प्रोटीन Palmitoylation immunoprecipitation और एसाइल बायोटिन विनिमय (अबे) द्वारा संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स में जांच

Neuroscience
 

Summary

Palmitate की प्रतिवर्ती प्रोटीन के अलावा intracellular प्रोटीन की तस्करी का एक महत्वपूर्ण नियामक है. यह न्यूरॉन्स जहां कई synaptic प्रोटीन palmitoylated में विशेष रुचि का है. हम सभ्य न्यूरॉन्स, जो कई प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता में palmitoylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक सरल जैव रासायनिक विधि का उपयोग.

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Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

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Abstract

Protocol

1. लक्ष्य प्रोटीन की संवर्धित प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स से निकासी

  1. Protease inhibitors के साथ, प्राथमिक hippocampal कोशिकाओं से अंतर्जात प्रोटीन कटाई से पहले, एक lysis बफर (1 टेबल लेग) तैयार करते हैं. Lysis बफर के 10 मिलीलीटर, 10mm की एक अंतिम एकाग्रता 0.1 मिलीग्राम phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड समाधान (PMSF) जोड़ने के लिए, और 1 protease अवरोध कॉकटेल गोली जोड़ें.
  2. Lyophilized पाउडर (NEM) से N-ethylmaleimide समाधान (1 टेबल) तैयार करो. धीरे से कमरे के तापमान (आर टी) में 100% EtOH में भंग. हमेशा NEM समाधान ताजा प्रयोग के दिन के लिए तैयार करते हैं.
  3. अगले lysis बफर और NEM गठबंधन. एक ताजा 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 2M NEM समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. शीर्ष पर 20 मिलीग्राम पौंड, और जल्दी से जगह लेग जोड़ें + डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए 4 में एक कमाल मंच पर NEM (50mm का अंतिम एकाग्रता). हमेशा / NEM EtOH समाधान 1 और लेग 2 जोड़ने के लिए, तो के रूप में ठीक दो मिश्रण करने के लिए.
  4. इनक्यूबेटर और बर्फ * पर जगह से सभ्य न्यूरॉन्स निकालें. धीरे सेलुलर मीडिया को दूर करने के लिए, और धीरे ठंड फॉस्फेट के साथ दो बार धो buffered खारा (पीबीएस) 1x. Hippocampal न्यूरॉन्स, और परिमार्जन कोशिकाओं एक डिस्पोजेबल सेल चोर का उपयोग कर के पहले अच्छी तरह से करने के लिए लेग के 300 मिलीलीटर + 50mm NEM जोड़ें. सेल lysate लीजिए, तो उस समूह के अगले कुएं में lysate निर्वहन. अच्छी तरह से 2 सेल चोर का उपयोग कोशिकाओं के भीतर परिमार्जन, जमा है, और दोहराने के एक तिहाई अच्छी तरह से उपयोग, अगर आगे lysate ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है.
  5. एक पूर्व ठंडा (बर्फ पर), 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सेल lysate ले लीजिए. 1.4 पौंड की 100 μl + 50mm NEM कदम का उपयोग करने के लिए किसी भी शेष सेल lysate इकट्ठा दोहराएँ. साढ़े गेज सिरिंज 26 5-6 बार के माध्यम से कुल सेल lysate पास यांत्रिक lysis में सहायता करने के लिए सावधान किया जा रहा है समाधान में बुलबुले उड़ाने के लिए नहीं है. बजाय एक बर्फ पर 15 सेकंड के लिए sonicate कर सकते हैं, अगर उपकरण उपलब्ध है. 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥ 30 मिनट के लिए सेल lysate डोलना
  6. सेल लाइसा स्पष्ट१६००० XG / 30 मिनट पर centrifugation क्रम में गोली संयुक्त राष्ट्र lysed कोशिकाओं और डिटर्जेंट अघुलनशील सामग्री द्वारा ते.
  7. लीजिए एक नया पूर्व ठंडा बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल lysate (तैरनेवाला) को मंजूरी दे दी है. कोशिकाओं के सभी समूहों के लिए फसल प्रोटोकॉल दोहराएँ. उपाय सभी lysate बीसीए परख का उपयोग कर नमूने में प्रोटीन एकाग्रता, और कोशिकाओं के समूहों से सभी lysate नमूने की मात्रा मानक के अनुसार 500 ग्राम की एक न्यूनतम के साथ सिफारिश बिल्कुल बराबर कुल प्रोटीन,. लेग + 50mm NEM के साथ नमूने 500 μl कुल मात्रा के ऊपर.
  8. Lysate नमूना के प्रत्येक प्राथमिक लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के 1-5 ग्राम जोड़ें. एंटीबॉडी lysate मिश्रित 4 में रातोंरात नमूने डिग्री सेल्सियस डोलना

* प्राथमिक चूहे hippocampal न्यूरॉन्स / अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से पकवान में लगभग 250.000 कोशिकाओं के घनत्व में संवर्धित किया जाना चाहिए एक सीरम मुक्त एक B27 neuronal पूरक वाले मीडिया में, के रूप में पहले 5 में वर्णित है, और इच्छा के लिए होसमय की लंबाई, आमतौर पर 14-16 दिन (DIV) में इन विट्रो परिपक्वता हासिल. कुल प्रोटीन की 500 ग्राम की एक न्यूनतम करने के लिए सफलतापूर्वक immunoprecipitate और एक लक्ष्य neuronal प्रोटीन है, जो आम तौर पर एक 6-अच्छी तरह से पकवान के 2-3 कुओं की आवश्यकता biotinylate करने के लिए सिफारिश की है.

2. एंटीबॉडी बाध्य लक्ष्य प्रोटीन की वर्षा

  1. Precipitating और immobilizing पहले एक लक्ष्य प्रोटीन, प्रोटीन, या प्रोटीन जी लेपित sepharose मनकों की एक 50% घोल तैयार करते हैं. विशेष रूप से, 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों ≥ नमूना प्रति sepharose मोतियों की 60 μl जोड़ने के लिए, यह सुनिश्चित करना है कि सभी नमूनों, मोतियों की बराबर मात्रा में है. चुंबकीय मोती भी उपयुक्त हैं यदि उपकरण उपलब्ध है.
  2. प्रत्येक नमूना प्रतिरक्षी - lysate 50% के घोल की एक समान मात्रा में जोड़ें, और 4 में ≥ 1 घंटे के लिए डोलना ° सी.

3. Hydroxylamine विखंडन (HAM): एसाइल बायोटिन विनिमय

  1. जबकि 2.2 कदम प्रदर्शन, di के lysis बफर (पौंड) के साथ ट्यूब की एक संख्या तैयारfferent PHS. पीएच इन चरणों के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और हमेशा एक पीएच मीटर का उपयोग कर समायोजित किया जाना चाहिए. नमूना प्रति पौंड 7.2 पीएच, और नमूना के प्रति कड़े बफर (1 टेबल) की 0.5 मिलीलीटर के 2 मिलीलीटर तैयार. इसके अलावा 0.5 मिलीलीटर लेग 1.1-1.3 चरणों में नमूना प्रति 10mM NEM तैयार. सभी lysis बफ़र्स PMSF और protease अवरोध गोलियाँ 1.1 चरण में जोड़ें.
    1. Hydroxylamine (HAM) एक शक्तिशाली कम एजेंट, Palmitate दरार cysteines से biotinylation (1 चित्रा) के लिए आवश्यक है जिसका है, और हैम दरार की चूक एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. दो नमूने, एक हैम दरार कदम (HAM) omitting, और एक हैम कदम (HAM +) सहित में मोतियों की प्रत्येक नमूना भाजित. प्रोटीन HAM उपचार की वजह से गिरावट के लिए मानक के अनुसार, एक तिहाई में प्रत्येक नमूना विभाजित करने के लिए, 1 - HAM नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया मोती की / 3 के साथ करना चाहिए, और शेष / 2 3 + HAM उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. 1 अतिरिक्त तैयार करो.बर्फ पर 5 मिलीलीटर ट्यूब, प्रत्येक नमूने के लिए हैम नियंत्रण के रूप में लेबल. 2.2 कदम के बाद, धीरे 0.5 / 1 XG मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस (इस गति, अवधि, और शेष सभी कदम जब तक अन्यथा न कहा गया के लिए तापमान में अपकेंद्रित्र) में सभी 'नमूने मोती अपकेंद्रित्र ट्यूबों बर्फ पर जगह तैरनेवाला हटाने, और लेग + 10mM NEM के 600 μl में मोती फिर से स्थगित कर देते हैं.
  2. फिर से suspending lysis बफर + NEM 10mM में मोती 'नमूने के बाद तुरंत कि नमूना - हैम ट्यूब में बर्फ पर नमूना घोल lysate मनका के 200 μl, और छुट्टी लेने. पौंड की एक अतिरिक्त 300 μl + - HAM नमूना 10mM NEM, और प्रत्येक नमूने में 500 μl के एक कुल के लिए एक अतिरिक्त 100 + HAM नमूना μl जोड़ें. बर्फ पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं.
  3. पुनः को निलंबित (धो) हैम और + HAM नमूनों धीरे 0.5 मिलीलीटर कड़े बफर के साथ, नमूना प्रति. इस कदम जल्दी प्रदर्शन, के रूप में एक लंबे समय तक एसडीएस ऊष्मायन से बाध्य एंटीबॉडी के हटाने में परिणाम होगामोती.
  4. धीरे सभी नमूनों .5 / लेग 7.2 पीएच मिलीलीटर नमूने में तीन बार धोने, और रूप में कदम 3.2b में washes के बीच नीचे स्पिन.
  5. जबकि 3.5 कदम प्रदर्शन, एक हैम बफर (1 टेबल) तैयार करते हैं. एक नया ट्यूब जोड़ें hydroxylamine समाधान की उचित मात्रा 0.5 मिलीलीटर लेग पीएच 7.2, प्रति + HAM नमूना के एक मात्रा में 1M की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए. हमेशा HAM बफर ताजा प्रयोग के दिन के लिए तैयार करते हैं. सभी HAM नमूने, और 0.5 / सभी + HAM नमूने के लिए हैम बफर मिलीलीटर नमूना .5 / लेग 7.2 पीएच मिलीलीटर नमूने जोड़ें.
  6. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर सभी नमूनों डोलना. 1 घंटा से अधिक नहीं हो.

4. लेबल बायोटिन बीएमसीसी: एसाइल बायोटिन विनिमय

  1. जबकि 3.6 कदम प्रदर्शन, लेग पीएच के 2 मिलीलीटर तैयार नमूना प्रति (1 टेबल) 6.2 3.1 चरण में है. बर्फ पर लेग 6.2 पीएच जगह की जरूरत तक. इसके अलावा बायोटिन बीएमसीसी (1 तालिका) के एक शेयर समाधान तुरंत तैयार उपयोग करने से पहले. बाहर exac वजनtly बायोटिन - बीएमसीसी के 2.1 मिलीग्राम, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जमा है, और धीरे आरटी पर एक कमाल मंच पर रखने से 0.5 मिलीलीटर डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में भंग करने के लिए 8mm एकाग्रता (का उपयोग करने के लिए पाउडर को तोड़ने नहीं एक विंदुक हासिल ).
  2. एक बार 3.6 कदम पूरा हो गया है, धीरे मोती एक बार पीएच 6.2 lysis बफर, धोने के लिए अवशिष्ट HAM बफर हटा. तैरनेवाला निकालें और बर्फ पर नमूने जगह.
  3. बायोटिन - बीएमसीसी एक maliemide संयुग्मित बायोटिन अणु है कि cysteines से मुक्त thiol समूहों (1 चित्रा) के लिए एक उच्च आत्मीयता है. जबकि 4.2 कदम प्रदर्शन, नमूना प्रति बायोटिन बीएमसीसी बफर के 0.5 मिलीलीटर (1 टेबल), 5 सुक्ष्ममापी 0.5 सुक्ष्ममापी के बीच काम कर रहे एकाग्रता में तैयार करते हैं. 5 सुक्ष्ममापी अधिक सांद्रता की संभावना लक्ष्य छह प्रोटीन तर जाएगा, और आम तौर पर पार कर नहीं होना चाहिए, लेकिन यह वांछित लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकती है. प्रत्येक नमूना बायोटिन बीएमसीसी बफर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और 4 में वास्तव में 1 घंटे के लिए और डोलनाडिग्री, सी. 1 घंटा से अधिक नहीं हो.

5. बायोटिन - संयुग्मित लक्ष्य प्रोटीन और एसडीएस पृष्ठ की क्षालन

  1. एक बार 4.3 कदम पूरा हो गया है, धीरे सभी नमूनों को एक बार धो लेग 6.2 पीएच में. Washes के बीच बर्फ पर सभी नमूनों में रखें. -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से कोई एजेंट (1 टेबल) को कम करने के साथ 2x एसडीएस नमूना बफर निकालें और धीरे धीरे बर्फ पर पिघलना करने के लिए.
  2. धीरे नमूने लेग 7.5 पीएच में तीन बार धो + PMSF / Inhibitors, और washes के बीच बर्फ पर नमूने रखने के.
  3. 3 धोने की सतह पर तैरनेवाला निकालें, ट्यूब के नीचे शेष बफर के साथ एक घोल में pelleted मोतियों छोड़ने. ट्यूब के माध्यम से घोल बहुत नीचे में एक टिप छोटे व्यास (एक जेल लोड टिप या p2 विंदुक टिप पर्याप्त हैं) के साथ एक विंदुक डुबकी, और जल्दी से किसी भी शेष बफर इकट्ठा, सावधान किया जा रहा है के लिए नहीं ले किसी भी मोती.
  4. डीएल Dithiothreitol (डीटीटी) के साथ 2x एसडीएस नमूना बफर अनुपूरक 5mm की एक अंतिम एकाग्रता हासिल करने के लिए. जोड़ना2x नमूना बफर के 40-50 μl + प्रत्येक नमूने 5mm डीटीटी. यदि आवश्यक हो, भंवर मोती नमूना बफर के साथ पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए, और तुरंत उच्च गति पर अपकेंद्रित्र एक गोली में सभी मोती, नमूना बफर में जलमग्न इकट्ठा.
  5. 75-80 में 10 मिनट के लिए सभी नमूनों उबाल लें ° सी. ≥ 10 मिनट बेंच शीर्ष पर, और अपकेंद्रित्र में 16,000 / 3 XG पूरी तरह से गोली मोती मिनट के लिए नमूने आरटी शांत करते हैं.
  6. प्रत्येक नमूने से polyacrylamide पश्चिमी सोख्ता, 7 एसडीएस पृष्ठ का उपयोग करने के लिए उपयुक्त जेल के भीतर एक सिंगल लेन eluted प्रोटीन (तैरनेवाला) की पूरी मात्रा जोड़ें. सभी नमूनों इतना है कि हैम नियंत्रण और + एक नमूना के लिए हैम eluent eluent आसन्न तुरंत एसडीएस PAGE (2 छवि) के दौरान एक दूसरे के लिए चलाए जा रहे हैं व्यवस्थित करें. एसडीएस पृष्ठ के बाद, एक PVDF या nitrocellulose झिल्ली हस्तांतरण.

6. सोख्ता और Palmitoylation लक्ष्य प्रोटीन की जांच पश्चिमी

  1. एक बार कदम 5.6 पूरा हो गया है, झिल्ली धोनेमें आरटी पर एक कमाल की मंच पर 10 मिनट के लिए दो बार Saline (1x टीबीएस) Tris बफर.
  2. एक अवरुद्ध वजन गोजातीय सीरम albumin (BSA), 1x टीबीएस की मात्रा में 3% वजन हासिल द्वारा गैर विशिष्ट लेबलिंग ब्लॉक बफर तैयार 0.05 Tween-20% (टीबीएस टी) है कि पूरी तरह से झिल्ली डूब पर्याप्त है + . के लिए सोख्ता streptavidin, हमेशा BSA के साथ ब्लॉक और दूध पाउडर नहीं है. आर टी में 1 घंटे के लिए एक कमाल मंच पर झिल्ली ब्लॉक.
  3. टीबीएस-टी + 0.3% BSA के एक एंटीबॉडी समाधान तैयार. Streptavidin-एचआरपी एंटीबॉडी जोड़ें 1 आसुत जल में मिलीग्राम / मिलीलीटर, 1:5,000-1:10,000 में पतला पर पुनर्गठन किया. बार 6.2 चरण पूरा हो गया है, झिल्ली एक बार 10 मिनट के लिए टीबीएस - टी में धो लें, तो या तो एक कमाल मंच पर आरटी में 1 घंटे के लिए streptavidin एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली, सेते हैं या 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात
  4. झिल्ली एक कमाल मंच पर 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं टीबीएस टी में. संकेत का पता लगाने के लिए आदेश में palmitoylation, एचआरपी luminescence का उपयोग कर एक रसायन का पर्दाफाशiluminescent सब्सट्रेट किट.
  5. आदेश में palmitoylation स्तर ब्याज कि immunoprecipitated था प्रोटीन की मात्रा मानक के अनुसार, आरटी पर एक कमाल मंच पर 5-10 मिनट के लिए वेस्टर्न ब्लॉट विपठ्ठन बफर का उपयोग झिल्ली पट्टी. 6.4 ब्याज की प्रोटीन है कि मूल रूप से immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया गया था के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग - 6.1 चरणों को दोहराएँ.
  6. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज की प्रोटीन की palmitoylation यों, और immunoprecipitated प्रोटीन की मात्रा palmitoylation स्तर मानक के अनुसार.

Representative Results

परख आईपी अबे विशेष रूप से सब्सट्रेट प्रोटीन के साथ सिस्टीन अवशेषों की thiol palmitoylation का पता लगाता है, और एक चित्रा 1 में चित्रित ढंग में immunoprecipitated neuronal प्रोटीन की palmitoylation का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हैम (1 चित्रा) के साथ immunoprecipitated neuronal प्रोटीन का उपचार Palmitate और एक सिस्टीन thiol समूह के बीच thioester उठाना cleaves, नव उपलब्ध thiol समूह है, जो बाद में पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर पाया जा सकता है पर बायोटिन बीएमसीसी की विशिष्ट समावेश के लिए अनुमति देता है. हैम (ऋण HAM) दरार की चूक बायोटिन - बीएमसीसी के समावेश और विशिष्ट नमूना प्लस HAM palmitoyl biotinylation के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है रोकता है, और इसलिए हमेशा नमूना प्लस HAM सटे पश्चिमी के लिए चलाने चाहिए एसडीएस पृष्ठ (2 चित्रा) सोख्ता.

एक अनुकूलित (2A चित्रा) प्रयोग, palmitoylationneuronal प्रोटीन 2 δ-catenin के संकेत बायोटिन - बीएमसीसी के लिए 1 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता पर सोख्ता, एचआरपी साथ संयुग्मित streptavidin का उपयोग समानांतर ऋण और प्लस - हैम नमूने के खिलाफ आसानी से पता लगाया जा सकता है. δ-catenin के लिए विशिष्ट palmitoylation संकेत इसके 160kD की अनुमानित आकार में, प्लस - हैम नमूना में ही प्रकट होता है. इस संकेत की विशिष्टता δ-catenin के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी है कि शुरू में इसे immunoprecipitate इस्तेमाल किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक ही आकार में भविष्यवाणी की दोनों HAM उपचार में एक संकेत में साथ reprobing द्वारा पुष्टि की गई. परख आईपी अबे (2A चित्रा) के अनुकूलन ऋण HAM एक नमूना है कि प्लस HAM नमूना से आसानी से अलग पहचाना है एक पश्चिमी सोख्ता प्रोफाइल में परिणाम, और कोई palmitoylation संकेत करने के लिए कम से कम दर्शाती.

बायोटिन - बीएमसीसी की एकाग्रता लिए palmitoylated cysteines लेबल किया सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है, और अगर एक सुपर saturating द्वि की एकाग्रताOtin बीएमसीसी अबे रसायन शास्त्र (चित्रा 2B) कदम, अत्यधिक पृष्ठभूमि और गैर विशिष्ट संकेतों के दौरान प्रयोग किया जाता है दिखाई जाएगी. एक palmitoylated neuronal प्रोटीन, α7 निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर, बायोटिन बीएमसीसी का उपयोग कर के biotinylation लिए रेखीय प्रतिक्रिया वक्र पहले 6 निर्धारित किया गया है, और 5-10 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता पर पूर्ण संतृप्ति के पास से पता चलता है. हालांकि बायोटिन बीएमसीसी का इष्टतम एकाग्रता हटना होगा थोड़ा neuronal लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर करता है, बायोटिन - बीएमसीसी साथ 5 सुक्ष्ममापी से अधिक में एक एकाग्रता में उपचार की संभावना दिखाई पृष्ठभूमि के साथ लक्ष्य प्रोटीन, एक वेस्टर्न ब्लॉट प्रोफ़ाइल में और परिणाम सुपर तर जाएगा और गैर विशिष्ट संकेत है. बायोटिन - बीएमसीसी के लिए 0.5 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता पहले SNAP-25, huntingtin, AMPA रिसेप्टर GluA1 और GluA2 सब यूनिटों, और 8 paralemmin, और इष्टतम एकाग्रता के एक उपन्यास के लिए दृढ़ संकल्प सहित अन्य neuronal प्रोटीन की palmitoylation का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया थालक्ष्य प्रोटीन रैखिक फैशन में परीक्षण और त्रुटि के द्वारा पूरा किया जा सकता है, 0.5-5 सुक्ष्ममापी कि हम यहाँ का वर्णन की सीमा के भीतर शुरू. परिणामस्वरूप δ catenin palmitoylation के लिए ऋण और प्लस - हैम के नमूनों के बीच streptavidin वेस्टर्न ब्लॉट प्रोफाइल समान दिखाई देते हैं जब अतिरिक्त पृष्ठभूमि संकेतों के साथ 4 बायोटिन (चित्रा 2B) बीएमसीसी, विभिन्न आकार, जो इंगित करता है कि अनुचित biotinylation हुई सुक्ष्ममापी के साथ इलाज किया.

Hydroxylamine लक्ष्य प्रोटीन की अपनी thioester संबंध के कुशल दरार के अलावा सीमित गिरावट में परिणाम है कि एक शक्तिशाली कम एजेंट है. नतीजतन, अबे रसायन शास्त्र का अनुकूलन एक आवश्यक immunoprecipitated ऋण और प्लस - हैम के नमूने (3.2 कदम 3.3) के लिए इस्तेमाल प्रोटीन की मात्रा मानक के अनुसार है. सामान्य immobilized प्लस बनाम ऋण HAM नमूना है, जो वास्तव में अप्रभेद्य wester में परिणाम में प्रोटीन लक्ष्य की डबल राशि के उपयोग की आवश्यकता हैn लक्ष्य प्रोटीन के लिए सोख्ता प्रोफाइल, रूप में δ catenin (चित्रा 2A, बी) के लिए दिखाया गया है. हालांकि, अगर immobilized लक्ष्य प्रोटीन के राशि ऋण और प्लस - हैम नमूने के बीच नहीं सामान्यीकृत है, परिणामी प्लस HAM नमूना में लक्ष्य प्रोटीन के लिए वेस्टर्न ब्लॉट संकेत, खो दिया जा सकता है रूप में δ catenin के लिए दिखाया गया है जब बराबर मात्रा की प्रोटीन दोनों HAM उपचार (चित्रा 2C) में इस्तेमाल किया गया.

लिए अबे रसायन शास्त्र की विशिष्टता palmitoylated प्रोटीन लेबलिंग बहुत संवेदनशील है और अनुकूलन की आवश्यकता है. आम परख आईपी अबे के दौरान सामना नुकसान उप इष्टतम आंकड़े 2B और 2C में दिखाया परिणामों और लक्ष्य प्रोटीन, हैम इलाज है, जो आम तौर पर बड़े अभिकर्मकों और buffers की वजह से कर रहे हैं और गलत पीएच के स्वतंत्र के क्षरण शामिल हैं. आदेश में इन कमियों से बचने के लिए और उप इष्टतम अबे रसायन शास्त्र के लिए सही है, ताजगी और अभिकर्मकों की एकाग्रता के लिए आवश्यकतालिका 1 में सूचीबद्ध buffers हमेशा की तरह, जांच किया जाना चाहिए और सभी buffers का पीएच समायोजन हमेशा प्रयोग चलाने के लिए पहले की जाँच की जानी चाहिए.

बफर कार्य एकाग्रता टिप्पणियां
Lysis बफर (पौंड) 1% IGEPAL सीए 630 50mm Tris - एचसीएल pH7.5 150mm NaCl 10% ग्लिसरॉल: आसुत एच 2 हे N / A 4 प्रयोग और दुकान से पहले तैयार डिग्री सेल्सियस
NEM समाधान NEM lyophilized पाउडर: 100% EtOH एम 2 ताजा तुरंत उपयोग करने से पहले, तैयार.
कड़े बफर लेग में 10 मिमी सदस्य एसडीएस: 0.1% N / A उपयोग करने से पहले शीघ्र ही तैयार है, बर्फ पर रख.
लेग 7.2 पीएच लेग: 7.2 बिल्कुल पीएच समायोजित N / A पीएच मीटर का उपयोग करने के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत पीएच को समायोजित करने के लिए.
HAM बफर स्टॉक HAM समाधान: लेग 7.2 पीएच में एम 1 (अंतिम HAM एकाग्रता) उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार करो.
लेग पीएच 6.2 लेग: 6.2 बिल्कुल पीएच समायोजित N / A लेग 7.2 पीएच के लिए के रूप में भी
स्टॉक समाधान बायोटिन - बीएमसीसी DMSO: 2.1 मिलीग्राम समाधान बायोटिन बीएमसीसी 8 मिमी उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार करो.
बायोटिन - बीएमसीसी बफर लेग 6.2 पीएच में: बायोटिन बीएमसीसी समाधान जोड़ें 1 - 5 सुक्ष्ममापी (अंतिम एकाग्रता बायोटिन बीएमसीसी) उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार करो.
2x एसडीएस नमूना बफर, कोई को कम करने एजेंट 5% एसडीएस 5% ग्लिसरॉल 125mm Tris - एचसीएल पीएच 6.8 0.01% Bromophenol ब्लू: आसुत एच 2 हे N / A -20 डिग्री सेल्सियस पर, प्रयोग और दुकान से पहले प्रयोग तक तैयार. 5 मिमी डीटीटी के साथ प्रयोग करने से पहले अनुपूरक.

तालिका 1. Buffers और अभिकर्मकों परख आईपी अबे के लिए आवश्यक lysis buffers के कई प्रयोग, लेकिन पीएच और जाँच की जानी चाहिए एक पीएच मीटर के साथ उपयोग करने से पहले तुरंत समायोजित की शुरुआत से पहले अबे रसायन शास्त्र की सफलता सुनिश्चित करने के लिए तैयार किया जा सकता है. शेयर समाधान के बहुमत हर प्रयोग के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए, का उपयोग करने से पहले तुरंत. Buffers के कई सबसे जैव रसायन के लिए सुसज्जित प्रयोगशालाओं के लिए आम अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, और विक्रेता जानकारी के साथ विशेषता अभिकर्मकों अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका में सूचीबद्ध हैं.


चित्रा 1. Immunoprecipitation और एसाइल बायोटिन विनिमय परख (आईपी अबे) शुद्ध और neuronal प्रोटीन की palmitoylation का पता लगाने के योजनाबद्ध संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स. Lysed कर रहे हैं, (1) एक प्रोटीन लक्ष्य तो एक लक्ष्य विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर शुद्ध होता है, और sepharose पर immobilized मोती प्रोटीन जी या ए के साथ लेपित शुद्ध लक्ष्य प्रोटीन है तो (2) N-ethylmaliemide (NEM) के साथ इलाज के लिए irreversibly बाँध और unmodified cysteines (सी) के साथ मुक्त thiol समूहों (एसएच) ब्लॉक. लक्ष्य प्रोटीन (3) hydroxylamine (HAM) के साथ इलाज के लिए किए, एक मुक्त palmitoylated thiol समूह (एसएच) के palmitoylated cysteines और unmasking में thioester बांड की विशिष्ट दरार में जिसके परिणामस्वरूप. अगले, लक्ष्य प्रोटीन treate (4)घ बायोटिन thiol प्रतिक्रियाशील अणु, बायोटिन बीएमसीसी, को palmitoylated सिस्टीन के विशिष्ट biotinylation में जिसके परिणामस्वरूप के साथ. अंत में, (5) biotinylated लक्ष्य प्रोटीन eluted और एंटीबॉडी और मोती से हटा दिया है. अब अपने palmitoylated सिस्टीन (ओं) बायोटिन के साथ टैग के साथ लक्ष्य प्रोटीन एसडीएस पाली acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ), और पश्चिमी streptavidin साथ सोख्ता शुद्ध neuronal प्रोटीन की palmitoylation के लिए पता लगाने के लिए उपयुक्त है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Neuronal प्रोटीन δ catenin की palmitoylation की जांच परख आईपी अबे का उपयोग प्राथमिक चूहे hippocampal न्यूरॉन्स पूर्व के रूप में बड़े हो रहे थेviously 5 वर्णित, 14DIV परिपक्वता तक 130/2 मिमी कोशिकाओं के घनत्व पर थे, तो lysed, और परख आईपी अबे अधीन करने के लिए एक हाल ही में पहचाना palmitoylated neuronal सब्सट्रेट, 2 δ catenin की palmitoylation का पता लगाने. (आईपी) शुद्ध immunoprecipitates δ catenin (लक्ष्य प्रोटीन) की गया नमूना प्रति δ-catenin एंटीबॉडी (बी Transduction प्रयोगशालाओं) की 5 ग्राम का उपयोग पृथक किया गया और फिर समानांतर ऋण और प्लस hydroxylamine (HAM) में एसडीएस पृष्ठ अधीन नमूने हैं. Palmitoylation streptavidin एचआरपी (palmitoylation) के साथ पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) के द्वारा पाया गया था, और झिल्ली छीन लिया और δ-catenin के लिए एक reprobe पश्चिम बंगाल के अधीन था. (ए) (arrowhead) palmitoylated δ catenin 1 सुक्ष्ममापी बायोटिन - बीएमसीसी के साथ इलाज किया, आईपी के नमूनों से thiol palmitoylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए अबे रसायन शास्त्र की विशिष्टता illustrating के लिए एक अनुकूलित प्रतिनिधि आईपी अबे परिणाम. (बी) के एक उप इष्टतम प्रतिनिधिδ-catenin, जहां 4 बायोटिन बीएमसीसी सुक्ष्ममापी की एक अतिरिक्त एकाग्रता का इस्तेमाल किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप दोनों ऋण और प्लस - हैम के नमूने (तीर) में गैर विशिष्ट संकेतों और पृष्ठभूमि में के लिए sentative परिणाम आईपी अबे. (सी) δ-catenin,, जहां को एक अत्यधिक 4 बायोटिन बीएमसीसी की सुक्ष्ममापी एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था और प्रोटीन की मात्रा से अधिक हैम आईपी नमूना के लिए इस्तेमाल के लिए एक और उप इष्टतम प्रतिनिधि पश्चिम बंगाल आईपी अबे हैम मध्यस्थता के लिए नहीं सामान्यीकृत था प्रोटीन गिरावट, δ - catenin के लिए एक reprobe वाइड में खो संकेत में जिसके परिणामस्वरूप. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

आईपी ​​अबे यहाँ प्रस्तुत परख, ज्यादातर मानक जैव रासायनिक तकनीक का उपयोग कर सभ्य प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स में palmitoylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक सरल और बेहद संवेदनशील तरीका है. यह परख आसानी से पहले से ही पश्चिमी सोख्ता सामग्री से लैस प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलनीय बनाता है. परख आईपी अबे एक मानक immunoprecipitation प्रोटोकॉल के लिए अलग और एक लक्ष्य प्रोटीन स्थिर, पहले वर्णित अबे 2-4 रसायन शास्त्र द्वारा पीछा करने के लिए तेजी से एक सब्सट्रेट प्रोटीन पर Palmitate के स्तर का पता लगाने को जोड़ती है. अबे तकनीक विभिन्न ऊतकों और सेल लाइनों में palmitoylated प्रोटीन की जांच, सहित बड़े पैमाने पर वैश्विक palmitoylation प्रोफाइल की स्क्रीनिंग palmitoyl प्रोटिओमिक, और एक ही लक्ष्य प्रोटीन के palmitoylation स्तर का तेजी से पता लगाने के लिए आवेदनों की एक विस्तृत रेंज है.

अबे रसायन शास्त्र के पिछले विवरण अलग अलग तरीकों सेल डिटर्जेंट और neuronal prot की निकासी का उपयोग किया हैeins 2, 9, मुफ्त 10 thiol नाकाबंदी, 11, biotinylation, और लक्ष्य 4 प्रोटीन की शुद्धि, प्रयोग के आवेदन पर निर्भर करता है. Palmitate सेलुलर झिल्लियाँ की ओर अपने लक्ष्यीकरण, और लक्ष्य प्रोटीन palmitoylated अंश का पता लगाने में neuronal प्रोटीन परिणाम के अलावा इन झिल्लियों से इसकी निकासी की आवश्यकता होगी. पहले वर्णित अबे के तरीके में 9 ईओण और गैर ईओण डिटर्जेंट 8 के लिए वांछित लक्ष्य प्रोटीन निकालने की एक किस्म का उपयोग किया है, और एक विशेष डिटर्जेंट के उपयोग लक्ष्य प्रोटीन और ज्ञात झिल्ली की तस्करी पर निर्भर करता है. यहाँ, हम गैर denaturing और गैर ईओण डिटर्जेंट IGEPAL CA-630 के लिए palmitoylated प्रोटीन है, जो हम और palmitoylated neuronal प्रोटीन δ catenin (2 चित्रा) की निकासी का पता लगाने के लिए मान्य है निकालने का उपयोग संरचना CA-630 IGEPAL की एक भारी और कठोर गैर ध्रुवीय सिर समूह नहीं है किदेशी प्रोटीन रचना या बातचीत को बाधित करने के लिए, लेकिन जो झिल्ली जुड़े प्रोटीन के hydrophobic क्षेत्रों के साथ अपने सहयोग की अनुमति देता है, जिससे उन्हें miscibility conferring और उनकी निकासी की अनुमति है. कई neuronal synaptic या synapses के बाद synaptic घनत्व झिल्ली स्थानीयकृत प्रोटीन CA-630 IGEPAL का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए, लेकिन कुछ पूरी तरह से, नहीं solubilize और X-100 ट्राइटन की तरह एक अलग डिटर्जेंट गैर denaturing है, जो के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है हो सकता है पहले अबे रसायन शास्त्र 2, 8 के लिए उपयोग किया.

अबे रसायन शास्त्र के कई वर्णन भी एक अलग thiol प्रतिक्रियाशील अणु हम यहाँ का वर्णन, बायोटिन HPDP (थर्मो वैज्ञानिक) कहा जाता है, जो भी प्रोटीन शुद्धि 4 की एक अलग साधन आवश्यक से biotinylation अभिकर्मक का उपयोग किया है. बायोटिन HPDP एक और thiol प्रतिक्रियाशील, बायोटिन maliemide संयुग्मित अणु है कि maliemide linker हाथ में एक डाइसल्फ़ाइड बांड शामिल है, structurally घयह बायोटिन बीएमसीसी, जो इस डाइसल्फ़ाइड बांड को शामिल नहीं करता है से ifferentiating. बाद एक प्रोटीन बायोटिन - HPDP द्वारा मुफ्त या palmitoylated सिस्टीन की thiol biotinylation, परिणामस्वरूप लक्ष्य प्रोटीन और बायोटिन समूह के बीच डाइसल्फ़ाइड बंधन अभिकर्मकों को कम करने के लिए बायोटिन समूह जारी है और अपने असंशोधित रूप में प्रोटीन पुनर्जन्म cleaved किया जा सकता है, biotinylation बनाने बायोटिन HPDP क्षणिक और प्रतिवर्ती. इसलिए, उपयोग के इस biotinylation अभिकर्मक immobilized streptavidin लेपित मोती के रूप में avidin अभिकर्मकों, द्वारा एक लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि की आवश्यकता है. हालांकि, बायोटिन - बीएमसीसी द्वारा एक लक्ष्य प्रोटीन की thiol biotinylation, के रूप में हम यहाँ का वर्णन, स्थिर और अपेक्षाकृत स्थायी है, और एक एंटीबॉडी लक्ष्य के खिलाफ निर्देशित, और sepharose मनकों पर immobilized द्वारा लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि की आवश्यकता है. दोनों अबे तकनीक पहले से किया गया है बड़े पैमाने पर स्क्रीन, और 2 सिंगल प्रोटीन, 8-10, 12 की palmitoylation का पता लगाने के लिए उपयोग किया है, औरआईपी ​​अबे परख हम यहाँ का वर्णन एकल neuronal लक्ष्य प्रोटीन की palmitoylation के तेजी से पता लगाने के लिए इष्टतम है.

सेलुलर palmitoylation की एक भारी बहुमत Palmitate की प्रतिवर्ती cysteines की thiol समूह (एस palmitoylation, जो हम इस प्रोटोकॉल में palmitoylation 'के रूप में सामान्य करार दिया है) के अलावा शामिल है, लेकिन प्रोटीन का एक बहुत ही सीमित समूह ग्लाइसिन अपरिवर्तनीय palmitoylation के अधीन हैं और स्थिर एमाइड बांड के गठन के माध्यम से सिस्टीन अवशेषों, 13 N-palmitoylation करार दिया. अबे रसायन शास्त्र की एक सीमा एमाइड बांड की स्थिरता के लिए N-palmitoylation कारण का पता लगाने में असमर्थता है, और इसलिए एक उपन्यास लक्ष्य palmitoylation के लिए प्रोटीन की स्क्रीनिंग 3H Palmitate चयापचय 1 लेबलिंग का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए.

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, आईपी अबे परख आसानी से कई स्रोतों से प्रोटीन के अर्क में palmitoylation ट्रॅन सहित की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैheterologous सेल लाइनों, प्राथमिक ऊतक, और कई मस्तिष्क क्षेत्रों से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों sfected. परख आईपी अबे उत्परिवर्तित सिस्टीन करने सेरीन एक लक्ष्य 8 प्रोटीन साथ एक palmitoylated सिस्टीन के स्थान की पहचान प्रोटीन की प्रचुरता palmitoylation बेसल 10 शर्तों के तहत सभ्य न्यूरॉन्स में synaptic प्रोटीन पर गतिशील Palmitate कारोबार की जांच करने के लिए जांच के लिए उपयोग किया गया है, परिवर्तन और neuronal प्रोटीन की palmitoylation स्तर में neuronal गतिविधि 9 की प्रेरण के बाद. संवेदनशीलता और अबे आईपी परख अनुकूलनशीलता यह आदर्श neuronal प्रोटीन की palmitoylation प्रोफाइल की जांच, और गतिशील palmitoylation में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इष्टतम के लिए अनुकूल बनाते हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

यह काम स्वास्थ्य एमओपी +८११५८ अनुसंधान की कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
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  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
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Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

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