كبيرة بما فيه الكفاية.
  2. تخدير الماوس عن طريق الحقن مع آفيرتين اعتمادا على وزن الجسم (10 ميكرولتر / ز)، على سبيل المثال لمدة 20 ز إعطاء 200 ميكرولتر، لمدة 25 ز 250 ميكرولتر تعطي، تعطي لمدة 30 ز 300 ميكرولتر. حجم الحقن الدقيق يحتاج إلى تعديل تبعا للسلالة الماوس. تأكد من التعامل مع الحيوان برفق وهدوء بسبب الإجهاد يمكن أن يغير الاستجابة للمخدر.
  3. بمجرد مخدرا الماوس، ومكان على ورقة الأنسجة المزدوج مطوي. لاحظ رقم ID على ورقة. فرك بلطف محلول إزالة الشعر في الجانب البطني من الرقبة واضح في مجال العمليات الجراحية. ضع الماوس مرة أخرى على الورق والانتظار لمدة 1-2 دقيقة.
  4. إزالة الشعر من الناحية البطنيةمن الرقبة بواسطة التمسيد بلطف على الشعر عكس اتجاه نمو الشعر مع مسحات القطن.
  5. تحديد دقيق لعمق كاف من التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس أخمص القدمين: الماوس لا تستجيب لمعسر أصابع القدم فيها.
  6. العمل بسرعة واسترخاء، ويجب أن تبقى من قسطرة القلب الحق لا يستغرق أكثر من 10 دقيقة، على النحو الأمثل 3-6 دقيقة. من المهم أن الأنسجة لا تجف لأن القسطرة يحتاج لزحلقة في الوريد والانتقال داخل الوريد على طبقة من الرطوبة. توقيت ثابت من إجراء مهم لتوليد بيانات قابلة للمقارنة بين المجموعات.
  7. عودة مكان الماوس على المناديل الورقية والمناديل الورقية مع نقل على متن الستايروفوم. إصلاح الكفوف ورئيس في مكانها باستخدام شريط الأوتوكلاف.
  8. جعل شق الجلد من mandibles إلى القص (العظم الثدي).
  9. تشريح الغدة الدرقية بعناية صعودا نحو mandibles الكبرى لفضح الوريد الوداجي الحق ورrachea.
  10. مكان الستايروفوم المجلس عقد الماوس تحت المجهر تشريح مع التركيز الطائرة بالفعل وعدسة التكبير في حوالي 0.8x (التكبير الإجمالية [عدسة العين قطعة X] هو 8X تقريبا.
  11. microdissect بعناية الوريد الوداجي الحق عن طريق إزالة الأنسجة الضامة المحيطة بها مع ملقط جراحي.
  12. مكان قطعتين من الخيط على رأس الوريد الوداجي الأيمن. ربط الخيط الأقرب إلى mandibles لإغلاق تدفق الدم في الوريد الى حد كبير صغيرة، ضع خياطة الأقرب إلى القص / الثدي العظم في عقدة فضفاضة حول الوريد. يمكن للمرء أن استخدام قطرة صغيرة من الدم في وقت لاحق لايجاد ثقب في الوريد، يجب أن تصبح هذه الضرورة.
  13. التنفس والاسترخاء (ترخي العضلات في الرقبة والفك) لتبقي عينيك على الوريد من خلال العدسة. وسوف يضمن هذا اليدين والأصابع سوف تتحرك بشكل آمن، على نحو سلس ومريح. في حين الضغط على الوريد مع ملقط في الجانب الأقرب إلىmandibles، وقطع ثقب في الوريد بين اثنين باستخدام الخيوط الجراحية الدقيقة التي تديرها مقص من جهة أخرى. اخماد مقص الصغرى، وحفظ اليد التي استرخاء، ويشعر لقسطرة. استرداد بلطف القسطرة عقده بين الإبهام والإصبع الأول (الشكل 3). إدراج قسطرة في حفرة من الوريد.
  14. تقدم بلطف قسطرة في القلب الأيمن (الشكل 3). مراقبة علامات على القسطرة التي تعطي مؤشر تقريبي عن مدى القسطرة يحتاج إلى تدرج ومراقبة جهاز العرض. مرة واحدة يتم عرض منحنيات الضغط، وتشديد برفق أقل خياطة حول القسطرة. لأن القسطرة لديه قوة الشد التي يعطيها لفائف، ولأن ضربات القلب والتنفس من الفأرة إضافة الحركة، بالإضافة إلى ذلك يضعوا القسطرة باستخدام الشريط.
  15. سجل قياسات الضغط لمدة 2 دقيقة لتحليلها لاحقا (الشكل 4).
  16. فتح خياطة عقد القسطرة، ثم استرجاع بلطف catheثالثا. مسح جزء وراء محول الضغط، ضع مرة أخرى إلى الدورق بالماء. لا تلمس محول الضغط.
  17. نقل الماوس على الجزء العلوي من المناديل الورقية إلى منطقة A للقتل الرحيم، وجمع الدم من الأنسجة والطحال. تنظيف الأدوات الجراحية.
  18. بدء هذا الإجراء مع الحيوان المقبل. عندما يسمح توقيت، حقن مخدر أثناء انتظار لتسجيل منحنى الضغط (2.15).

3. جمع عينات الدم والطحال

  1. حقن باربيتورات حل، 400 ميكرولتر في الماوس وانتظر لمدة 1-2 دقيقة. يتم تنفيذ هذا بشكل روتيني في مختبرنا لتجنب احتمال أن الفئران استرداد سهوا من AVERTIN-التخدير في حين يجري بليد. ويتحقق توحيد المناسبة من التجربة عن طريق حقن الجرعة نفسها من حل الباربيتورات في الماوس، والانتظار على نفس القدر من الوقت قبل الحصاد من الدم. إذا سمحت رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام وطالماكما يتم مراقبة بعناية الحيوانات لعمق التخدير قبل استنزاف، ويمكن حذف هذه الخطوة.
  2. جعل شق في البطن. فتح الوريد الذيلية (الوريد الأجوف) وجمع الدم باستخدام ماصة نقل.
  3. إزالة الطحال، أو قطعة من الطحال في أنبوب إيبندورف وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل، أو في لوحة بشكل جيد في 24 منطقة عازلة هانكس تحتوي أيضا في وقت لاحق لإعداد الخلايا واحدة.
  4. نقل الماوس على الجزء العلوي من المناديل الورقية إلى العمل في منطقة C لجمع BAL، العقدة الليمفاوية تجفيف الرئة، الرئة، وأنسجة القلب. تنظيف الأدوات الجراحية.

4. جمع عينات من الرئة والقلب

  1. تشريح القصبة الهوائية مجانا من العضلات والنسيج الضام. ملقط وضع تحت القصبة الهوائية، وسحب الخيط من خلال. توليد بلطف تمتد كافية لخفض حفرة. الحفاظ على امتداد طيف، إدراج قنية القصبة الهوائية باستخدام حركة تحول قليلا، وخياطة قنية في مكانها.لادراج قنية القصبة الهوائية، تأكد من أن القصبة الهوائية رطبة، إذا لزم الأمر إضافة قطرة من محلول هانكس. في جميع أنحاء الداخلي، التنفس، والاسترخاء عضلات العنق والفك، للحفاظ على حركات اليد آمنة وسلسة.
  2. تشريح فتح القفص الصدري عن طريق إزالة بعناية الثدي العظم بدءا من نهاية البطن. لا تخل محتويات الصدر لأن هذا سيجعل من الصعب جدا العثور على العقدة الليمفاوية.
  3. أداء القصبات غسيل (BAL) عن طريق إدراج بلطف 1 مل من العازلة هانكس، بدوره الحقنة بلطف واسترجاع السوائل BAL. كرر 3 مرات، وإغلاق أنبوب مكان على الجليد. في جميع أنحاء الداخلي، والحفاظ على العينين على نهاية قنية القصبة الهوائية الذي يتصل الحقنة. نظرة إلى الصدر لمراقبة التضخم والانكماش من الرئتين.
  4. العقدة الليمفاوية الحصاد الرئة من خلال عقد ضلع جدار القفص مع مجموعة واحدة من ملقط، وإيجاد واسترجاع العقدة الليمفاوية مع ملقط آخر. مكان العقدة الليمفاوية إلى 24 لوحة جيدا. من المهم أن تعرف وهره للبحث: بدءا من الرقبة، والعثور على مدخل القفص الصدري من الجانب الأيمن من الفأرة وتبدو فوق العمود الفقري (الشكل 5).
  5. قلب الحصاد ووضعت على المناديل الورقية. عزل قلب الحق إلى جانب تشريح بعناية الحاجز. نقل إلى منطقة العمل A لوزن، سجل وزن ومكان في أنابيب إيبندورف لالتقاط تجميد في النيتروجين السائل.
  6. وضع الخيط حول الفص الرئة اليسرى لإغلاق القصبة الرئيسية. تشريح الرئة اليسرى الفص مجانا، مكان إلى أنبوب إيبندورف وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل، أو مكان في بئر من لوحة تحتوي على 24 أيضا هانكس حل لعزل في وقت لاحق من تعليق خلية واحدة.
  7. إدراج تقريبا. مخزنة 0.5 مل محلول الفورمالديهايد من خلال قنية القصبة الهوائية في الرئة الفص المتبقية. بعد التضخم، تشريح الفص الرئة من الصدر ومكان في أنبوب 50 مل تحتوي على محلول الفورمالديهايد. لتصميم الدراسة بديلة، يمكن أن يكون مبالغا الرئتين مع cutt الأمثلجي وسائل الاعلام (OCT، 1:4 المخفف مع PBS) وجمدت في قالب يحتوي أكتوبر غير مخفف لإعداد وقت لاحق من أقسام المجمدة. قد تستلزم دراسة تصميم آخر الحصول على الأنسجة المفاجئة الرئة المجمدة والمعلقات خلية واحدة من الرئتين. في هذه الحالة، لا يلزم التضخم: تشريح الفص الرئة المتبقية؛ استردادها من الصدر والمكان إلى لوحة البئر 24 إلى مخزن مؤقت هانكس تحتوي أيضا.
  8. إزالة قنية ونظيفة القصبة الهوائية وذلك بدهن مع العازلة هانكس، وتنظيف الأدوات الجراحية.

5. تحليل المنحنيات الضغط المتولد من قسطرة القلب الحق

يتم تحليل مسجل ضغط البطين الأيمن البيانات باستخدام LabChart 7 البرنامج بدون معرفة هوية كل مجموعة من التسجيل. ويتم اختيار أكثر من 20 منحنيات بشكل عشوائي والفرق بين الحد الأقصى والحد الأدنى للضغط البطين كل منحنى قياس (ΔP). يتم حساب متوسط ​​ΔP لإعطاء الحق ventriculع الضغط الانقباضي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تحقيق النتيجة الأولية للحصول على حق منحنيات ضغط القلب من قبل الموضع الصحيح للقسطرة القلب الصحيح. شكل منحنيات ضغط الوقت أمر بالغ الأهمية لأن الموضع الصحيح من داخل القسطرة من البطين الأيمن سوف يؤدي إلى الضغط الهضاب (الشكل 4). منحنيات شائك، بدلا من ذلك، تشير إلى وجود القسطرة التي يتم نقل من التنفس أو القلب نبض الحركة ضد جدار البطين الأيمن. للكشف عن المشاكل المحتملة مع مرحلة البقاء على قيد الحياة من الحيوانات، والانحراف المعياري للΔP، ومعدل ضربات القلب يجب أن تحسب. ومن المتوقع أن تكون كل القيم لا تختلف كثيرا بين مجموعات العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن التوقع هو أن القيم ΔP ومعدل ضربات القلب لا تظهر الانجراف عبر تسجيل الوقت. على سبيل المثال، سوف يتزايد ببطء القيم ΔP تشير تضيق الأوعية الرئوية نقص الأوكسجين 18-20. وخفض معدل ضربات القلب indicatه أن مستوى التخدير مرتفعة جدا مما يؤدي إلى وفاة الحيوان. في المختبر لدينا أشخاص مختلفين تنفيذ الإجراء. في جميع مجموعات من الفئران نحقق معدلات النجاح بشكل روتيني 90-95٪ في الحصول على البيانات ضغط البطين الأيمن.

في الوقت الذي تعلم الإجراء، فمن الأفضل أن تبدأ مع الفئران الإناث الأكبر سنا (25-30 ز وأكثر) التي لديها أكبر حبل الوريد وتميل إلى أن تكون أقل من الدهون تحت الجلد ودائع الفئران الذكور. أفضل طريقة للتأكد من وضع القسطرة هو الموت ببطء الحيوان في أقرب وقت يتم تأمين قسطرة داخل الوريد. تشريح الحيوان بدءا من القلب إلى تصور مباشرة موضع القسطرة. وهذا يسهل إلى حد كبير حل المشكلات.

النتيجة الأولى للحصول على السوائل BAL هو موضع الصحيح من قنية القصبة الهوائية. ويدل على ذلك تضخم الرئتين عند تغرس هانكس العازلة، والانكماش في الرئتين عندما برتقاليتتم إزالة إيه. الانتعاش المتوقع هو 70-80٪ من حجم غرست في الحيوانات السيطرة، أقل (بنسبة 50٪) في الحيوانات التي لديها التهاب الرئة. رغوة على رأس السائل BAL تعافى يدل على وجود بالسطح. تلوث الدم من السوائل وBAL تعافى يحدث إما بسبب وجود التهاب الرئة كبيرة، أو لتقطير والانتعاش من السائل غسل كان سريعا جدا. ومن الجدير بالملاحظة أن يمكن أن يتسبب بعض التدابير الإصابة الحادة داخل الرئتين بواسطة الإجراء BAL. إذا كان التصميم التجريبي هو فهم هذه المعايير الإصابة الحادة وفحص BAL المهم أيضا، ثم واحدة الفص الرئة يحتاج إلى تعادل خارج وإزالة قبل إجراء BAL.

في الإجراء هو موضح هنا، ونحن حصاد أنسجة الرئة للالتضخم دون علم الأنسجة موحدة ونضح في الرئتين. في الحالات التي يكون فيها الشكلي النسيجي الدقيق هو قراءة المغادرة الرئيسية، ينبغي أن تضخم الرئتين عن طريق القصبة الهوائية، والمؤسسة العامةيجب أن يتم تنفيذ rfusion عن طريق الشريان الرئوي، وكلها تحت ضغط موحدة.

في البروتوكول هو مبين، يتم تشريح القلب إلى توفير مؤشر فولتون كإجراء من تضخم القلب الأيمن (البطين الأيمن وزن / وزن البطين الأيسر والحاجز). وبالإضافة إلى ذلك، يجري وضع أساليب جديدة تقوم على التقييم النسيجي للقلب الحق. تدابير النسيجية الناشئة من تضخم القلب هي الحق) عدد النوى داخل منطقة محددة من القلب حق اختيارها عشوائيا، وب). تهم السفن، ومؤشر تليفي في مجال القلب

في المختبر لدينا، يتم التحقق بشكل روتيني الانتعاش الصحيح للرئة تجفيف الغدد الليمفاوية المنصفية والرغامية القصبية (الشكل 5) من التدفق الخلوي لأن هذه الأنسجة هي صغيرة جدا في السيطرة على الفئران. ومع ذلك، اعتمادا على microbiome في منشأة سكنية وعمر الحيوانات، وحجم الغدد الليمفاوية في unchallenGED، قد تكون السيطرة على الفئران كبيرة بما فيه الكفاية لتأكيد فقط بصرية. عند التحقق من التدفق الخلوي، وخلايا العقدة الليمفاوية يجب أن يتم تمييزها عن thymocytes. عن طريق الصدفة، يمكن بسهولة أخذ عينات الغدة الصعترية مع العقدة الليمفاوية لأن تقع الغدة الصعترية والغدد الليمفاوية قريبة من بعضها البعض وترد داخل القفص الصدري. الفرق هو أن يقع على مقربة من الغدة الصعترية العظم الثدي والعقد الليمفاوية القريبة من العمود الفقري. مزيد من التحدي هو أن الغدة الصعترية كبيرة جدا، تحتوي على العديد من الخلايا أكثر من العقد الليمفاوية صغيرة. يمكنك بسهولة Thymocytes يمكن تمييزها عن الخلايا العقدة الليمفاوية باستخدام التدفق الخلوي وCD3، CD4، وعلامات CD8. خلايا الغدد الليمفاوية يكون مميز + CD3، ومعظمها إما إيجابية أو CD8 CD4 ل. في المقابل، فإن غالبية thymocytes إيجابية لجميع علامات الثلاث (CD3 +، + CD4، CD8 +). ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات في العمق على توطين الغدد الليمفاوية الماوس في المخطوطفان دن برويك وآخرون 21.

توقيت ثابت من كل خطوة إجرائية الرئيسية (قسطرة القلب، والانتعاش من الدم والطحال، حصاد الرئة، وأنسجة القلب BAL) أمر بالغ الأهمية لتوليد البيانات التي تسمح للمقارنة بين مجموعات العلاج قوية. ولذلك، فمن المستحسن أن اثنين على الأقل، وأفضل ثلاثة محققين التعاون لإنجاز التجربة. وعلاوة على ذلك، فمن الأهمية بمكان أن المحققين تنفيذ الإجراء دون معرفة هوية مجموعة من الحيوانات. لذلك، وتحديد البيانات لابد من بذل بطريقة يحجب هوية المجموعة. وأخيرا، من المهم أيضا أن الترتيب الذي يتم تحليل هذه الحيوانات هي عشوائية. على سبيل المثال، معرف بسيطة هو تاريخ التجربة ومتتالية ترقيم الحيوانات. إذا كان هناك على سبيل المثال 4 مجموعات من الحيوانات (AD)، تعيين وتحديد ودراسة الحيوانات في الترتيب التالي: DATe_1: AA، date_2: با، date_3: CA، date_4: دا، date_5: AB، date_6: BB، date_7: بناء القدرات، وهلم جرا.

هذا التدفق التجريبية يسمح للدراسة، معمقة في وقت واحد من الآليات الجزيئية التي تتحكم التهاب الرئة والحق وظيفة القلب. البيانات في وقت واحد وجمع العينات يحقق أفضل الأفكار في شبكات الجزيئية، وانخفاض في عدد الحيوانات اللازمة للحصول على المعرفة البيولوجية الرواية.

نوع من أنبوب / دورق الحل (حجم) استخدام
تجهيز الدم
إيبندورف، 1.5 مل مصل الدم لل
EDTA المغلفة 2،0 مل الدم لالبلازما
إيبندورف، 0.5 مل تجميد المصل أو البلازما تجهيز BAL
مادة البولي بروبيلين، أسفل الجولة، 4.5 مل جمع غسل القصبات
مادة البولي بروبيلين، أسفل الجولة، 4.5 مل تجميد BAL طاف
96-وحة جيدا، متجنب BAL الخلايا
تجهيز الأنسجة
مادة البولي بروبيلين، 50 مل الفورمالديهايد، 7.5 مل إصلاح أنسجة الرئة
إيبندورف، 1.5 مل المفاجئة تجميد الفص الرئة
إيبندورف، 1.5 مل المفاجئة القلب تجميد الحق
إيبندورف، 1.5 مل المفاجئة القلب تجميد اليسار
24 لوحة جيدا هانكس العازلة، 0.5-1 مل سريعة فصوص الرئة تخزين في وقت لاحق طتحلول واحدة من الخلايا
24 لوحة جيدا هانكس العازلة، 0.5-1 مل تخزين الطحال السريع لعزل في وقت لاحق من الخلايا واحدة
24 لوحة جيدا هانكس العازلة، 0.5-1 مل السريع تخزين الغدد الليمفاوية في وقت لاحق لعزل الخلايا واحدة
لإجراءات
دورق زجاجي، 300 مل تعقيمها المياه ترطيب وتنظيف القسطرة
أنبوب البولي بروبلين، 50 مل هانكس العازلة، 50 مل أداء BAL
أنبوب البولي بروبلين، 50 مل هانكس العازلة، 50 مل غسل قنية القصبة الهوائية
أنبوب البولي بروبلين، 50 مل مطهر حل تنظيف الأدوات
أنبوب البولي بروبلين، 50 مل 70٪ من الإيثانول CLeaning الصكوك
أنبوب البولي بروبلين، 50 مل مياه الصنبور تنظيف الأدوات

الجدول 1. إعداد وتنظيم أنابيب والحلول.

صك وصف استخدم
مقص تقريب أو 5.5 بوصة على التوالي، مستديرة أو حادة تنتهي المنطقة A
مقص تقريب 4.0 بوصة، وينتهي حادة
ملقط الجراح 4.5 بوصة، عازمة، مع الغايات، شقة استيعاب
ملقط الجراح 4،0 بوصة، عازمة، مع الغايات، شقة استيعاب
مقص سليم Blades/Angled- 9 سم منطقة B
الدقيقة مقص عربةناس ربيع مقص - شفرات مم 2
ملقط الجراح ملقط (Dumon رقم 5 الجميلة)
ملقط الجراح 4،0 بوصة، عازمة، مع الغايات، شقة استيعاب
ملقط الجراح 4،0 بوصة، على التوالي، مع شقة، وينتهي استيعاب
خاط مضفر الحرير خياطة 6-0
القسطرة ضغط القسطرة
مقص تقريب أو 5.5 بوصة على التوالي، مستديرة أو حادة تنتهي منطقة C
مقص تقريب 4.0 بوصة، وينتهي حادة
ملقط الجراح 4.5 بوصة، عازمة، مع الغايات، شقة استيعاب
ملقط الجراح 4،0 بوصة، عازمة، مع الغايات، شقة استيعاب
قنية قنية القصبة الهوائية
خاط مضفر الحرير خياطة4-0

الجدول 2. منظمة الصكوك، خياطة، القسطرة، قنية القصبة الهوائية.

الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي من مجالات العمل. A) في منطقة العمل A للتسجيل، وزنها، وجمع من الأنسجة الدم والطحال والمؤقتة مساحة قابضة لهذه الحيوانات. ب) العمل في منطقة B لقسطرة القلب الحق. C) العمل في منطقة C للحصاد BAL والرئتين وسرطان الرئة العقدة الليمفاوية، والأنسجة القلبية.

الشكل 2
.. الشكل 2 الأدوات المستخدمة في إجراء A أدوات) لمنطقة العمل A؛ B) الأدوات اللازمة لقسطرة القلب الأيمن (العمل في منطقة B)؛ C) الإضافيةtruments لD C. عمل منطقة) القنيات الرغامي. الحاكم يبين حجم هذه الصكوك.

الشكل 3
الشكل 3. الحق قسطرة القلب. الحق قسطرة القلب تظهر مع علامات والشريط (A)، أو عقد باليد (B). النقاط قلم رصاص لعلامات المحرز في قسطرة (A). إدخال القسطرة (CE): تنظيف الوريد الوداجي الأيمن (C)؛ الوريد خياطة عقد مع ملقط، يجري القسطرة تقدمت نحو حفرة التي سبق في الوريد (D)؛ القسطرة بعد الإدراج في الوريد (E). الأسهم تشير إلى القسطرة (D، E).

الشكل 4 "/ files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
الشكل 4. تتبع عينة من اختلاف الضغط في قلب الحق. تظهر آثار تغيرات الضغط (مم زئبق) مع مرور الوقت (دقيقة: ثانية)، والبرنامج يعرض كل من المنحنيات بسرعتين مختلفتين. وترد والفأر مع إعادة عرض الالتهاب الشرياني الرئوي الناجم وارتفاع ضغط الدم (B)، وآثار ماوس التحكم (A). ويسلط الضوء على منحنيات تستخدم لقياس الضغط الانقباضي البطين الأيمن. لاحظ الهضاب ضغط واضح في منحنيات الضوء. يشير السهم إلى منحنى يحتوي على ارتفاع مما يدل على خطأ فني. لا يمكن هذه الأنواع من المنحنيات شائك أن تستخدم لقياس الضغوط الانقباضي البطين الأيمن. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

0023fig5.jpg "بديل =" الشكل 5 "/>
الشكل 5. الموقع من العقدة الليمفاوية المنصفية / الرغامية القصبية نسبة إلى القفص الصدري والعمود الفقري. السهم يشير إلى العقدة الليمفاوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تدفق التجريبية المذكورة هنا يسمح لقياس السريع والمتزامن لالبطين الأيمن الضغط الانقباضي وحصاد عينات للتحليل الردود في القلب والرئتين والجهاز المناعي لدى الفئران. الإجراء يجمع بين قياسات فسيولوجية القلب، والصغرى تشريح الأنسجة الحصاد اللاحقة للدراسات الخلية الحية، والتحليل النسيجي، أو omics تحليل للأنسجة. الإجراء كاملة تستغرق أقل من 20 دقيقة في الماوس. بسبب سير العمل في منطقة عمل التنظيم، يمكن درس 2-3 الحيوانات في وقت واحد. ولذلك، فإن الإجراء هو مناسبة للتجارب، صغيرة مستهدفة 12 و شاشات نطاق واسع في تنفيذ مجموعة واسعة من الإعدادات، من مختبر صغير لدراسة الأدوية الكبيرة.

مزيج من علم وظائف الأعضاء قياسات القلب والأنسجة الحصاد يفتح إمكانية لإجراء تحليل للكشف عن شبكات مصممة البيولوجية التي تحكم أو مزامنة القلب والرئة علىالثانية الوظيفة المناعية، وذلك باستخدام المعدلة وراثيا والموارد KO الماوس. ومن المزايا المهمة لتدفق الإجراء في وقت واحد هو الحد من عدد الحيوانات اللازمة للدراسة. تطبيق آخر من هذا العمل هو إمكانية الإجرائية للدراسة أو غيرها من الأجهزة إضافية من نفس الحيوان حسب الحاجة.

الإجراء المذكورة هنا يولد ضغط القلب الحق البيانات بسرعة كبيرة، في غضون 5-10 دقيقة من تحريض التخدير. هذا يجعل من الممكن لدراسة الحيوانات بينما هم في التنفس هواء الغرفة تلقائيا. وجود قيود على النهج هو أنه الغازية: الحيوانات هي مخدرة، يتم وضعها على ظهورهم، ويتم تمرير قسطرة عن طريق حبل الوريد من خلال الأذين إلى البطين الأيمن. الحد هو أيضا في الاستفادة من هذا الإجراء لأن البيانات تمثل قياسات مباشرة لتغيرات الضغط مع مرور الوقت في البطين الأيمن. مزيد من التحسينات التقنية، والاعتماد بشكل خاص على التصغير العلاقات العامةالقسطرة قد essure، والسماح لمكان دائم، والقسطرات الساكن في الفئران التي تسمح للتسجيل المباشر للضغط الشريان الرئوي مع مرور الوقت عدة أسابيع، كما يتم تنفيذ في الفئران الأخرى 22-24 و الحيوانات الكبيرة. إذا إدخال قسطرة القلب عن طريق الوريد الوداجي في صدره من مسافة قريبة، والتنفس بصورة تلقائية الحيوانات غير ممكن، يمكن إجراء تسجيل بديلة للتغييرات البطين الأيمن الضغط الانقباضي في الحيوانات التهوية عن طريق فتح القفص الصدري من وضع القسطرة والضغط من خلال شق مباشرة إلى البطين الأيمن 25. ويمكن إجراء قياسات غير الغازية من وظيفة القلب تخطيط صدى القلب باستخدام حق. يمكن إما أن يتم تنفيذ هذا الإجراء قبل قسطرة القلب الحق، أو يمكن فحص تخطيط صدى القلب الفئران عن طريق لعدة مرات لدراسة تطور المرض قبل القياسات الغازية 5،14-17.

تطبيق آخر من هذا الإجراء هو الحصول على additionaالبيانات لتر. وعلى سبيل المثال، وذلك باستخدام القسطرة التي يمكن قياس التدفقات والضغوط، يمكن أن الحق خرج القلب في وقت واحد جنبا إلى جنب مع تسجيل الحق تغيرات الضغط القلب. ويمكن أيضا الإجراء المذكورة هنا أن تستخدم لزيادة فهم التغيرات الفسيولوجية، الخلوية والجزيئية التي هي من محفزات ارتفاع ضغط الدم الرئوي غير الاستجابة المناعية، على سبيل المثال، والطفرات الوراثية 8،10، التعرض لدخان السجائر 26، أو التهابات الميكروبية 27-29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R21HL092370-01 (GG)، 1R01 HL095764-01 (GG)؛ R01HL082694 (JW)؛ جمعية القلب الأمريكية، المؤسسين التابعة لها (0855943D، GG)؛ ستوني القفر - هربرت الصندوق، نيويورك (SHP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics