Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Neuroscience
 

Summary

A adição de palmitato reversível às proteínas é um importante regulador do tráfico intracelular de proteínas. Isto é de particular interesse, onde os neurónios em muitas proteínas sinápticas são palmitoilada. Nós utilizamos um método simples bioquímica para detectar proteínas palmitoilados em neurónios em cultura, que podem ser adaptadas para vários tipos de células e tecidos.

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Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

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Abstract

Palmitoilação é uma modificação pós-traducional lipídica que envolve a ligação de um 16-carbono do ácido gordo saturado, o palmitato, para os resíduos de cisteína da proteína de substrato por meio de uma ligação tioéster lábil [revisto em 1]. Palmitoilação de uma proteína substrato aumenta a sua hidrofobicidade e, normalmente, facilita o seu tráfico para as membranas celulares. Estudos recentes têm mostrado palmitoilação para ser uma das modificações mais comuns de lípidos nos neurônios 1, 2, o que sugere que a rotação de palmitato é um importante mecanismo pelo qual as células regulam a segmentação e o tráfico de proteínas. A identificação e a detecção de substratos palmitoilados pode, por conseguinte, melhorar a nossa compreensão do tráfico de proteína em neurónios.

A detecção de proteína palmitoilação no passado tem sido tecnicamente dificultada devido à falta de uma sequência de consenso entre as proteínas de substrato, e a dependência de labeli metabólicang de palmitoil-proteínas com 3H-palmitato, um ensaio bioquímico demorado com baixa sensibilidade. Desenvolvimento da Acil-Biotina Troca ensaio (ABE), permite a detecção de sensibilidade mais rápido e elevado de proteínas palmitoilados 2-4, e é óptima para a medição do volume de negócios dinâmico de palmitato de proteínas neuronais. O ensaio de ABE é composta de três etapas bioquímicas (Figura 1): 1) bloqueio irreversível de grupos tiol não modificadas de cisteína utilizando N-ethylmaliemide (NEM), 2) a clivagem específica e desmascaramento do grupo tiol da cisteína palmitoilada do por hidroxilamina (HAM), e 3) marcação selectiva da cisteína palmitoilada usando um reagente de biotinilação reactivo tiol, biotina-BMCC. A purificação das proteínas tiol biotinilados, seguindo os passos de ABE diferiu, dependendo do objectivo global da experiência.

Aqui, nós descrevemos um método para purificar uma proteína de interesse em palmitoilada hippocamp primárioal neurónios por uma imunoprecipitação inicial (IP) a passo utilizando um anticorpo dirigido contra a proteína, seguido pelo ensaio de ABE e western blotting para medir directamente os níveis de palmitoilação de que a proteína, o que é denominado o ensaio de IP-ABE. Baixa densidade culturas de neurónios de hipocampo de rato embrionário têm sido amplamente utilizado para estudar a localização, a função, e o tráfico de proteínas neuronais, tornando-os idealmente adequados para o estudo de palmitoilação proteína neuronal utilizando o ensaio de IP-ABE. O ensaio de IP-ABE principalmente requer IP padrão e western blotting reagentes, e é apenas limitado pela disponibilidade de anticorpos contra o substrato alvo. Este ensaio pode ser facilmente adaptado para a purificação e detecção de proteínas palmitoilados transfectadas em cultura de células heterólogas, culturas neuronais primárias derivadas de vários tecidos de cérebro de rato e de ambos os ratos, e no tecido cerebral primário mesmo em si.

Protocol

1. Extracção de proteína alvo a partir de neurónios do hipocampo em cultura primária

  1. Antes da colheita de proteína endógena de células primárias de hipocampo, preparar um tampão de lise (LB; Tabela 1), com inibidores de protease. A 10 ml de tampão de lise, adicionar 0,1 ml de solução de fluoreto de fenilmetano (PMSF) para uma concentração final de 10 mM, e adicionar uma protease comprimido cocktail inibidor.
  2. Preparar N-etilmaleimida (NEM) solução (Tabela 1) a partir de pó liofilizado. Gentilmente dissolver em EtOH a 100% à temperatura ambiente (RT). Sempre preparar solução NEM fresco para o dia do experimento.
  3. Em seguida combinam o tampão de lise e NEM. Adicionar 0,5 ml de solução 2M de NEM para um tubo cónico de 50 ml. Adicionam-se 20 ml de LB mais alto, e rapidamente LB lugar + NEM (concentração final de 50 mM) numa plataforma de agitação a 4 ° C para misturar completamente durante 5 min. Sempre adicionar NEM / EtOH segunda primeira solução e LB, de modo a adequadamente misturar os dois.
  4. Remover neurônios cultivados de incubadora e coloque em * gelo. Remova cuidadosamente mídia celulares, e lavar cuidadosamente duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de frio (PBS) 1x. Adicionar 300 ml de LB + 50 mM NEM ao primeiro poço de neurónios do hipocampo, e células scrape usando um levantador de células descartáveis. Recolher o lisado celular, em seguida, descarregar o lisado para o poço seguinte desse grupo. Raspe as células dentro do segundo poço usando o levantador célula, recolher, e repita usando um terceiro poço, se necessário, para concentrar ainda mais o lisado.
  5. Recolher o lisado celular em um pré-arrefecida (em gelo), o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita o passo 1.4, utilizando 100 ul de LB + NEM 50mm a recolher qualquer lisado celular restante. Passe lisado celular total através de uma seringa de calibre 26 ½ 5-6 vezes para ajudar a lise mecânica, tomando cuidado para não estourar bolhas na solução. Pode-se, em vez sonicate por 15 segundos no gelo, se o equipamento está disponível. Nutar lisado celular durante ≥ 30 min a 4 ° C.
  6. Esclarecer a Lysa celularte por centrifugação a 16.000 xg / 30 min, de modo a pelota não-lisadas células e insolúvel em detergente materiais.
  7. Colete limpou lisado celular (sobrenadante) em um novo tubo de ml pré-arrefecido em gelo 1,5. Repita protocolo colheita para todos os grupos de células. Concentração medida de proteína em todas as amostras de lisado usando BCA ensaio, e normalizar o volume de todas as amostras de lisados ​​a partir de grupos de células a ter exactamente iguais de proteína total, com um mínimo recomendado de 500 ug. Complete todas as amostras com LB + NEM 50mm a 500 ul de volume total.
  8. Adicionar 1-5 ug de anticorpo primário dirigida contra a proteína alvo para cada amostra de lisado. Nutar as amostras de anticorpos com lisado-misturados durante a noite a 4 ° C.

* Neurónios primários do hipocampo do rato deverá ser cultivadas a uma densidade de cerca de 250.000 células / poço numa placa de 6 poços, em meio isento de soro, contendo um suplemento de B27 neuronal, como descrito anteriormente 5, e cultivadas durante a desejod período de tempo, tipicamente 14-16 dias in-vitro (DIV), para atingir a maturidade. Um mínimo de 500 ug de proteína total é recomendado para imunoprecipitar com sucesso e biotinylate uma proteína alvo neuronal, o que requer tipicamente 2-3 poços de uma placa de 6 poços.

2. Precipitação de anticorpo ligada Proteína Alvo

  1. Antes de precipitação e de imobilização de uma proteína-alvo, preparar uma suspensão de 50% de proteína A ou proteína G-esferas revestidas de sefarose. Especificamente, adiciona ≥ ul 60 de esferas de sefarose por amostra para tubos de 1,5 ml, assegurando que todas as amostras têm a mesma quantidade de grânulos. Esferas magnéticas são também adequados se o equipamento disponível.
  2. Adicionar um volume igual de suspensão de 50% para cada uma das amostras de anticorpo ligado, e para nutar ≥ 1 hora a 4 ° C.

3. Acil-Biotina Exchange: Hidroxilamina clivagem (HAM)

  1. Embora a execução da etapa 2.2, preparar uma série de tubos com tampão de lise (LB) de dipHs fferent. O pH é muito importante para estes passos e deve ser sempre ajustada usando um medidor de pH. Preparar 2 ml de LB pH 7,2 por amostra, e 0,5 ml de Tampão rigorosa por amostra (Tabela 1). Também preparar 0,5 ml LB + 10 mM NEM, por exemplo, tal como nos passos 1,1-1,3. Adicionar PMSF e comprimidos inibidores de protease para todas as soluções tampão de lise, tal como no passo 1.1.
    1. Hidroxilamina (HAM) é um potente agente redutor, cuja clivagem de palmitato de cisteínas é necessária para a biotinilação (Figura 1), e a omissão da clivagem HAM serve como um controlo negativo. Dividir cada amostra de grânulos em duas amostras, uma omitindo o passo de clivagem HAM (HAM-), e um que inclui o passo de HAM (+ HAM). Para normalizar para a degradação de proteínas provocada por tratamento HAM, deve-se dividir cada uma das amostras em terços, com 1/3 das pérolas utilizadas para o controlo da HAM-, e os restantes 2/3 utilizado para o tratamento de HAM +.
    2. Preparar um adicional.5 ml tubos em gelo, rotulados como a HAM-controlo para cada amostra. Seguindo a etapa 2.2, centrifugar suavemente grânulos todas amostras de 0,5 xg / 1 min a 4 ° C (centrifugadora a esta velocidade, duração e temperatura para todas as etapas restantes, a menos indicação em contrário), coloque os tubos em gelo, remover o sobrenadante, e re-suspender as pérolas em 600 ul de 10 mM de LB + NEM.
  2. Após re-suspensão das amostras pérolas em tampão de lise + NEM 10 mM, recolher imediatamente 200 pi de suspensão da amostra de lisado de-conta, e a descarga para que a amostra do tubo de HAM-se em gelo. Adicionar um adicional de 300 jil de LB + 10 mM de NEM a amostra a HAM-, e um adicional de 100 ul de amostra de HAM + para um total de 500 ul de cada amostra. Incubar os tubos durante 10 min em gelo.
  3. Re-suspender (lavar) o HAM-HAM e amostras + delicadamente com 0,5 ml de tampão rigorosos, por amostra. Executar este passo de forma rápida, como mais tempo de incubação de SDS irá resultar na remoção do anticorpo ligado a partir dagrânulos.
  4. Lavar cuidadosamente todas as amostras três vezes em 0,5 ml / amostra de pH 7,2 LB, e girar entre lavagens como em 3.2b passo.
  5. Embora a execução da etapa 3.5, preparar um tampão HAM (Tabela 1). Adicionar o volume apropriado de solução de hidroxilamina para um novo tubo, para atingir uma concentração final de 1 M em um volume de 0,5 ml de pH LB 7,2, por exemplo + HAM. Sempre preparar o tampão de HAM fresco para o dia do experimento. Adicionar 0,5 ml / amostra de pH 7,2 a todos os LB-HAM amostras, e 0,5 ml / amostra de tampão de HAM a todos os exemplos de HAM +.
  6. Nutar todas as amostras durante 1 h à temperatura ambiente (RT). Não exceder 1 hora.

4. Acil-Biotina Exchange: Biotina-BMCC Etiquetagem

  1. Embora a execução da etapa 3.6, preparar 2 ml de LB pH 6,2 por amostra (Tabela 1), como descrito no passo 3.1. Coloque a pH 6,2 LB em gelo até ser necessária. Também preparar uma solução stock de Biotina-BMCC (Tabela 1), imediatamente antes de usar. Pesar exacerbartly 2,1 mg de biotina-BMCC, recolhe em um tubo de 1,5 ml, e gentilmente dissolver em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO), colocando numa plataforma oscilante à temperatura ambiente, para atingir a concentração 8mM (não utilizar uma pipeta para dispersar o pó ).
  2. Uma vez passo 3.6 é completado, lavar cuidadosamente as pérolas uma vez em tampão de lise de pH 6,2, para remover o tampão residual HAM. Remover o sobrenadante e colocar as amostras em gelo.
  3. Biotina-BMCC é uma molécula de biotina maliemide conjugado que possui uma elevada afinidade para grupos tiol livres de cisteinas (Figura 1). Embora a execução da etapa 4.2, preparar 0,5 ml de biotina-BMCC Buffer (Quadro 1) por exemplo, a concentração de trabalho entre 0,5 pM a 5 pM. As concentrações superiores a 5 uM serão provavelmente saturar a proteína alvo 6, e normalmente não devem ser excedidos, no entanto esta pode variar, dependendo da proteína alvo desejado. Adicionar 0,5 ml de biotina-BMCC tampão para cada amostra, e para nutar exactamente 1 hora a 4 ° C. Não exceder 1 hora.

5. A eluição de biotina-conjugado proteína-alvo e SDS-PAGE

  1. Uma vez que passo 4.3 for concluída, lavar cuidadosamente todas as amostras de vez em pH 6,2 LB. Mantenha todas as amostras em gelo, entre lavagens. Remover 2x Tampão de amostra de SDS sem agentes redutores (tabela 1) de armazenamento de -20 ° C e, lentamente, descongelar em gelo.
  2. Lavar suavemente as amostras três vezes em LB pH 7,5 + PMSF / Inhibitors, e manter as amostras em gelo, entre lavagens.
  3. Remover o sobrenadante do terceira lavagem, deixando as pérolas peletizadas em uma pasta fluida com um tampão que permanece no fundo do tubo. Mergulhe uma pipeta com uma ponta de pequeno diâmetro (a ponta de carga gel ou ponta P2 pipeta são suficientes) para o fundo do tubo através da lama, e recolher rapidamente qualquer solução restante, com cuidado para não tomar quaisquer contas.
  4. Suplementar o Tampão de amostra de SDS 2x com DL-ditiotreitol (DTT) para atingir uma concentração final de 5 mM. Adicionar40-50 ul de tampão de amostra 2x + DTT 5 mM a cada amostra. Se necessário, os grânulos de vórtice para misturar completamente com o tampão de amostra e centrifugar imediatamente em alta velocidade para recolher todos os grânulos em um pellet, submerso, em tampão de amostra.
  5. Ferver as amostras durante 10 min a 75-80 ° C. Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente durante 10 min ≥ em cima da bancada, e centrifuga-se a 16.000 xg / 3 min para sedimentar as pérolas completamente.
  6. Adicionar o volume total de proteína eluída (sobrenadante) a partir de cada amostra para dentro de uma única pista de um gel de poliacrilamida adequado para transferência de western, utilizando SDS-PAGE 7. Organizar todas as amostras de modo a que a HAM-eluente e controlo eluente HAM + para uma única amostra são executados imediatamente adjacentes um ao outro durante a SDS-PAGE (Fig. 2). Na sequência de SDS-PAGE, transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF.

6. Western Blotting e Detecção de palmitoilação da Proteína Alvo

  1. Uma vez que 5,6 etapa é concluída, lava-se a membranaduas vezes em solução salina tamponada com Tris (TBS 1x) durante 10 min numa plataforma de agitação à temperatura ambiente.
  2. Preparar um tampão de bloqueio para bloquear o não-específica pela rotulagem pesando Albumina de Soro Bovino (BSA), para atingir o peso de 3% em volume de TBS 1x + Tween-20 a 0,05% (TBS-T), que é suficiente para submergir completamente a membrana . Para estreptavidina blotting, sempre bloquear com BSA e não leite em pó. Bloquear a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
  3. Prepara-se uma solução de anticorpo de TBS-T + BSA a 0,3%. Adicionar Estreptavidina-HRP anticorpo reconstituído em 1 mg / ml em água destilada, diluiu-se a 1:5,000-1:10,000. Uma vez passo 6.2 é completado, lava-se a membrana uma vez em TBS-T, durante 10 min, depois incubar a membrana em solução de estreptavidina anticorpo numa plataforma oscilante durante ou durante 1 hora à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C.
  4. Lava-se a membrana três vezes em TBS-T, durante 10 minutos numa plataforma oscilante. A fim de detectar o sinal de palmitoilação, expor a luminescência HRP utilizando um chemkit de substrato iluminescent.
  5. A fim de normalizar os níveis de palmitoilação para a quantidade de proteína de interesse que foi imunoprecipitado, descascar a membrana com tampão de transferência de Western de extracção durante 5-10 min numa plataforma de agitação à temperatura ambiente. Repita os passos 6,1-6,4 utilizando o anticorpo primário contra a proteína de interesse que foi originalmente usado para a imunoprecipi tacão.
  6. Palmitoilação de quantificar a proteína de interesse utilizando o software de análise de imagem, e normalizar os níveis de palmitoilação para a quantidade de proteína imunoprecipitada.

Representative Results

O ensaio de IP-ABE detecta especificamente palmitoilação tiol dos resíduos de cisteína ao longo do substrato de proteínas, e podem ser usados ​​para detectar a palmitoilação de imunoprecipitadas proteínas neuronais de uma maneira representada na Figura 1. Tratamento da proteína neuronal imunoprecipitado com HAM (Figura 1) cliva a ligação tioéster entre palmitato e um grupo tiol da cisteína, permitindo por incorporação específica de biotina-BMCC para o grupo tiol recentemente disponível, que pode ser subsequentemente detectados utilizando @ Western blotting @. A omissão de HAM clivagem (menos-HAM) impede a incorporação de biotina-BMCC, e funciona como um controlo negativo para a biotinilação específica palmitoil-da amostra plus-HAM, e devem, portanto, ser executado sempre adjacente à amostra plus-HAM para oeste blotting por SDS-PAGE (Figura 2).

Em uma experiência optimizado (Figura 2A), a palmitoilaçãosinal da proteína neuronal δ-catenina 2 pode ser prontamente detectada por blotting para biotina-BMCC, a uma concentração de 1 uM, utilizando estreptavidina conjugada com HRP, contra amostras paralelas minus-plus-e HAM. O sinal específico para palmitoilação δ-catenina aparece no seu tamanho previsto de 160kD, apenas na amostra de plus-HAM. A especificidade deste sinal foi confirmada por reprobing para δ-catenina com o anticorpo específico que foi inicialmente utilizado para imunoprecipitar lo, resultando num sinal em ambos os tratamentos HAM com o mesmo tamanho previsto. Optimização do ensaio IP-ABE (Figura 2A) irá resultar num perfil de western blotting de uma amostra minus-HAM que é facilmente distinguível da amostra plus-HAM, e exibe um mínimo ou nenhum sinal de palmitoilação.

A concentração de biotina-BMCC usado para rotular cisteínas palmitoilados requer optimização cuidada, e se uma concentração de saturação de super-biOtin-BMCC é usado durante as etapas da química ABE (Figura 2B), fundo excessivo e sinais não específicos serão visíveis. Uma curva de resposta linear para a biotinilação de uma proteína neuronal palmitoilada, a α7 receptor de acetilcolina nicotínico, utilizando biotina-BMCC tenha sido previamente determinado 6, e mostra próxima da saturação completa a uma concentração de 5-10 mM. Apesar da concentração ideal de biotina-BMCC irá desviar-se ligeiramente, dependendo da proteína alvo neuronal, o tratamento com biotina-BMCC, a uma concentração em excesso de 5 uM provavelmente super-saturar a proteína alvo, e resultam num perfil de Western blot com fundo visível e os sinais não específicos. Uma concentração de 0,5 uM para a biotina-BMCC foi anteriormente utilizada para detectar palmitoilação de outras proteínas neuronais incluindo SNAP-25, huntingtina, subunidades do receptor de AMPA e GluA1 GluA2 e paralemmin 8, e determinação da concentração óptima para um novoproteína alvo pode ser obtida por ensaio e erro de modo linear, com início no intervalo de 0,5-5 uM que descrevemos aqui. Os perfis resultantes estreptavidina western blot entre as amostras e minus-plus-HAM para δ-catenina palmitoilação parecem semelhantes quando tratados com 4 ^ M de biotina-BMCC (Figura 2B), com sinais de fundo adicionais em diferentes tamanhos, o que indica que a biotinilação inadequado ocorreu.

Hidroxilamina é um poderoso agente de redução que resulta na degradação limitada da proteína alvo para além da sua clivagem eficiente do tioéster de ligação. Por conseguinte, a optimização da ABE química exige uma para normalizar a quantidade de proteínas imunoprecipitadas utilizado para as amostras-minus e plus-HAM (passos 3,2-3,3). Normalização requer o uso de o dobro da quantidade de proteína alvo imobilizado na plus-minus versus a amostra-HAM, que se traduz em wester indistinguíveln blotting perfis para a proteína alvo, tal como mostrado por δ-catenina (Figura 2A, B). No entanto, se a quantidade de proteína alvo imobilizado não é normalizada entre amostras minus-plus-HAM e, o sinal resultante western blot para a proteína alvo na amostra plus-HAM podem ser perdidas, como mostrado por δ-catenina quando quantidades iguais de proteína foram utilizadas em ambos os tratamentos HAM (Figura 2C).

A especificidade da ABE química para rotular proteínas palmitoilados é muito sensível e requer otimização. As armadilhas comuns encontrados durante o ensaio IP-ABE incluem os resultados sub-óptimos mostradas nas Figuras 2B e 2C, e degradação da proteína alvo, independentemente do tratamento HAM, que são normalmente provocadas por reagentes e tampões mais velhos, e pH incorreto. De modo a evitar estas armadilhas e corrigir para a sub-óptima química ABE, a frescura e da concentração dos reagentes necessários para obuffers listados na Tabela 1 deve sempre ser examinada, e os ajustes de pH de todos os amortecedores devem sempre ser verificadas antes de executar o experimento.

Tampão A concentração de trabalho Comentários
Tampão de Lise (LB) Em H2O destilada: 1% IGEPAL CA-630 a 50 mM de Tris-HCl pH 7,5 150 mM de NaCl a 10% Glicerol N / A Prepare-se antes experimentar e armazenar a 4 ° C
Solução NEM Em EtOH a 100%: pó liofilizado NEM 2 M Preparar fresco, imediatamente antes da utilização.
Tampão rigorosas Em LB: 10 mM MEM SDS a 0,1% N / A Prepare imediatamente antes da utilização, manter em gelo.
LB pH 7,2 Em LB: ajustar o pH para 7,2 exatamente N / A Usar um medidor de pH para ajustar o pH imediatamente antes da utilização.
Tampão HAM Em pH 7,2 LB: Banco solução HAM 1 M (concentração final de HAM) Preparar imediatamente antes da utilização.
LB pH 6,2 Em LB: Ajuste pH exactamente 6,2 N / A O mesmo que para o pH 7,2 LB
Solução estoque Biotina-BMCC Em DMSO: 2,1 mg Biotina-BMCC solução 8 mM Preparar imediatamente antes da utilização.
Biotina-BMCC Tampão Em pH 6,2 LB: Adicionar Biotina-BMCC solução 1-5 uM (concentração de biotina-BMCC final) Preparar imediatamente antes da utilização.
2x tampão de amostra SDS, não redutores Em H2O destilada: 5% de SDS a 5% de glicerol 125 mM Tris-HCL pH 6,8 0,01% Azul de Bromofenol N / A Preparar antes da experiência, e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. Suplemento com DTT 5 mM antes da utilização.

Tabela 1. Os tampões e reagentes necessários para o teste IP-ABE. Muitos dos tampões de lise pode ser preparado antes de começar a experiência, no entanto o pH deve ser verificado e ajustado imediatamente antes da utilização com um medidor de pH, para garantir o sucesso da química ABE. A maioria das soluções de reserva deve ser preparada fresca para cada experiência, imediatamente antes da utilização. Muitos dos buffers requerem reagentes comuns para a maioria dos laboratórios equipados para a bioquímica, e reagentes de especialidade com informações de fornecedores são listados na tabela de reagentes e equipamento.


Figura 1. Esquemática da imunoprecipitação e Acil-Biotina Troca ensaio (IP-ABE) para purificar e detectar palmitoilação de proteínas neuronais. Neurónios do hipocampo em cultura são lisadas, (1) uma proteína-alvo é então purificada usando um anticorpo alvo específico, e imobilizada em Sepharose pérolas revestidas com proteína G ou A. A proteína alvo purificada é depois (2) tratada com N-ethylmaliemide (NEM) para se ligar irreversivelmente e bloquear tiol livres (-SH), ao longo de grupos de cisteínas não modificados (C). A proteína alvo é, em seguida, (3), submetido a tratamento com hidroxilamina (HAM), resultando numa clivagem específica de ligações tioéster em cisteínas e palmitoilados o desmascaramento de um grupo livre palmitoilada tiol (-SH). Em seguida, a proteína alvo é (4) treated com uma molécula de biotina-tiol reactivo, biotina-BMCC, resultando em biotinilação específica da cisteína palmitoilada. Finalmente, (5) a proteína alvo biotinilado é eluído e removido a partir do anticorpo e do grânulo. A proteína alvo com o seu palmitoilada cisteína (s) marcado com biotina é agora adequado para electroforese em gel de SDS-poli-acrilamida (SDS-PAGE) e transferência Western com estreptavidina para detectar palmitoilação da proteína purificada neuronal. para ver figura maior .

Figura 2
Figura 2. Detecção de palmitoilação da δ-catenina neuronal de proteína utilizando o ensaio de IP-ABE. Neurónios primários do hipocampo de rato foram cultivadas como previamenteriormente descritas 5, a uma densidade de 130 células / mm 2, até a maturidade em 14DIV, foram depois lisadas e sujeitas a ensaio de IP-ABE para detectar palmitoilação de um substrato recentemente identificado palmitoilada neuronal, δ-catenina 2. Purified imunoprecipitados (IP) de δ-catenina (proteína alvo) foram isolados utilizando 5 ug de anticorpo δ-catenina por amostra (BD Transduction Laboratories), e foram então sujeitas a SDS-PAGE, em paralelo e minus-plus-hidroxilamina (HAM) amostras. Palmitoilação foi detectada por transferência Western (WB) com estreptavidina-HRP (palmitoilação), e a membrana foi despida e submetido a um WB reprobe para δ-catenina. (A) Um representante resultado optimizado IP-ABE para palmitoilada δ-catenina (ponta de seta), tratadas com 1 uM de biotina-BMCC, ilustrando a especificidade da ABE química para a detecção de tiol-palmitoilados proteínas a partir de amostras de IP. (B) A repre sub-óptimaresultado IP-tante para ABE δ-catenina, em que um excesso de concentração de 4 uM de biotina-BMCC, que resultou em sinais não específicos e de fundo em ambas as amostras e minus-plus-HAM (setas). (C) Um outro representante sub-óptima IP-ABE WB para δ-catenina, em que uma concentração excessiva uM 4 de biotina-BMCC foi utilizado, e a quantidade de proteína utilizada para a amostra IP plus-HAM não foi normalizado para HAM mediada degradação de proteínas, resultando em uma perda de sinal na WB reprobe para δ-catenina. Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

O ensaio IP-ABE apresentado aqui é um método simples e altamente sensível para a detecção de proteínas em culturas primárias palmitoilados neurônios do hipocampo, utilizando principalmente técnicas bioquímicas padrão. Isso faz com que o ensaio facilmente adaptável para laboratórios já equipados com western blotting materiais. O ensaio de IP-ABE combina um protocolo de imunoprecipitação padrão para isolar e imobilizar a própria proteína alvo, seguindo-se a química descrita anteriormente ABE 2-4 para rapidamente detectar níveis de uma proteína de palmitato de substrato. A técnica ABE tem uma ampla gama de aplicações para a análise de proteínas palmitoilados em vários tecidos e linhas celulares, incluindo em grande escala de triagem palmitoil-proteomic de perfis palmitoilação globais, e a rápida detecção de níveis de palmitoilação de uma proteína alvo único.

Descrições anteriores de ABE química têm utilizado a lise das células e diferentes métodos de extracção com detergente prot neuronaleins 2, 9, tiol livre-bloqueamento 10, 11, biotinilação, e purificação da proteína alvo 4, dependendo da aplicação do experimento. A adição de palmitato de resultados neuronais proteínas no seu direccionamento para as membranas celulares, e a detecção da fracção palmitoilada de uma proteína alvo irá requerer a sua extracção a partir de tais membranas. Metodologias descritas anteriormente ABE têm utilizado uma variedade de 9 iónica e detergentes não iónicos 8 para extrair proteínas-alvo desejadas, bem como a utilização de um detergente em particular depende da proteína alvo e do seu transporte de membrana conhecida. Aqui, nós utilizamos o não desnaturante e detergente não iónico IGEPAL CA-630 para extrair proteínas palmitoilados, que temos validados para a extracção e detecção da proteína neuronal palmitoilada δ-catenina (Figura 2). A estrutura de IGEPAL CA-630 inclui um grupo de cabeça volumosos e rígidos não-polar que não fazperturbar a conformação da proteína nativa ou interacções, mas que permite a sua associação com as regiões hidrofóbicas de proteínas de membrana associadas ao, conferindo assim a miscibilidade com eles e que permite a sua extracção. Muitas proteínas neuronais localizadas na membrana sináptica ou pós-sináptica densidade de sinapses devem ser extraídos usando IGEPAL CA-630, no entanto, alguns podem não solubilizar completamente, e pode requerer o uso de um detergente não desnaturante diferente como Triton X-100, que possui sido previamente utilizado para a ABE química 2, 8.

Várias descrições de ABE química têm também utilizado um reagente de biotinilação diferente tiol-reactiva da molécula aqui descrita, chamado Biotina-HPDP (Thermo Scientific), que também necessita de um meio diferente de purificação de proteínas 4. Biotina-HPDP é outro tiol reactivo, a molécula de biotina-conjugado maliemide que contém uma ligação dissulfureto na estrutura adaptadora maliemide, estruturalmente differentiating lo de Biotina-BMCC, que não contém essa ligação dissulfureto. Seguindo tiol biotinilação de cisteína livre ou palmitoilada de uma proteína de Biotina-HPDP, a ligação dissulfureto resultante entre a proteína alvo e o grupo biotina pode ser clivado por redução de reagentes para libertar o grupo de biotina e regenerar a proteína na sua forma não modificada, tornando biotinilação por Biotina-HPDP transitória e reversível. Por conseguinte, a utilização deste reagente de biotinilação exige a purificação de uma proteína alvo por meio de reagentes de avidina imobilizada, tais como grânulos revestidas com estreptavidina. No entanto, a biotinilação-tiol de uma proteína-alvo, Biotina-BMCC, como descrito aqui, é estável e relativamente permanente, e requer a purificação da proteína alvo por um anticorpo dirigido contra o alvo, e imobilizada em esferas de sefarose. Ambas as técnicas de ABE foram anteriormente utilizados em grande escala telas, e detecção de palmitoilação de proteínas individuais 2, 8-10, 12, e oIP-ABE ensaio aqui descrita é ideal para a detecção rápida de palmitoilação de proteínas-alvo individuais neuronais.

A esmagadora maioria dos palmitoilação celular envolve a adição de palmitato reversível com o grupo tiol de cisteínas (denominado S-palmitoilação, que generaliza como 'palmitoilação' neste protocolo), no entanto, um grupo muito limitado de proteínas são submetidas a palmitoilação irreversível em glicina e os resíduos de cisteína através da formação de ligações amida estáveis, denominado N-palmitoilação 13. Uma limitação de ABE química é a sua incapacidade para detectar N-palmitoilação devido à estabilidade da ligação amida, e de modo de rastreio de uma proteína alvo para novos palmitoilação deve ser confirmado utilizando 3H-palmitato de marcação metabólica 1.

Como mencionado anteriormente, o ensaio IP-ABE pode ser facilmente adaptado para o exame palmitoilação em extractos de proteína a partir de várias fontes, incluindo a transfected linhas de células heterólogas, tecido primário, e culturas primárias neuronais a partir de múltiplas regiões cerebrais. O ensaio de IP-ABE tem sido utilizado para o exame de suficiência palmitoilação mutantes cisteína para serina-proteínas para identificar a localização de uma cisteína palmitoilada ao longo de uma proteína alvo 8, para análise de rotação palmitato dinâmico em proteínas sinápticas em neurónios cultivados sob condições basais 10, e alterações nos níveis de palmitoilação de proteínas neuronais após a indução da actividade neuronal 9. A sensibilidade e capacidade de adaptação do ensaio de IP-ABE o tornam ideal para a análise de perfis palmitoylation de proteínas neuronais, e ideal para a detecção de mudanças dinâmicas na palmitoylation.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações do Canadian Institutes of Health Research MOP-81158.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

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References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

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