الكشف عن بروتين Palmitoylation في الخلايا العصبية قرن آمون بواسطة مثقف مناعي والبورصات الأسيل، البيوتين (آبي)

Neuroscience
 

Summary

إضافة إلى عكسها من بالميتات البروتينات مهم المنظم الاتجار البروتين داخل الخلايا. هذا هو موضع اهتمام خاص في الخلايا العصبية حيث يتم palmitoylated البروتينات متشابك كثيرة. نحن نستخدم طريقة بسيطة للكشف عن البروتينات الحيوية palmitoylated في الخلايا العصبية مثقف، والتي يمكن تكييفها لأنواع الخلايا والأنسجة المتعدد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Palmitoylation هو تعديل المادة الدهنية في مرحلة ما بعد متعدية ينطوي على إلحاق حمض الكربون 16-الدهنية المشبعة، بالميتات، إلى بقايا السيستين من البروتينات الركيزة من خلال السندات thioester عطوب [مشاركة في 1]. Palmitoylation من البروتين يزيد hydrophobicity الركيزة لها، ويسهل عادة الاتجار تجاه الأغشية الخلوية. وقد أظهرت الدراسات الحديثة palmitoylation ليكون واحدا من التعديلات الدهون الأكثر شيوعا في الخلايا العصبية 1، 2، مما يدل على أن معدل دوران بالميتات هو آلية هامة من هذه الخلايا التي تنظم الاتجار واستهداف البروتينات. يمكن تحديد والكشف عن ركائز palmitoylated تحسين فهمنا لذلك الاتجار البروتين في الخلايا العصبية.

وقد تم الكشف عن بروتين palmitoylation أعاقت في الماضي من الناحية الفنية نظرا لعدم وجود توافق في الآراء بين تسلسل بروتينات الركيزة، والاعتماد على الأيض labeliنانوغرام من بالميتويل-البروتينات مع 3 H-بالميتات، ومقايسة البيوكيميائية تستغرق وقتا طويلا مع انخفاض الحساسية. تطوير فحص الأسيل، البيوتين (ABE) تبادل تمكن أكثر سرعة وحساسية عالية الكشف البروتينات palmitoylated 2-4، وهو الأمثل لقياس دوران ديناميكية بالميتات على البروتينات العصبية. وتتألف الفحص ABE من ثلاث خطوات البيوكيميائية (الشكل 1): 1) الحصار لا رجعة فيه معدلة المجموعات ثيول السيستين باستخدام N-ethylmaliemide (NEM)، 2) الانقسام محددة وإماطة اللثام عن مجموعة السيستين palmitoylated في ثيول من هيدروكسيل (HAM)، و 3) وضع العلامات الانتقائي للالسيستين palmitoylated باستخدام كاشف biotinylation ثيول التفاعل، البيوتين، BMCC. تنقية البروتينات المعقدة البيروكسيديز ثيول-باتباع الخطوات ABE واختلف، وهذا يتوقف على الهدف العام المتمثل في التجربة.

هنا، نحن تصف طريقة لتنقية بروتين palmitoylated الاهتمام الأساسي hippocampالخلايا العصبية من قبل شركة مناعي الأولية (IP) الخاص خطوة جسم مضاد ضد البروتين، يليه فحص ABE والغربية النشاف لقياس مستويات palmitoylation مباشرة من هذا البروتين، الذي يسمى الفحص IP-ABE. تم منخفض الكثافة الثقافات من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الترجمة، وظيفة، والاتجار بها البروتينات العصبية، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة الخلايا العصبية باستخدام البروتين palmitoylation الفحص IP-ABE. الفحص IP-ABE يتطلب أساسا IP القياسية والكواشف الغربية النشاف، ويقتصر فقط من قبل توافر أجسام مضادة ضد الركيزة الهدف. يمكن بسهولة أن تتكيف هذا الفحص للكشف عن وتنقية البروتينات palmitoylated بالنقل في مزارع الخلايا مغاير والثقافات العصبية الأولية المستمدة من مختلف أنسجة المخ كل من الماوس والفئران، وحتى الابتدائية أنسجة المخ نفسها.

Protocol

1. استخراج البروتين من الخلايا العصبية مثقف الهدف الحصين الابتدائية

  1. قبل حصاد البروتين من الخلايا الذاتية الحصين الابتدائية، وإعداد مخزن مؤقت يزيس (LB؛ الجدول 1) مع مثبطات الأنزيم البروتيني. إلى 10 مل من العازلة تحلل، أضف 0.1 مل حل فلوريد phenylmethanesulfonyl (PMSF) إلى تركيز النهائي من 10MM، وإضافة 1 كوكتيل المانع قرص البروتيني.
  2. إعداد N-ethylmaleimide (NEM) الحل (الجدول 1) من مسحوق مجفف بالتجميد. حل بلطف في EtOH 100٪ في درجة حرارة الغرفة (RT). إعداد الحل دائما NEM جديدة ليوم التجربة.
  3. الجمع بين المخزن المؤقت المقبل تحلل وNEM. إضافة 0.5 مل من محلول 2M NEM إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية. إضافة 20 مل LB على أعلى، وبسرعة LB + مكان NEM (تركيز النهائي من 50MM) على منصة متحركة في 4 درجات مئوية لخلط بالكامل لمدة 5 دقائق. دائما إضافة NEM / 2 EtOH الحل الأول وLB، وذلك لخلط صحيح الاثنين.
  4. إزالة الخلايا العصبية مثقف من الحاضنة ووضعت على الجليد *. إزالة بلطف وسائل الإعلام الخلوية، وغسل بلطف مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS) 1X. إضافة 300 مل من LB + NEM 50mm إلى البئر الأولى من الخلايا العصبية قرن آمون، وكشط الخلايا باستخدام خلية رافع التخلص منها. جمع lysate الخلية، ثم أداء المحللة في البئر التالية من هذه المجموعة. تتخلص الخلايا داخل البئر الثانية باستخدام رافعة للخلية، وجمع، وكرر باستخدام بئر ثالثة، إذا لزم الأمر لمزيد من التركيز المحللة.
  5. جمع lysate الخلية إلى ما قبل المبردة (على الجليد)، 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. كرر الخطوة 1،4 ميكرولتر من استخدام 100 LB + NEM 50mm إلى جمع أي lysate الخلية المتبقية. تمرير مجموع lysate الخلية من خلال حقنة في 26 ½ قياس 5-6 مرات للمساعدة في تحلل الميكانيكية، والحرص على عدم تفجير فقاعات في حل. يمكن للمرء أن يصوتن بدلا من 15 ثانية على الجليد، إذا المعدات المتاحة. Nutate lysate الخلية ل30 دقيقة ≥ ° 4 في C.
  6. توضيح lysa الخليةالشركة المصرية للاتصالات عن طريق الطرد المركزي في 16000 XG / 30 دقيقة، وذلك لخلايا الامم المتحدة هي lysed بيليه والمواد المنظفات غير قابلة للذوبان.
  7. جمع مسح lysate الخلية (طاف) في الجديدة قبل المبردة أنبوب 1.5 مل على الجليد. بروتوكول تكرار الحصاد لجميع الفئات من الخلايا. قياس تركيز البروتين في جميع العينات المحللة باستخدام مقايسة BCA، وتطبيع حجم العينات المحللة من جميع المجموعات من الخلايا لديها البروتين الكلي يساوي بالضبط، مع الحد الأدنى الموصى به من 500 ميكروغرام. أعلى حتى مع جميع العينات LB + NEM 50mm إلى حجم مجموع 500 ميكرولتر.
  8. إضافة 1-5 ميكروغرام من الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد بروتين هدف لكل من عينة المحللة. Nutate العينات المحللة الأجسام المضادة مختلطة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

* ينبغي مثقف الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الابتدائية في كثافة حوالي 250،000 خلية / جيدا في طبق 6 جيدا، في وسائل الإعلام المصل خالية يحتوي على ملحق B27 الخلايا العصبية، كما هو موضح سابقا ونمت لرغبةد طول الفترة الزمنية، وعادة 14-16 يوما في المختبر (DIV) لتحقيق النضج. ويوصى ما لا يقل عن 500 ميكروغرام من البروتين الكلي للimmunoprecipitate بنجاح وbiotinylate بروتين الخلايا العصبية المستهدفة، الأمر الذي يتطلب عادة 2-3 آبار طبق 6 أيضا.

2. ترسيب البروتين الهدف جسم محدد

  1. وقبل عجل شل حركة بروتين الهدف، وإعداد الطين 50٪ من البروتين، البروتين او الخرز sepharose و G المغلفة. على وجه التحديد، إضافة ≥ 60 ميكرولتر من الخرز sepharose و لكل عينة لأنابيب 1.5 مل، وضمان أن يكون جميع العينات كميات متساوية من الخرز. الخرز المغناطيسي هي أيضا مناسبة إذا كانت المعدات المتاحة.
  2. إضافة حجم مساو من الطين 50٪ لكل عينة المحللة الأجسام المضادة، وnutate ل≥ 1 ساعة في 4 درجات مئوية.

3. أسيل-البيوتين الصرف: هيدروكسيل (HAM) انشقاق

  1. أثناء أداء الخطوة 2.2، إعداد عدد من الأنابيب العازلة تحلل مع (LB) من ديfferent PHS. درجة الحموضة من المهم جدا لهذه الخطوات وينبغي دائما أن يتم ضبط درجة الحموضة متر باستخدام. إعداد 2 مل من درجة الحموضة LB 7.2 في العينة، و 0.5 مل من الاحتياطي صارمة لكل عينة (الجدول 1). أيضا بإعداد 0،5 مل + LB NEM 10MM لكل عينة، كما في الخطوات 1،1-1،3. إضافة PMSF وأقراص مثبط البروتياز لجميع مخازن تحلل، كما في الخطوة 1.1.
    1. هيدروكسيل (HAM) هو عامل قوي الحد الذي الانقسام من بالميتات من cysteines هو مطلوب لbiotinylation (الشكل 1)، وهذا الإغفال من الانقسام HAM بمثابة المراقبة السلبية. تقسيم كل عينة من الخرز في عينتين، واحد مع حذف خطوة الانقسام HAM (-HAM)، وواحد بما في ذلك الخطوة HAM (+ HAM). لتطبيع للتدهور البروتين الناجم عن العلاج HAM، ينبغي للمرء أن تقسيم كل عينة إلى الثلثين، مع 1/3 من الخرز المستخدمة لسيطرة HAM، و 2 المتبقية / 3 يستخدم لعلاج + HAM.
    2. التحضير 1 إضافية.5 مل أنابيب على الجليد، وصفت بأنها سيطرة HAM مقابل كل عينة. بعد الخطوة 2.2، أجهزة الطرد المركزي بلطف حبات جميع العينات "عند 0.5 XG / 1 دقيقة في 4 درجات مئوية (أجهزة الطرد المركزي في هذه السرعة، والمدة، ودرجة الحرارة لجميع الخطوات المتبقية ما لم ينص على خلاف ذلك)، ضع الأنابيب على الجليد، وإزالة طاف، و اعادة تعليق الخرز في 600 ميكرولتر من LB + NEM 10MM.
  2. بعد الخرز العينات 'إعادة تعليق العازلة تحلل في NEM + 10MM، وجمع 200 ميكرولتر من الفور الطين المحللة-حبة العينة، والتفريغ في أنبوب لل-HAM أن العينة على الجليد. إضافة 300 ميكرولتر من إضافية LB + NEM 10mm إلى العينة HAM، ومبلغ إضافي 100 ميكرولتر إلى + عينة HAM لما مجموعه 500 ميكرولتر في كل عينة. احتضان الأنابيب لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  3. اعادة تعليق (غسل) THE-HAM HAM وعينات + بلطف مع العازلة صرامة 0.5 مل، لكل عينة. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة، على حضانة أطول SDS سيؤدي إلى إزالة الأجسام المضادة من متجهة منالخرز.
  4. يغسل برفق جميع العينات ثلاث مرات في 0.5 مل / عينة من درجة الحموضة LB 7.2، وتدور باستمرار بين يغسل كما في الخطوة 3.2b.
  5. أثناء أداء الخطوة 3.5، إعداد العازلة HAM (الجدول 1). إضافة حجم مناسب من حل هيدروكسيل إلى أنبوب جديد، لتحقيق تركيز النهائي من 1M في حجم من 0.5 درجة الحموضة LB مل، 7.2 + عينة في HAM. إعداد المخزن المؤقت دائما HAM جديدة ليوم التجربة. إضافة 0.5 مل / عينة من درجة الحموضة 7.2 إلى LB-HAM جميع العينات، و 0.5 مل / العازلة عينة من عينات لجميع HAM HAM +.
  6. Nutate جميع العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). لا تتجاوز 1 ساعة.

4. أسيل-البيوتين الصرف: البيوتين، وصفها BMCC

  1. أثناء أداء الخطوة 3.6، 2 مل من إعداد الأس الهيدروجيني 6.2 في عينة LB (الجدول 1)، كما في الخطوة 3.1. ضع الرقم الهيدروجيني 6.2 على الجليد LB لحين الحاجة إليها. إعداد محلول المخزون أيضا من البيوتين-BMCC (الجدول 1) مباشرة قبل استخدامها. تزن من exactly 2،1 ملغ من البيوتين-BMCC، وجمع في أنبوب 1.5 مل، وبلطف في حل سلفوكسيد ثنائي ميثيل 0.5 مل (DMSO) من خلال وضع على منصة هزاز في RT، لتحقيق تركيز 8MM (لا تستخدم ماصة لتفريق مسحوق ).
  2. بمجرد الانتهاء من الخطوة 3.6، يغسل بلطف حبات مرة واحدة في درجة الحموضة عازلة تحلل 6.2، لإزالة بقايا العازلة HAM. إزالة طاف ووضع العينات في الثلج.
  3. البيوتين-BMCC هو جزيء maliemide البيوتين مترافق التي لها قابلية عالية للجماعات ثيول خالية من cysteines (الشكل 1). أثناء أداء الخطوة 4.2، 0.5 مل من إعداد البيوتين-BMCC العازلة (الجدول 1) لكل عينة، في تركيز العمل بين 0.5 ميكرومتر إلى 5 ميكرومتر. تركيزات تزيد من 5 ميكرومتر سوف تشبع من المرجح أن البروتين المستهدف وعادة لا ينبغي أن يتجاوز، ولكن هذا قد تختلف اعتمادا على البروتين الهدف المطلوب. إضافة 0.5 مل من البيوتين-BMCC العازلة لكل عينة، وnutate ل1 ساعة بالضبط في 4 ودرجة؛ C. لا تتجاوز 1 ساعة.

5. شطف من البروتين الهدف البيوتين، مترافق وSDS PAGE-

  1. بمجرد الانتهاء من الخطوة 4.3، يغسل برفق جميع العينات مرة واحدة في درجة الحموضة LB 6.2. إبقاء جميع العينات على الجليد بينهما يغسل. إزالة 2X العازلة عينة SDS مع عدم وجود وكلاء الحد من (الجدول 1) من تخزين -20 درجة ذوبان الجليد و° ببطء على الجليد.
  2. يغسل بلطف عينات ثلاث مرات في درجة الحموضة 7.5 + LB PMSF / مثبطات، والحفاظ على الجليد في عينات بين يغسل.
  3. إزالة طاف للغسل الثالث، وترك حبات مكعبات في الطين مع العازلة المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب. تراجع ماصة مع طرف ذات القطر الصغير (تلميح تحميل هلام أو تلميح ماصة P2 كافية) في الجزء السفلي جدا من أنبوب من خلال الطين، وجمع أي بسرعة العازلة المتبقية، والحرص على عدم تناول أي الخرز.
  4. تكملة عينة SDS 2X العازلة مع DL-Dithiothreitol (DTT) لتحقيق تركيز النهائي من 5MM. إضافة40-50 ميكرولتر من العازلة عينة 2X + DTT 5mm إلى كل عينة. إذا لزم الأمر، دوامة حبات لخلط تماما مع المخزن المؤقت العينة، وأجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية على الفور لجمع كل الخرز في بيليه، الغارقة في المخزن المؤقت العينة.
  5. تغلي جميع العينات لمدة 10 دقيقة في 75-80 ° C. اسمحوا باردة لعينات RT ل10 دقيقة ≥ على رأس مقاعد البدلاء، وأجهزة الطرد المركزي في 16000 XG / 3 دقائق لحبات تماما بيليه.
  6. إضافة مجلد كامل للبروتين مزال (طاف) من كل عينة إلى ممر واحد داخل هلام بولكرلميد مناسبة للغرب النشاف، وذلك باستخدام SDS-PAGE 7. تنظيم جميع العينات بحيث يتم تشغيل-HAM شاطف السيطرة و+ شاطف HAM لعينة واحدة على الفور المجاورة لبعضها البعض خلال SDS-PAGE (الشكل 2). بعد SDS-PAGE، ونقل إلى غشاء النيتروسليلوز أو PVDF.

6. يلطخ الغربية والكشف عن بروتين الهدف من Palmitoylation

  1. بمجرد الانتهاء من 5،6 خطوة، وغسل الغشاءمرتين في تريس مخزنة المالحة (TBS 1X) لمدة 10 دقيقة على منصة هزاز في RT.
  2. إعداد منطقة عازلة لمنع الحظر غير محددة من العلامات وزنها من ألبومين المصل البقري (BSA)، لتحقيق الوزن 3٪ في حجم TBS 1X + توين-20 0.05٪ (TBS-T) غير كافية لغمر كامل الغشاء . لstreptavidin النشاف، منع دائما مع BSA وليس الحليب المجفف. منع الغشاء لمدة 1 ساعة عند RT على منصة هزاز.
  3. يعد حل الضد من BSA + TBS-T 0.3٪. أعادت إضافة Streptavidin-HRP الأجسام المضادة في 1 ملغ / مل في الماء المقطر، مخففة في 1:5،000-1:10،000. بمجرد الانتهاء من الخطوة 6.2، يغسل الغشاء مرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة، ثم احتضان الغشاء في محلول الأجسام المضادة Streptavidin على منصة هزاز إما ل1 ساعة في RT، أو بين عشية وضحاها في C. ° 4
  4. يغسل الغشاء ثلاث مرات في TBS-T لمدة 10 دقيقة على منصة هزاز. من أجل الكشف عن إشارة palmitoylation، تعرض التلألؤ HRP باستخدام كيمياءiluminescent الركيزة عدة.
  5. من أجل تطبيع مستويات palmitoylation لكمية من البروتين من الفائدة التي كان immunoprecipitated، تجريد الغشاء باستخدام لطخة غربية عازلة للتجريد 5-10 دقيقة على منصة هزاز في RT. كرر الخطوات 6،1 حتي 6،4 باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين من الفائدة التي كانت في الأصل تستخدم لمناعي.
  6. تحديد palmitoylation من البروتين من الفائدة باستخدام صورة برامج التحليل، وتطبيع مستويات palmitoylation لكمية البروتين immunoprecipitated.

Representative Results

الفحص IP-ABE يكشف تحديدا ثيول-palmitoylation من بقايا السيستين على طول الركيزة البروتينات، ويمكن أن تستخدم لكشف palmitoylation من البروتينات العصبية immunoprecipitated بطريقة المبين في الشكل 1. العلاج من البروتين في الخلايا العصبية immunoprecipitated مع HAM (الشكل 1) يشق الربط بين thioester بالميتات ومجموعة السيستين في ثيول، مما يسمح لإدراجها محددة من البيوتين-BMCC على مجموعة ثيول المتاحة حديثا، والتي يمكن بعد ذلك يتم الكشف عن النشاف باستخدام الغربية. هذا الإغفال من الانقسام (ناقص HAM) HAM يمنع إدراج البيوتين-BMCC وظائف كعنصر تحكم سلبية على biotinylation محددة، بالميتويل من العينة زائد HAM، وبالتالي يجب دائما أن تدار المتاخمة للعينة زائد HAM لغربي النشاف بواسطة SDS-PAGE (الشكل 2).

في تجربة الأمثل (الشكل 2A)، وpalmitoylationويمكن الإشارة من الخلايا العصبية catenin-δ البروتين 2 الكشف عن النشاف بسهولة من قبل لالبيوتين-BMCC بتركيز من 1 ميكرومتر، وذلك باستخدام streptavidin مترافق مع HRP، ضد موازية عينات ناقص وزائد HAM. إشارة محددة لpalmitoylation catenin-δ يظهر في حجمه وتوقع من 160kD، فقط في العينة زائد HAM. وأكد على خصوصية هذه الإشارة من قبل reprobing لcatenin-δ مع الأجسام المضادة المحددة التي تم استخدامها في البداية لأنها immunoprecipitate، مما أدى إلى إشارة في كل من العلاجات HAM في نفس الحجم المتوقع. وتعظيم الاستفادة من مقايسة IP-ABE (الشكل 2A) يؤدي إلى الملف الشخصي غرب النشاف لعينة ناقص HAM أن تكون مميزة بسهولة من العينة زائد HAM، ويسلك الحد الأدنى من عدم وجود إشارة palmitoylation.

تركيز من البيوتين-BMCC تستخدم لتسمية cysteines palmitoylated يتطلب التحسين دقيق، وإذا كان تركيز تشبع فائقة من ثنائيةوسوف يتم استخدام otin-BMCC خلال الخطوات الكيمياء ABE (الشكل 2B)، الخلفية المفرطة وإشارات غير محددة تكون مرئية. A منحنى استجابة خطية لbiotinylation من البروتين العصبية palmitoylated، وعلى α7 مستقبلات أستيل النيكوتين، وذلك باستخدام البيوتين-BMCC قد سبق تحديدها ويظهر بالقرب من التشبع الكامل في تركيز ميكرومتر 5-10. على الرغم من أن تركيز الأمثل للالبيوتين-BMCC سوف تنحرف قليلا اعتمادا على البروتين الهدف العصبية، والعلاج مع البيوتين-BMCC بتركيز أكثر من 5 ميكرومتر المرجح فائقة تشبع البروتين الهدف، والنتيجة في الملف الشخصي لطخة غربية مع خلفية واضحة وإشارات غير محددة. كانت تستخدم سابقا A بتركيز 0.5 ميكرومتر لالبيوتين-BMCC للكشف عن البروتينات palmitoylation العصبية الأخرى بما في ذلك 25-SNAP، huntingtin، مفارز مستقبلات أمبا GluA1 وGluA2، وparalemmin وتحديد تركيز الأمثل لروايةويمكن تحقيق الهدف البروتين عن طريق التجربة والخطأ في عالم الأزياء الخطية، بدءا ضمن مجموعة من 0،5-5 ميكرومتر التي وصفنا هنا. الناتج طخة غربية الملامح streptavidin بين عينات ناقص وزائد HAM-δ لل-catenin palmitoylation تظهر مشابهة عندما تعامل مع 4 ميكرومتر البيوتين-BMCC (الشكل 2B)، مع إشارات إضافية في الخلفية أحجام مختلفة، مما يدل على أن biotinylation غير لائق حدث.

هيدروكسيل هو عامل قوي الحد الذي يؤدي إلى تدهور محدودة من البروتين المستهدف بالإضافة إلى الانقسام بكفاءة الربط thioester. وبناء على ذلك، والتحسين الكيمياء ABE يتطلب واحد لتطبيع كمية البروتين immunoprecipitated المستخدمة في عينات ناقص وزائد HAM-(الخطوات 3،2 حتي 3،3). التطبيع يتطلب استخدام كمية مضاعفة من البروتين الهدف يجمد في مقابل عينة زائد ناقص HAM، والذي ينتج في الواقع في تمييزه يغربن النشاف لمحات عن البروتين الهدف، كما هو موضح لcatenin-δ (الشكل 2A، B). ومع ذلك، إذا لم يتم تطبيع كمية البروتين الهدف يجمد بين عينات ناقص وزائد HAM-، يمكن فقدان إشارة الناتجة طخة غربية لهدف البروتين في العينة زائد HAM، كما هو موضح لcatenin-δ عندما كميات متساوية من واستخدمت علاجات البروتين في كل من HAM (الشكل 2C).

خصوصية الكيمياء ABE لوصفها البروتينات palmitoylated حساس جدا ويتطلب التحسين. المخاطر المشتركة التي ووجهت خلال فحص IP-ABE إدراج نتائج دون المستوى الأمثل هو مبين في 2B 2C والأرقام، وتدهور البروتين الهدف، بغض النظر عن العلاج HAM، والتي عادة تنتج من أقدم الكواشف ومخازن، ودرجة الحموضة غير صحيحة. من أجل تجنب هذه المزالق وتصحيح للكيمياء ABE دون المستوى الأمثل، ونضارة وتركيز الكواشف اللازمة لوينبغي دائما مخازن المدرجة في الجدول 1 أن تدرس، ويجب دائما التعديلات الرقم الهيدروجيني للجميع مخازن يتم التحقق قبل إلى تشغيل التجربة.

العازلة العمل تركيز تعليقات
العازلة تحلل (LB) في O 2 H المقطر: 1٪ IGEPAL CA-630 50MM تريس، حمض الهيدروكلوريك كلوريد الصوديوم 150mM pH7.5 الجلسرين 10٪ N / A إعداد قبل التجربة وتخزينها في 4 درجات مئوية
NEM الحل في EtOH 100٪: مسحوق مجفف بالتجميد NEM 2 M إعداد جديدة، وذلك مباشرة قبل الاستعمال.
صرامة العازلة في LB: 10 مم 0.1٪ SDS MEM N / A قبل وقت قصير من إعداد استخدام، والحفاظ على الجليد.
الرقم الهيدروجيني 7،2 LB في LB: ضبط PH إلى 7.2 بالضبط N / A استخدام الرقم الهيدروجيني متر لضبط درجة الحموضة مباشرة قبل الاستخدام.
HAM العازلة في الرقم الهيدروجيني LB 7.2: ألبوم الحل HAM 1 M (تركيز النهائي HAM) إعداد فورا قبل الاستخدام.
LB الرقم الهيدروجيني 6،2 في LB: ضبط درجة الحموضة إلى 6.2 بالضبط N / A نفس الرقم الهيدروجيني للLB 7،2
الأسهم البيوتين-BMCC الحل في DMSO: 2.1 ملغ البيوتين-BMCC الحل 8 مم إعداد فورا قبل الاستخدام.
البيوتين-BMCC العازلة في الرقم الهيدروجيني LB 6.2: إضافة البيوتين-BMCC الحل 1 حتي 5 ميكرومتر (البيوتين النهائية-BMCC التركيز) إعداد فورا قبل الاستخدام.
2 X العازلة عينة SDS، لا الاختزال في O 2 H المقطر: 5٪ 5٪ SDS الجلسرين 125mM تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 0.01٪ زرقة البروموفينول N / A إعداد قبل التجربة، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تكملة مع DTT 5 مم قبل الاستخدام.

الجدول 1. يمكن إعداد مخازن والكواشف اللازمة لفحص IP-ABE. العديد من مخازن تحلل قبل بدء التجربة، ولكن يجب فحص درجة الحموضة وتعديلها على الفور قبل استخدامه مع عداد الرقم الهيدروجيني، لضمان نجاح الكيمياء ABE. وينبغي إعداد غالبية الأسهم حلول جديدة لكل تجربة، مباشرة قبل الاستخدام. العديد من المخازن المؤقتة تتطلب الكواشف الشائعة في معظم المختبرات المجهزة لالكيمياء الحيوية، ويتم سرد المعلومات مع التخصص الكواشف بائع في جدول الكواشف والمعدات.

الصفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. وهي lysed التخطيطي للمناعي والأسيل، البيوتين صرف مقايسة (IP-ABE) لتنقية وكشف palmitoylation من البروتينات العصبية. مثقف الخلايا العصبية قرن آمون، (1) يتم تنقيته ثم بروتين الهدف باستخدام الأجسام المضادة هدف محدد، وثبتوا على sepharose و حبات المغلفة مع البروتين G أو A. والبروتين الهدف هو تنقية ثم (2) تعامل مع N-ethylmaliemide (NEM) لربط بشكل لا رجعة فيه وكتلة الأحرار ثيول (-SH) مجموعات على طول cysteines معدلة (C). وبعد ذلك البروتين الهدف (3) تعرض لمعاملة مع هيدروكسيل (HAM)، مما أدى إلى انشقاق محددة من السندات thioester في cysteines palmitoylated وإماطة اللثام عن مجموعة ثيول palmitoylated مجانا (-SH). المقبل، والهدف هو البروتين (4) treateد مع جزيء البيوتين ثيول التفاعل، البيوتين، BMCC، مما أدى إلى biotinylation محددة من السيستين palmitoylated. وأخيرا، (5) ومزال البروتين الهدف المعقدة البيروكسيديز وإزالتها من الأجسام المضادة وحبة. البروتين الهدف مع السيستين في palmitoylated (ق) الموسومة مع البيوتين الآن مناسبة لهلام الكهربائي SDS بولي الأكريلاميد (SDS-PAGE)، والغربية النشاف مع streptavidin للكشف عن palmitoylation من البروتين في الخلايا العصبية تنقيته. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. الكشف عن palmitoylation من catenin-δ البروتين الخلايا العصبية باستخدام مقايسة IP-ABE. كانت تزرع الخلايا العصبية قرن آمون الفئران ما قبل الابتدائيوصف viously في مناطق ذات كثافة من 130 خلية / مم 2 حتى النضج في 14DIV، هي lysed ذلك الحين، وتخضع لفحص IP-ABE للكشف عن palmitoylation من ركيزة حددت مؤخرا العصبية palmitoylated، وδ-catenin 2. المنقى immunoprecipitates (آي بي إس) من catenin-δ (البروتين الهدف) تم عزل باستخدام 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة δ-catenin لكل عينة (المختبرات تنبيغ BD)، وتعرضوا بعد ذلك لSDS-PAGE بالتوازي ناقص وزائد هيدروكسيل (HAM) العينات. تم الكشف عن Palmitoylation من غرب النشاف (WB) مع streptavidin-HRP (palmitoylation)، وجردت الغشاء وتعرض لWB-catenin reprobe لδ. (أ) ممثل الأمثل IP-ABE نتيجة لpalmitoylated catenin-δ (رأس السهم) تعامل مع البيوتين 1 ميكرومتر، BMCC، مما يدل على خصوصية للكشف عن الكيمياء ABE ثيول-palmitoylated البروتينات من العينات IP. (B) A الدعوة موجهة دون المستوى الأمثلsentative IP-ABE نتيجة لcatenin-δ، حيث تم استخدام تركيز الزائدة من 4 ميكرومتر البيوتين-BMCC، مما أدى إلى إشارات غير محددة والخلفية في كل من عينات ناقص وزائد HAM-(السهام). (C) لم تطبيع ممثل آخر دون المستوى الأمثل IP-WB ABE لcatenin-δ، حيث تم استخدام المفرط تركيز ميكرومتر 4 من البيوتين-BMCC، وكمية البروتين المستخدم لهذا النموذج IP زائد HAM لبوساطة HAM تدهور البروتين، مما أدى إلى فقدان إشارة في الضفة الغربية reprobe لcatenin-δ. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Discussion

الفحص IP-ABE المقدمة هنا هي طريقة بسيطة وحساسة للغاية للكشف عن البروتينات palmitoylated في الخلايا العصبية قرن آمون مثقف الابتدائي، وذلك باستخدام تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية في الغالب. هذا يجعل الفحص التكيف بسهولة للمختبرات مجهزة بالفعل مع النشاف الغربية المواد. الفحص IP-ABE يجمع بين معيار بروتوكول مناعي لعزل البروتين وشل واحد هدف، تليها الكيمياء ABE موضح سابقا 2-4 للكشف بسرعة مستويات البروتين بالميتات على الركيزة. تقنية ABE لديها مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة البروتينات palmitoylated في الأنسجة المختلفة، وخطوط الخلايا، بما في ذلك الفحص بالميتويل-البروتين على نطاق واسع لمحات palmitoylation العالمية، والكشف السريع عن مستويات من البروتين palmitoylation هدف واحد.

وقد استخدمت الأوصاف السابقة للكيمياء مختلفة ABE تحلل الخلايا واستخراج الأساليب المنظفات من البروتوكول الاضافي العصبيةeins 2، 9، مجانا-ثيول الحصار 10 و 11 و biotinylation، وتنقية البروتين المستهدف اعتمادا على تطبيق التجربة. وإضافة إلى نتائج بالميتات البروتينات العصبية في استهداف تجاه الأغشية الخلوية، والكشف عن جزء من بروتين palmitoylated الهدف يتطلب استخراجه من هذه الأغشية. وقد استخدمت منهجيات سبق وصفها ABE مجموعة متنوعة من 9 الأيونية والمنظفات غير الأيونية 8 إلى استخراج البروتينات الهدف المطلوب، واستخدام المنظفات خاصة تعتمد على البروتين المستهدفة والاتجار به غشاء المعروفة. هنا، ونحن الاستفادة من غير تغيير طبيعة والمنظفات غير الأيونية IGEPAL CA-630 لاستخراج البروتينات palmitoylated، التي لدينا لاستخراج والتحقق من صحة الكشف عن الخلايا العصبية palmitoylated catenin-δ البروتين (الشكل 2). هيكل IGEPAL CA-630 تضم مجموعة ضخمة وصلبة الرأس غير القطبية التي لاتعطيل البروتين التشكل الأصلية أو التفاعلات، ولكن الذي يسمح ارتباطه المناطق مسعور من البروتينات المرتبطة غشاء، وبالتالي منح امتزاج لهم والسماح لهم استخراج. يجب أن يكون استخراج البروتينات العصبية العديد مترجمة إلى الغشاء متشابك أو الكثافة بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي باستخدام IGEPAL CA-630، ولكن قد لا ذوبان بعض تماما، وربما تتطلب استخدام المنظفات غير يبدل طبيعة مختلفة مثل تريتون X-100، التي لديها استخدمت سابقا للكيمياء ABE 2 و 8.

وقد استخدمت العديد من الأوصاف الكيمياء ABE أيضا مختلفة كاشف biotinylation ثيول التفاعل جزيء من وصفنا هنا، ودعا البيوتين-HPDP (الحرارية العلمية)، وهو ما يتطلب أيضا وسائل مختلفة من البروتين تنقية 4. البيوتين-HPDP هو آخر ثيول التفاعل، جزيء البيوتين، مترافق maliemide الذي يحتوي على السندات ثاني كبريتيد في الذراع رابط maliemide، د هيكلياifferentiating أنه من البيوتين-BMCC، والتي لا تحتوي على هذه السندات ثاني كبريتيد. بعد biotinylation-ثيول من السيستين بروتين الحرة أو palmitoylated من البيوتين-HPDP، يمكن المشقوق السندات ثاني كبريتيد الناتجة بين البروتين المستهدفة والمجموعة البيوتين عن طريق الحد من الكواشف لاطلاق سراح مجموعة البيوتين وتجديد البروتين في صيغتها الغير معدلة، مما يجعل biotinylation من البيوتين-HPDP عابرة وقابلة للانتكاس. ولذلك، واستخدام هذا يتطلب تنقية كاشف biotinylation من البروتين المستهدف لالكواشف أفيدين يجمد، مثل streptavidin المغلفة الخرز. ومع ذلك، ثيول-biotinylation من البروتين المستهدف لالبيوتين-BMCC، كما وصفنا هنا، مستقرة ودائمة نسبيا، ويتطلب تنقية البروتين المستهدف من قبل الأجسام المضادة الموجهة ضد الهدف، وثبتوا على الخرز sepharose و. وقد استخدمت كل التقنيات ABE سابقا على نطاق واسع الشاشات، والكشف عن البروتينات واحدة من palmitoylation 2، 8-10، 12، وعلىIP-ABE الفحص وصفنا هنا هو الأمثل للكشف السريع عن palmitoylation من البروتينات واحد هدف العصبية.

الأغلبية الساحقة من palmitoylation الخلوية ينطوي على إضافة عكسها من بالميتات إلى مجموعة من ثيول cysteines (وهو ما يسمى S-palmitoylation، ونحن التعميم باسم 'palmitoylation في هذا البروتوكول)، ومع ذلك يتعرضون مجموعة محدودة جدا من البروتينات لpalmitoylation لا رجعة فيه في جليكاين وبقايا السيستين من خلال تشكيل السندات أميد مستقرة، ووصف N-palmitoylation 13. واحد الحد من الكيمياء ABE هو عدم قدرتها على كشف N-palmitoylation نظرا لاستقرار السندات أميد، وهكذا ينبغي تأكيد الفرز من البروتين المستهدف لرواية palmitoylation باستخدام 3H-بالميتات وضع العلامات الأيضية 1.

كما ذكر سابقا، يمكن الفحص IP-ABE تكييفها بسهولة لفحص palmitoylation في مقتطفات البروتين من مصادر متعددة، بما في ذلك ترانsfected خطوط الخلايا مغاير، والأنسجة الابتدائية، والثقافات العصبية الأولية من مناطق الدماغ متعددة. وقد استخدمت مقايسة IP-ABE لدراسة الاكتفاء palmitoylation من البروتينات السيستين إلى سيرين تحور لتحديد مكان وجود السيستين palmitoylated على طول البروتين الهدف لدراسة ديناميكية دوران بالميتات على البروتينات في الخلايا العصبية مثقف متشابك في ظل ظروف القاعدية 10، والتغيرات في مستويات البروتينات palmitoylation العصبية بعد تحريض نشاط الخلايا العصبية 9. حساسية وقابلية التكيف للمقايسة IP-ABE جعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة ملامح palmitoylation من البروتينات العصبية، والأمثل للكشف عن التغيرات الدينامية في palmitoylation.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة MOP-81158.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics