Правого желудочка систолическое давление измерений в сочетании с Harvest легких и иммунной образцы тканей у мышей

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Конкретных и быстрых протоколов одновременно исследовать функцию правого сердца, воспаление легких, и иммунный ответ описывается как инструмент обучения. Видео и цифры описывают физиологию и микродиссекции методы в организованном командой подход, который адаптирован для использования в малых и больших размеров исследований.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка

  1. Подготовьте следующие решения и трубы (таблица 1) следующим образом:
    1. Хэнкс решение, не кальций, магний или индикатора с пенициллина (100 ЕД / мл) / стрептомицин (100 мкг / мл).
    2. Фосфатным буферным раствором (PBS), 1x, ни кальций, ни магний.
    3. Этанол, 70%, составит 500 мл.
    4. Buffered формальдегида, 7-10% с PBS, составит 500 мл.
    5. Анестезия решения:
      1. Avertin. Осторожно добавьте 5 мл 2-метил-2-бутанол до 5 г 2,2,2-Tribromoethanol. После растворения, держать раствор при комнатной температуре в темноте. Возьмите 0,25 мл раствора и разбавить его с 10 мл 1xPBS в стеклянной бутылке дно. Заверните бутылку с алюминиевой фольгой, место при 37 ° С до полного растворения, а затем аликвоты в 5 мл пробирок из полипропилена и хранить в холодильнике. Теплый аликвоты утром эксперимента.
      2. Барбитуратов. Разбавить раствор с PBS, чтобы дать 2,6% барбитуратов зольution. Поместите 3-4 мл аликвоты в полипропиленовых труб.
  2. Организовать три рабочих областей (рис. 1).
    1. Площадь: организовать следующие элементы: исследование форм для записи исследования идентификационный номер, дата, вес тела, вес правого сердца, левого желудочка и перегородки; точность шкалы (0-50 г на уровне 0,01 точностью г) для определения массы тела; микроуровне для определения веса сердца на уровне 0,001 точности г, вес лодки; анестезии решений (четко обозначены); небольшой сосуд Дьюара с жидким азотом; изолированный контейнер со льдом, трубы и 24-луночный планшет для сбора крови и образцах тканей (табл. 1); хирургические инструменты ( Таблица 2, Рисунок 2), а также решения для очистки инструментов (табл. 1).
    2. Зона B: организовать следующие пункты: рассекает микроскопом; право катетером сердце соединено с блоком контроля давления, подключенный к усилителю и портативный компьютер. Катетер встакан с водой. Организовать хирургических инструментов (Таблица 2), части шва путь к оптимальной длины и помещают в лодку весом; ленты (автоклав ленту оптимальной) сократить до оптимальной длины и ширины и выстроились на скамейке микроскопа или лабораторию для легкого доступа; ватные тампоны и Решение для удаления волос. Калибровка катетера в начале исследования.
    3. Зона C: организовать следующие пункты: лупа линзы; трахеи канюли, 1 шприц мл; шовный путь к оптимальной длины и помещают в лодку весом, небольшой сосуд Дьюара с жидким азотом; изолированный контейнер со льдом, трубы и 24-луночный планшет для сбора BAL и образцов тканей (табл. 1); хирургических инструментов (Таблица 2); решения для выполнения BAL и для очистки трахеи канюли и инструменты (табл. 1).

2. Катетеризация правых отделов сердца

  1. Взвешивание мыши с помощью точных масштабах, осторожно размещения мыши в весят бовса. Убедитесь, что справиться с животным мягко и спокойно. Запись веса. Описанный протокол работает лучше всего для мышей, 20 г или более, поскольку диаметр яремной вены должен разместиться давления катетер, можно катетеризации меньше мышей (17 г или больше), пока вены достаточно велик.
  2. Анестезию мыши путем инъекции Avertin в зависимости от веса тела (10 мкл / г), например, для 20 г дают 200 мкл, для 25 г дают 250 мкл, для 30 г дают 300 мкл. Точный объем инъекции должна быть скорректирована в зависимости от мышей штамма. Убедитесь, что справиться с животным мягко и тихо, потому что стресс может изменить ответ на анестезию.
  3. Как только мышь в отключке, место на двойной гофрированной бумагой. Обратите внимание на ID номер на бумаге. Аккуратно протрите лосьоном удаления волос в вентральной части шеи, чтобы очистить операционного поля. Наведите обратно на бумагу и подождать 1-2 мин.
  4. Удалить волосы из вентральнойчасть шеи, осторожно поглаживая волосы против направления роста волос с ватные тампоны.
  5. Тщательно определить достаточную глубину анестезии, проверяя отсутствие ног рефлекс: мышь не реагирует на ущемление своих пальцах.
  6. Рабочие быстро и спокойно, оставшаяся часть катетеризации правых отделов сердца не должна длиться более 10 минут, оптимально 3-6 мин. Важно, чтобы ткань не высыхает, потому что катетер должна скользить в вену и двигаться внутри вены на слой влаги. В соответствии сроки процедура важна для получения данных, которые сопоставимы между группами.
  7. Место мыши обратно на бумаге, ткани и ткани с передачей бумаги на пенополистирол платы. Исправить лапы и голова на месте с помощью автоклава ленты.
  8. Сделайте надрез кожи от челюсти до грудины (грудной кости).
  9. Осторожно рассекают щитовидной железы великого вверх к челюсти, чтобы выставить правую яремную венуй трахеи.
  10. Место пенополистирола платы удерживая кнопку мыши под микроскопом рассечение с фокальной плоскости уже на месте и объектива приблизительно 0,8 x увеличение (общее увеличение [х линз окуляра] примерно 8x.
  11. Осторожно microdissect правую яремную вену, удалив окружающей соединительной ткани с хирургическими щипцами.
  12. Место две части шва на верхней части правой яремной вены. Привяжите нить ближе к челюсти, чтобы закрыть поток крови в вену в крошечный ручеек, место шва, который ближе к грудине / грудной кости на свободные узел вокруг вены. Можно использовать крошечные струйки крови, чтобы позже найти дырку в вене, если это станет необходимым.
  13. Дышать и расслабляться (ослабьте мышцы в области шеи и челюсти), чтобы держать глаза на вены через окуляр. Это будет гарантировать, что ваши руки и пальцы будут двигаться безопасно, плавно и спокойно. Удерживая вены пинцетом на стороне, ближайшей кмандибулы, вырезать отверстие в вену между двумя швами с использованием микро-ножницы управляется с другой стороны. Положите микро-ножницы, и держать эту руку расслабленной, почувствовать катетер. Аккуратно получить катетер держа ее между большим и указательным пальцами (рис. 3). Вставьте катетер в отверстие в вену.
  14. Аккуратно продвиньте катетер в правую сердца (рис. 3). Обратите внимание на знаки на катетер, которые дают приблизительный показатель того, насколько катетер должен быть вставлен и наблюдать на мониторе. Как только давление кривые отображаются, осторожно затяните нижний шов вокруг катетера. Поскольку катетер имеет прочность на разрыв, что дает ему катушку, и потому, что дыхание и биение сердца мыши добавить движение, дополнительно прикрепить катетер с помощью липкой ленты.
  15. Запись измерений давления в течение 2 минут для последующего анализа (рис. 4).
  16. Откройте шов проведение катетера, затем аккуратно retrieве катетер. Протрите части за датчиком давления, поместить обратно в стакан с водой. Не прикасайтесь к датчику давления.
  17. Передача мыши на верхнюю часть папиросной бумаги, чтобы площадь для эвтаназии, сбор крови и ткани селезенки. Очистите хирургических инструментов.
  18. Начать процедуру со следующей животных. Когда сроки позволяет, вводить анестетик в ожидании записи кривой давления (2,15).

3. Сбор крови и селезенки Образцы

  1. Inject барбитуратов решение, 400 мкл на мышь и подождать 1-2 мин. Это обычно выполняется в нашей лаборатории, чтобы избежать возможности того, что мышь случайно оправиться от Avertin-анестезии в то же время кровь. Соответствующие стандартизации экспериментом достигается путем введения той же дозы барбитуратов решение на мышь, и, ожидая такого же количества времени до сбора крови. Если это допускается Институциональные уходу и использованию животных комитета итех пор, пока животные тщательно следить за глубиной наркоза до обескровливания, этот шаг может быть опущен.
  2. Сделайте надрез в брюшной полости. Откройте хвостовой вены (полой вены) и собирать крови с использованием передачи пипетки.
  3. Удалить селезенки, или кусок селезенки в трубку Eppendorf и оснастки замораживание в жидком азоте, или в 24-луночный планшет в лунку, содержащую Хэнкс буфер для последующей подготовки отдельных клеток.
  4. Передача мыши на верхнюю часть салфетки для рабочей зоны C для сбора BAL, легких лимфатических узлов, легких, сердца и тканей. Очистите хирургических инструментов.

4. Коллекция легких и сердца Образцы

  1. Проанализируйте трахеи бесплатно мышечной и соединительной ткани. Размещение щипцы под трахеи, тянуть через шов. Аккуратно генерировать достаточный протяжение, чтобы вырезать отверстие. Поддержание нежный стрейч, вставки трахеи канюли использованием слегка поворачивая движения, и шов канюли IntØ место. Для вставки трахеи канюли, убедитесь, что в трахею влажный, при необходимости добавить каплю раствора Хэнкса. На протяжении процедуры, дышать, расслабляться шеи и мышц челюсти, чтобы сохранить движений рук безопасной и гладкой.
  2. Проанализируйте открыть грудную клетку тщательно удаление грудной кости, начиная от брюшной конца. Не беспокоить содержимого грудной клетки, потому что это будет сделать очень трудно найти лимфатических узлов.
  3. Выполните бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), осторожно вставки 1 мл буфера Хэнкс, осторожно поверните шприц и получить БАЛ. Повторите 3 раза, недалеко трубы и место на льду. На протяжении процедуры, держать глаза на конце трахеи канюли, которая подключается к шприцу. Загляните в грудной клетке для наблюдения за инфляцией и дефляцией легких.
  4. Урожай легких лимфатических узлов, держа стены грудной клетки с одним набором щипцов, поиска и извлечения лимфатических узлов с другой пинцет. Место лимфатических узлов в 24-луночный планшет. Важно, чтобы кТеперь где искать: начиная от шеи, найти вход в грудную клетку с правой стороны мыши и смотри выше позвоночника (рис. 5).
  5. Сердце урожая и место на папиросную бумагу. Изолировать правых отделов сердца тщательно рассекает наряду с перегородкой. Переход к рабочей зоны взвесить, записать вес и место в пробирки Эппендорф хватать замораживание в жидком азоте.
  6. Поместить шов вокруг левой доли легкого, чтобы закрыть главный бронх. Проанализируйте доле левого легкого бесплатно, место в Эппендорф трубки и оснастки замораживание в жидком азоте, или место в лунку 24 и пластину, содержащую раствор Хэнкса для последующего выделения одного суспензии клеток.
  7. Вставьте ок. 0,5 мл буферного раствора формальдегида через трахеи канюли в оставшейся долей легких. После инфляции, анализировать легких долях из грудной клетки и поместить в 50 мл пробирку, содержащую раствор формальдегида. Для альтернативной по дизайну исследования, в легких, могут быть накачаны с оптическимал резки средств массовой информации (OCT, разбавленный 1:4 с PBS) и замораживают в форме, содержащей неразбавленном октября для последующей подготовки замороженных срезов. Другое исследование, разработка может потребовать получения оснастки замороженной ткани легких и одного клеточные суспензии из легких. В этом случае, нет инфляции необходимо: вскрыть оставшихся долей легких; извлекать их из грудной клетки и поместить в 24-луночный планшет в лунку, содержащую буфер Хэнкс.
  8. Удалить трахеи канюли, чистый промывать буфером Хэнкс, очистка хирургических инструментов.

5. Анализ кривых давления, полученных в результате Право катетер сердца

Записанное право данными давление желудочка анализируются с помощью LabChart 7 программное обеспечение, не зная групповой идентичности каждой записи. Более 20 кривые выбираются случайным образом, а разница между максимальным и минимальным давлением желудочков для каждой кривой измеряется (DP). Средняя p, рассчитывается дать право Ventricular систолического давления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Основным результатом для получения права кривые давления сердца достигается правильное положение правой катетер сердца. Форма кривых давления время имеет решающее значение, потому что правильное размещение катетера в правом желудочке приведет к давлению плато (рис. 4). Spiky кривые, напротив, указывают на катетер, который перемещается дыхания или движения сердца против стенки правого желудочка. Для обнаружения потенциальных проблем со стадии выживания животных, стандартное отклонение p, и частота сердечных сокращений должна быть рассчитана. Оба значения, как ожидается, существенно не различались между группами лечения. Кроме того, ожидается, что p, значения и частоты сердечных сокращений не показывают дрейф по времени записи. Например, медленно растущих значений p, будет означать, гипоксическая легочная вазоконстрикция 18-20. Уменьшение частоты сердечных сокращений будет индикациие, уровень анестезии слишком высока, ведущих к смерти животного. В нашей лаборатории разные люди выполняют процедуру. Во всех группах мышей мы обычно достичь 90-95% цены успех в получении нужных данных давлением левого желудочка.

Изучая процедуру, лучше всего начать со взрослыми самок мышей (25-30 г и более), которые имеют большую яремную вену и, как правило, имеют меньше подкожных жировых отложений, чем самцов мышей. Лучший способ выяснить размещения катетера усыпить животное, как только катетер крепится внутри вены. Препарировать животных, начиная от сердца к непосредственно визуализировать размещение катетера. Это значительно облегчит решение проблем.

Первый результат для получения БАЛ является правильное размещение трахеи канюли. Об этом свидетельствуют раздувание легких, когда Хэнкс буфер привили, и дефляция легких, когда баффэ удаляется. Ожидается восстановление 70-80% от объема вселил у контрольных животных, меньше (до 50%) у животных, у которых есть воспаление легких. Пена на начало восстановления жидкости БАЛ указывает на наличие поверхностно-активного вещества. Кровь загрязнению восстановленного БАЛ либо происходит из-за наличия значительного воспаления легких, или потому, что инстилляции и восстановление промывочной жидкости было слишком быстрым. Он имеет в виду, что некоторые острые меры травму в легких может быть вызван BAL процедуры. Если опытно-конструкторских, чтобы понять эти параметры острой травмой и экспертизы BAL также важна, то доля легкого должна быть связана с и удалены до проведения БАЛ.

В процедуре показано здесь, жмем легочной ткани для гистологического исследования, не стандартизированы инфляции и перфузии легких. В случаях, когда точное гистологическое морфометрии является основным считывания, легкие должны быть накачаны через трахею, и реrfusion должно быть выполнено через легочную артерию, все под стандартизированные давления.

В протоколе показали, сердце разрезали, чтобы обеспечить индекс Fulton как мера гипертрофии правого сердца (вес правого желудочка / масса левого желудочка и перегородки). Кроме того, новые методы разрабатываются, которые основаны на гистологическое исследование правых отделов сердца. Новые гистологические меры гипертрофии правого сердца) число ядер в пределах определенной области случайно выбранных правое сердце, и б) рассчитывает судов, и фиброзных индекса в область сердца.

В нашей лаборатории, правильное восстановление легкого слива средостения и трахеобронхиального лимфатические узлы (рис. 5) регулярно проверяется проточной цитометрии, потому что эти ткани очень малы у контрольных мышей. Однако, в зависимости от микробиомом на объекте жилья и возраста животных, размеры лимфатических узлов в unchallenGED, контрольных мышей может быть достаточно большим только для визуального подтверждения. При проверке с помощью проточной цитометрии, клетки лимфатических узлов необходимо отличать от тимоцитов. Случайно, вилочковая железа может быть легко пробы вместе с лимфатического узла, потому что вилочковая железа и лимфатические узлы расположены близко друг к другу и находятся внутри грудной клетки. Различие в том, что вилочковая железа расположена близко к грудной кости и лимфатические узлы близко к позвоночнику. Далее сложным является то, что тимус является очень большой, содержащие много больше ячеек, чем небольшие лимфатические узлы. Тимоциты можно легко отличить от клеток лимфатических узлов с помощью проточной цитометрии и CD3, CD4, CD8 и маркеры. Лимфатические узлы имеют характерный CD3 + клеток, большинство из которых являются либо положительными для CD4 и CD8. В отличие от большинства тимоциты являются положительными для всех трех маркеров (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Далее в глубину информация о локализации узлов мышей лимфатические можно найти в рукописиВан ден Брок и соавт. 21.

В соответствии сроки каждого из основных процедурных этапа (катетеризация сердца, восстановление крови и селезенки, урожай BAL, легких и тканях сердца) имеет решающее значение для генерации данных, что позволяет для надежного сравнения между группами лечения. Поэтому, рекомендуется, по крайней мере два, и три лучшие следователи сотрудничают для выполнения эксперимента. Кроме того, очень важно, чтобы следователи проводят процедуру без знания групповой идентичности животных. Таким образом, идентификация данных должен быть сделан таким образом, что скрывает групповой идентичности. Наконец, важно также, что порядок, в котором животные анализируемых рандомизированном. Например, простой идентификатор является дата эксперимента и последовательная нумерация животных. Если есть, например, 4 группы животных (AD), назначить идентификации и изучения животных в следующем порядке: DATe_1: Аа, дата_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Да, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: ЦБ РФ, и так далее.

Этот экспериментальный поток позволяет в глубину, одновременное изучение молекулярных механизмов, которые контролируют воспаление легких и правильной функции сердца. Одновременное данные и пробы достигается лучшее понимание молекулярных сетей и сокращение числа животных, необходимых для получения новых биологических знаний.

Тип трубки / стакан Решение (по объему) Использование
Обработка крови
Eppendorf, 1,5 мл Кровь для сыворотки
EDTA покрытием 2,0 мл Кровь для плазмы
Eppendorf, 0,5 мл Замораживание сыворотке или плазме крови Обработка BAL
Полипропилен с круглым дном, 4,5 мл Сбор бронхоальвеолярного лаважа
Полипропилен с круглым дном, 4,5 мл Замораживание BAL супернатанта
96-луночный планшет, обогнул Клеток БАЛ
Обработка тканей
Полипропилен, 50 мл Формальдегид, 7,5 мл Исправить легочной ткани
Eppendorf, 1,5 мл Привязать доли замораживания легких
Eppendorf, 1,5 мл Привязать замораживания правых отделов сердца
Eppendorf, 1,5 мл Привязать замораживания левых отделов сердца
24-луночный планшет Хэнкс буфера, 0.5-1 мл Быстрый хранения легких доли для последующего яsolation отдельных клеток
24-луночный планшет Хэнкс буфера, 0.5-1 мл Быстрый хранения селезенки для последующего выделения отдельных клеток
24-луночный планшет Хэнкс буфера, 0.5-1 мл Быстрый хранения лимфатических узлов для последующего выделения отдельных клеток
Для процедуры
Стеклянный стакан, 300 мл Автоклавного воды Увлажняющие и очистки катетеров
Полипропиленовые трубы, 50 мл Хэнкс буфер, 50 мл Выполните BAL
Полипропиленовые трубы, 50 мл Хэнкс буфер, 50 мл Вымойте трахеи канюли
Полипропиленовые трубы, 50 мл Дезинфицирующий раствор Очистка инструментов
Полипропиленовые трубы, 50 мл 70% этанола Cleaning инструменты
Полипропиленовые трубы, 50 мл Водопроводная вода Очистка инструментов

Таблица 1. Подготовка и организация трубы и решений.

Инструмент Описание Использовать
Ножницы закругленные или прямые 5,5 дюйма, круглой или острыми концами Площадь
Ножницы округлая 4,0 дюйма, острые концы
Щипцы 4,5 дюйма, изогнутые, с плоскими, схватив концы
Щипцы 4,0-дюймовый изогнутый, с плоскими, схватив концы
Ножницы Стройная Blades/Angled- 9 см Зона B
Микро-ножницы ФургонNAS Весна Ножницы - 2 лезвия мм
Щипцы щипцы (Дюмон # 5 Fine)
Щипцы 4,0-дюймовый изогнутый, с плоскими, схватив концы
Щипцы 4,0-дюймовый, прямые, с плоскими, схватив концы
Шов Плетеный шелковый шовный 6-0
Катетер Давление катетер
Ножницы закругленные или прямые 5,5 дюйма, круглой или острыми концами Зона C
Ножницы округлая 4,0 дюйма, острые концы
Щипцы 4,5 дюйма, изогнутые, с плоскими, схватив концы
Щипцы 4,0-дюймовый изогнутый, с плоскими, схватив концы
Канюля Трахеи канюли
Шов Плетеный шовный Шелковый4-0

Таблица 2. Организация инструменты, шовный материал, катетеры, трахеи канюли.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение работы областями.) Рабочей зоны для регистрации, взвешивания, сбора крови и ткани селезенки и временного содержания места для животных. B) рабочей зоны B для катетеризации правых отделов сердца. C) рабочей зоны C для сбора BAL, легких, лимфатических узлов легких и сердца тканей.

Рисунок 2
. Рис. 2 Приборы, используемые для процедуры) Приборы для рабочей зоны; B) инструменты для катетеризации правых отделов сердца (рабочей зоны B), C) модулиtruments для рабочей зоны C. D) трахеи канюли. Линейка показывает размер инструментов.

Рисунок 3
Рисунок 3. Право катетером сердце. Право катетер сердца показана знаки и ленты (A), или находящиеся в руки (B). Карандаш указывает на знаки сделаны на катетера (A). Введение катетера (CE): очистка правой яремной вены (C); зашивали вену проводится с щипцы, катетер в настоящее время подошел к ранее сделанные отверстия в вену (D); катетера после введения в вену (E). Стрелки указывают на катетер (D, E).

Рисунок 4 "/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Рисунок 4. Пример следов изменений давления в правом сердце. Следы показывают изменение давления (мм рт.ст.) в течение долгого времени (мин: сек); программа отображает каждой из кривых на двух разных скоростях. Следы управления мышью (A), а мыши с воспалением индуцированной легочной артериальной гипертензии и ремоделирование (B) показаны. Кривые, используемые для измерения давления правого желудочка систолическое будут выделены. Обратите внимание, ясно плато давления в выделенной кривой. Стрелка указывает на кривую, которая имеет шип указывает на техническую ошибку. Эти колючие типа кривых не могут быть использованы для измерения давления правого желудочка систолическое. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

0023fig5.jpg "ALT =" Рисунок 5 "/>
Рисунок 5. Местонахождение средостения / трахеобронхиального лимфатических узлов по отношению к грудной клетки и позвоночника. Стрелка указывает на лимфатические узлы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экспериментальные потока изложенные здесь обеспечивает быстрое и одновременное измерение давления правого желудочка систолическое и сбор образцов для анализа ответов в легких, сердца и иммунной системы у мышей. Процедура сочетает в себе сердце физиологии измерений, микро-рассечение и последующего урожая ткани для исследования живой клетки, гистологический анализ, или омик-анализ тканей. Вся процедура занимает не более 20 минут на мышь. Из-за рабочей зоны организованного рабочего процесса, 2-3 животных можно изучать одновременно. Таким образом, процедура подходит для небольших целевых экспериментов 12 и большими экранами масштаба проводится в широком диапазоне параметров, из небольшой лаборатории в крупных фармацевтических исследований.

Сочетание сердце физиологии измерений и тканей урожая открывает возможность проводить анализ предназначен для обнаружения биологических сетей, управления и синхронизации сердца, легкихм иммунную функцию, используя трансгенные мыши и КО ресурсов. Важным преимуществом одновременным потоком процедуры является уменьшение числа животных, необходимых в исследовании. Другое применение этой процессуальной рабочего процесса является возможность изучения других или дополнительных органов от того же животного по мере необходимости.

Процедуру, описанную здесь создает нужные данные давлением сердца очень быстро, в течение 5-10 мин индукции анестезии. Это дает возможность изучать животных в то время как они дышат воздухом спонтанно. Ограничение подхода является то, что инвазивные: животные наркозом, они помещаются на их спинах, и катетер проходит через яремную вену через предсердия в правый желудочек. Ограничением также является преимуществом этой процедуры, поскольку данные представляют собой прямое измерение изменения давления во времени в правом желудочке. Дальнейшие технические усовершенствования, в частности, опираясь на миниатюризации пр.Essure катетеры, может позволить разместить постоянный, катетеров у мышей, которые позволяют прямой записи давления в легочной артерии в течение нескольких недель, как это выполняется в 22-24 крыс и других крупных животных. Если вставка сердце катетер через яремную вену в тесном грудью, спонтанно дышащих животных не представляется возможным, альтернативная запись правом изменения систолическое давление в желудочке может быть сделано в вентилируемых животных путем открытия грудной клетки и размещение давления катетер через Разрез прямо в правый желудочек 25. Неинвазивные измерения правильной функции сердца могут быть сделаны с помощью эхокардиографии. Эта процедура может быть выполнено до катетеризации правых отделов сердца, или мышей могут быть рассмотрены с помощью эхокардиографии по несколько раз, чтобы изучить прогрессирование заболевания до инвазивного измерения 5,14-17.

Другое применение этой процедуры является получение additionaл. Например, с помощью катетера, который может измерять потоки и давления, правом выхода сердца могут быть одновременно записаны вместе с правом изменения давления сердце. Процедуру, описанную здесь также могут быть использованы для дальнейшего понимания физиологической, клеточные и молекулярные изменения, которые являются триггерами легочной гипертензии, кроме иммунный ответ, например, генетические мутации 8,10, сигаретный дым экспозиции 26 или микробных инфекций 27-29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), Американской ассоциации сердца, Учредителей филиал (0855943D, GG); Stony Wold - Герберт фонда, Нью-Йорк (SHP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics