Detektering av protein palmitoylering i odlade hippocampus neuroner genom immunprecipitation och Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Neuroscience
 

Summary

Den reversibla tillägg av palmitat till proteiner är en viktig reglerare av intracellulärt protein människohandel. Detta är av särskilt intresse i neuroner där många synaptiska proteiner palmitoylerad. Vi använder en enkel biokemisk metod för att detektera palmitoylerade proteiner i odlade neuroner, som kan anpassas för flera celltyper och vävnader.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Palmitoylering är en posttranslationell modifiering lipid inbegriper fastsättning av en mättad 16-kol fettsyra, palmitat, till cysteinrester av substratproteiner genom en labil tioesterbindning [granskas 1]. Palmitoylering av ett substrat protein ökar hydrofobicitet, och typiskt underlättar dess handel mot cellmembran. Nyligen genomförda studier har visat palmitoylering är en av de vanligaste lipid ändringar i nervceller 1, 2, vilket tyder på att palmitat omsättningen är en viktig mekanism genom vilken dessa celler reglerar inriktning och handel med proteiner. Identifieringen och detektion av palmitoylerade substrat kan därför bättre vår förståelse av protein handel med nervceller.

Detektion av protein palmitoylering tidigare har tekniskt hindrat på grund av avsaknaden av en konsensussekvens bland substratproteiner och beroendet av metabola labeling av palmitoyl-proteiner med 3 H-palmitat, en tidskrävande biokemisk analys med låg känslighet. Utveckling av acyl-Biotin Exchange (ABE) analys möjliggör snabbare och hög känslighet detektering av palmitoylerade proteiner 2-4, och är optimalt för att mäta dynamiska omsättning palmitat på neuronala proteiner. ABE-analysen består av tre biokemiska steg (Figur 1): 1) irreversibel blockad av omodifierade grupper cysteintiolgrupper med N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifika klyvningen och avslöjande av palmitoylerad cystein är tiolgrupp av hydroxylamin (HAM), och 3) selektiv märkning av palmitoylerad cystein med en tiol-reaktiv biotinyleringsreagens, biotin-BMCC. Rening av tiol-biotinylerade proteiner efter de ABE steg har varit olika, beroende på det övergripande målet för försöket.

Här beskriver vi en metod för att rena en palmitoylerad protein av intresse i primär hippocampal neuroner från en initial immunoutfällning (IP) steg med användning av en antikropp riktad mot proteinet, följt av ABE analysen och western blotting för att direkt mäta palmitoylering nivåer av detta protein, som kallas IP-ABE analys. Low-density kulturer av embryonala råtta hippocampus nervceller har i stor utsträckning använts för att studera lokalisering, funktion och smuggling av neuronala proteiner, vilket gör dem idealiska för att studera neuronal protein palmitoylering med IP-ABE analys. IP-ABE analys kräver huvudsakligen vanlig IP och Western Blotting reagens, och begränsas endast av tillgängligheten av antikroppar mot målsubstratet. Denna analys kan enkelt anpassas för rening och detektion av transfekterade palmitoylerade proteiner i heterologa cellkulturer, primära neuronala kulturer härledda från olika hjärnvävnader av både mus och råtta, och även primär hjärnvävnad själv.

Protocol

1. Utvinning av målprotein från odlade primära hippocampusneuroner

  1. Före skörd endogent protein från primära hippocampus celler, förbereda en lyseringsbuffert (LB, tabell 1) med proteashämmare. Till 10 ml lysbuffert, tillsätt 0,1 ml fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) till en slutlig koncentration av 10 mM, och tillsätt 1 proteas tablett-inhibitor cocktail.
  2. Framställning av N-etylmaleimid (NEM)-lösning (Tabell 1) från lyofiliserat pulver. Försiktigt upplöses i 100% EtOH vid rumstemperatur (RT). Alltid förbereda NEM lösning färskt för dagen för experimentet.
  3. Nästa kombinera lysbuffert och NEM. Tillsätt 0,5 ml av 2M lösning NEM till en färsk 50 ml koniskt rör. Tillsätt 20 ml LB över toppen, och snabbt plats LB + NEM (slutlig koncentration av 50 mM) på en gungande plattform vid 4 ° C för att helt blanda i 5 minuter. Tillsätt alltid NEM / EtOH lösningen först och LB andra så väl att blanda de två.
  4. Ta odlade nervceller från inkubatorn och placera på is *. Ta försiktigt bort cellulära media och försiktigt tvätta två gånger med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 1x. Lägg 300 ml LB + 50 mM NEM till den första brunnen i hippocampus neuroner och celler skrapa med en disponibel cell lyftare. Samla cellysatet, sedan laddas lysatet till nästa brunn i denna grupp. Skrapa celler i den andra brunnen med hjälp av cellens lyften, samla och upprepa med en tredje brunn, om det behövs för att ytterligare koncentrera lysatet.
  5. Samla cellysat till en förkyld (på is), 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa steg 1,4 med 100 pl LB + 50 mM NEM att samla in återstående cellysat. Pass totalt cellysat genom en 26 ½ gauge spruta 5-6 gånger för att underlätta mekanisk lys, var noga med att inte blåsa bubblor i lösningen. Man kan istället sonikera under 15 sekunder på is, om utrustning finns tillgänglig. Vicka cellysatet för ≥ 30 min vid 4 ° C.
  6. Klargöra cellen Lysate genom centrifugering vid 16.000 x g / 30 min, för att pelletera un-lyserade celler och detergent-olösligt material.
  7. Samla rensas cellysat (supematant) i ett nytt förkyld 1,5 ml rör på is. Upprepa skörd protokoll för alla grupper av celler. Mät proteinkoncentrationen i alla lysat prover med BCA-analys, och normalisera volymen för alla lysat prover från grupper av celler att ha exakt lika totalt protein, med en rekommenderad minst 500 pg. Fyll upp alla prover med LB + 50 mM NEM till 500 ul total volym.
  8. Lägg 1-5 ig primär antikropp riktad mot målproteinet till varje lysat prov. Vicka antikropp-lysat blandade prover natten vid 4 ° C.

* Primära råtta hippocampusneuroner bör odlas vid en densitet av ungefär 250.000 celler / brunn i en 6-brunnars skål, i ett serumfritt medium innehållande en B27-neuronal komplement, såsom tidigare beskrivits 5, och odlades under en önskand tid, vanligtvis 14-16 dagar, in vitro (DIV) för att uppnå mognad. Ett minimum av 500 pg av totalt protein rekommenderas att framgångsrikt immunfälla och biotinylera ett mål neuronal protein, vilket typiskt kräver 2-3 brunnar i en 6-brunnars skål.

2. Utfällning av antikropp-bundet målprotein

  1. Innan utfällning och immobilisering ett målprotein, framställa en 50% uppslamning av protein A, eller protein G-belagda Sepharose-pärlor. Specifikt, lägg ≥ 60 il Sepharose-pärlor per prov till 1,5 ml rör, se till att alla prover har lika mycket pärlor. Magnetiska pärlor är också lämpliga om utrustningen är tillgänglig.
  2. Tillsätt en motsvarande volym av 50% uppslamning till varje antikropp-lysat provet och vicka i ≥ 1 timme vid 4 ° C.

3. Acyl-Biotin Exchange: Hydroxylamin (HAM) Klyvning

  1. När de utför steg 2,2, förbereda ett antal rör med lyseringsbuffert (LB) different pH. PH-värdet är mycket viktigt för dessa steg och ska alltid justeras med hjälp av en pH-mätare. Bered 2 ml LB pH 7,2 per prov, och 0,5 ml av stringent buffert per prov (tabell 1). Också förbereda 0,5 ml LB + 10 mM NEM per prov, som i steg 1,1-1,3. Lägg PMSF och proteashämmare tabletter inhibitor till alla lys buffertar, såsom i steg 1,1.
    1. Hydroxylamin (HAM) är ett kraftfullt reduktionsmedel, vars klyvning av palmitat från cysteiner krävs för biotinylering (figur 1), och utelämnandet av HAM klyvning tjänar som en negativ kontroll. Split varje prov av pärlor i två prover, ett utelämnande HAM klyvningssteget (-HAM), och en innefattande HAM steget (+ HAM). Att normalisera för proteinnedbrytning orsakad av HAM behandling, bör man dela varje prov i tredjedelar, med 1/3 av pärlorna används för-HAM kontrollen, och de återstående 2/3 som används för + HAM behandlingen.
    2. Bered ytterligare 1.5 ml rör på is, märkta som-HAM kontroll för varje prov. Efter steg 2,2 försiktigt centrifugera alla prover "pärlor på 0,5 xg / 1 min vid 4 ° C (centrifugera vid denna hastighet, varaktighet och temperatur för alla kvarvarande steg om inte annat anges), placera rören på is, avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 600 ul LB + 10 mM NEM.
  2. Efter åter upphävande av prover "pärlorna i lyseringsbuffert + NEM 10 mM, omedelbart samla 200 ul av provets lysatet-pärla slam och utsläpp i den provs-HAM rör på is. Tillsätt ytterligare 300 pl LB + 10 mM NEM till-HAM provet, och ytterligare 100 ^ till + HAM provet för totalt 500 pl i varje prov. Inkubera rören i 10 min på is.
  3. Återsuspendera (tvätta) the HAM och + prover HAM försiktigt med 0,5 ml stränga buffert, per prov. Utför detta steg snabbt, eftersom en längre inkubation SDS kommer att resultera i avlägsnandet av bunden antikropp frånpärlor.
  4. Försiktigt tvätta alla prover tre gånger i 0,5 ml / prov LB pH 7,2, och centrifugera ner mellan tvättningarna som i steg 3.2b.
  5. När de utför steg 3,5, förbereda en HAM buffert (tabell 1). Lägg lämplig volym av hydroxylamin-lösning till ett nytt rör, för att uppnå en slutlig koncentration av 1 M i en volym av 0,5 ml LB-pH 7,2, per + HAM prov. Alltid förbereda HAM bufferten färskt för dagen för experimentet. Tillsätt 0,5 ml / prov LB pH 7,2 till helt HAM prover, och 0,5 ml / prov av HAM buffert till alla prover + HAM.
  6. Vicka alla prover under 1 timme vid rumstemperatur (RT). Inte överstiger 1 timme.

4. Acyl-Biotin Exchange: Biotin-BMCC märkning

  1. När de utför steg 3,6, förbereda 2 ml LB pH 6,2 per prov (Tabell 1), som i steg 3,1. Placera LB pH 6,2 på is tills de behövdes. Också utarbeta en stamlösning av biotin-BMCC (tabell 1) omedelbart före användning. Väg ut exactly 2,1 mg biotin-BMCC, samlas i en 1,5 ml tub, och försiktigt lös i 0,5 ml Dimetylsulfoxid (DMSO) genom att på en gungande plattform vid RT, för att uppnå 8 mM koncentration (använd inte en pipett för att bryta upp pulvret ).
  2. När steg 3,6 är klar, försiktigt tvätta pärlorna en gång i pH 6,2 lyseringsbuffert, för att avlägsna återstående HAM buffert. Avlägsna supernatanten och placera proven på is.
  3. Biotin-BMCC är en maliemide konjugerad biotinmolekyl som har en hög affinitet för fria tiolgrupper av cysteiner (figur 1). När de utför steg 4,2, förbereda 0,5 ml biotin-BMCC buffert (tabell 1) per prov, vid arbete koncentration mellan 0,5 M till 5 pm. Koncentrationer överstigande 5 pM sannolikt kommer att mätta målproteinet 6, och typiskt inte bör överskridas, men detta kan variera beroende på den önskade målproteinet. Tillsätt 0,5 ml av biotin-BMCC buffert till varje prov, och vicka under exakt 1 h vid 4 &grader, C. Inte överstiger 1 timme.

5. Eluering av biotin-konjugerad målprotein och SDS-PAGE

  1. När steg 4,3 är klar, försiktigt tvätta alla prover en gång i LB pH 6,2. Håll alla prover på is mellan tvättar. Avlägsna 2x SDS-provbuffert utan reduktionsmedel (Tabell 1) från -20 ° C lagring och långsamt tina på is.
  2. Tvätta försiktigt prover tre gånger i LB pH 7,5 + PMSF / Inhibitorer och hålla prover på is mellan tvättar.
  3. Avlägsna supernatanten från den tredje tvättningen, lämnar de pelleterade pärlorna i en uppslamning med kvarvarande buffert i botten av röret. Doppa en pipett med en liten diameter tips (en gel lastning spets eller P2 pipettspets räcker) i botten av röret genom slammet, och snabbt samla in all kvarvarande buffert, försiktigt så att inte ta upp några pärlor.
  4. Komplettera 2x SDS-provbuffert med DL-ditiotreitol (DTT) för att uppnå en slutlig koncentration av 5 mM. Lägg40-50 pl 2x provbuffert + 5 mM DTT till varje prov. Vid behov, vortexa pärlorna att fullständigt blanda med provbuffert, och omedelbart centrifugera vid hög hastighet för att samla alla pärlor i en pellet, nedsänkta i provbuffert.
  5. Koka alla prover under 10 min vid 75-80 ° C. Låt prover kyl till rumstemperatur under ≥ 10 min på bänk, och centrifugera vid 16.000 xg / 3 min till helt pellets pärlorna.
  6. Lägg hela volymen av eluerat protein (supernatant) från varje prov till en enda bana i en polyakrylamidgel lämplig för western blotting, med användning av SDS-PAGE 7. Organisera alla prover så att den-HAM kontroll elueringsmedel och + HAM elueringsmedel för ett enda prov körs omedelbart intill varandra under SDS-PAGE (figur 2). Efter SDS-PAGE, överföring till ett PVDF eller nitrocellulosamembran.

6. Western blotting och detektering av palmitoylering av målprotein

  1. När steg 5,6 är klar, tvätta membranettvå gånger i Tris-buffrad saltlösning (TBS 1x) under 10 minuter på en gungande plattform vid RT.
  2. Bered en blockeringsbuffert att blockera icke-specifik märkning genom att väga upp bovint serumalbumin (BSA), för att uppnå 3% vikt i en volym av TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) som är tillräcklig för att helt dränka membranet . För streptavidin blotting, alltid blockera med BSA och inte mjölkpulver. Blockera membranet under 1 h vid RT på en gungande plattform.
  3. Bered en antikropp lösning av TBS-T + 0,3% BSA. Lägg Streptavidin-HRP-antikropp rekonstituerades vid 1 mg / ml i destillerat vatten, utspätt till 1:5,000-1:10,000. När steg 6,2 avslutats, tvätta membranet en gång i TBS-T under 10 minuter, sedan inkubera membranet i Streptavidin antikroppslösning på en gungande plattform för antingen under 1 h vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 ° C.
  4. Tvätta membranet tre gånger i TBS-T under 10 minuter på en gungande plattform. För att upptäcka palmitoylering signalen exponera HRP luminiscens med en chemiluminescent substrat-kit.
  5. För att normalisera palmitoylering nivåer till mängden av proteinet av intresse som immunutfälldes, skala av membranet med western blöt strippning buffert under 5-10 min på en gungande plattform vid RT. Upprepa steg från 6,1 till 6,4 med användning av primär antikropp mot proteinet av intresse som ursprungligen användes för immunoutfällning.
  6. Kvantifiera palmitoylering av proteinet av intresse med hjälp av programvara bildanalys, och normalisera palmitoylering nivåer mängden immunutfällda proteinet.

Representative Results

IP-ABE analysen detekterar specifikt tiol-palmitoylering av cysteinrester längs substratproteiner, och kan användas för att detektera palmitoylering av immunoutfällda neuronala proteiner på ett sätt som visas i figur 1. Behandling av det immunfällda neuronala proteinet med HAM (figur 1) klyver tioester kopplingen mellan palmitat och en cystein är tiolgrupp, vilket möjliggör specifik inkorporering av biotin-BMCC på den nyligen tillgängliga tiolgrupp, som därefter kan detekteras med användning av western blotting. Utelämnandet av HAM (minus-HAM) klyvning förhindrar inkorporeringen av biotin-BMCC och fungerar som en negativ kontroll för specifik palmitoyl-biotinylering av plus-HAM prov och bör därför alltid köras i anslutning till plus-HAM prov för västra blotting av SDS-PAGE (figur 2).

I en optimerad experiment (figur 2A), den palmitoyleringsignal i den neuronala protein-δ-katenin 2 kan lätt detekteras genom blotting för biotin-BMCC vid en koncentration av 1 | iM, med användning av streptavidin konjugerad med HRP, mot parallella minus-och plus-HAM prover. Den specifika palmitoylering signalen för δ-katenin visas vid den beräknade storlek på 160kD, endast i plus-HAM prov. Specificiteten av denna signal bekräftades genom reprobing för δ-katenin med den specifika antikroppen som ursprungligen användes för att immunoprecipitera det, vilket resulterar i en signal i båda HAM behandlingar på förutsagda samma storlek. Optimering av IP-ABE analys (Figur 2A) kommer att resultera i en western blotting profil av en minus-HAM prov som är lätt att skilja från den plus-HAM prov och uppvisar minimal eller ingen palmitoylering signal.

Koncentrationen av biotin-BMCC används för att märka palmitoylerade cysteiner kräver noggrann optimering, och om en super-mättande koncentration av biotin-BMCC används under ABE kemi steg (Figur 2B), överdriven bakgrund och icke-specifika signaler syns. En linjär svarskurvan för biotinylering av en palmitoylerad neuronal protein, α7 nikotinacetylkolinreceptorn, med användning av biotin-BMCC har tidigare bestämts 6, och visar nära fullständig mättnad vid en koncentration av 5-10 pM. Även den optimala koncentrationen av biotin-BMCC kommer att avvika något beroende på neuronala målproteinet, kommer behandling med biotin-BMCC vid en koncentration överstigande 5 pM sannolikt super-mätta målproteinet, och resultera i en western blot-profil med synlig bakgrund och icke-specifika signaler. En koncentration av 0,5 M för biotin-BMCC har tidigare använts för att upptäcka palmitoylering av andra neuronala proteiner, inklusive SNAP-25, huntingtin, AMPA subenheter receptor GluA1 och GluA2 och paralemmin 8, och bestämning av den optimala koncentrationen för en nymålprotein kan åstadkommas genom trial-and-error i linjärt, med början inom intervallet 0,5-5 fiM som vi beskriver här. De resulterande streptavidin Western Blot-profiler bland minus-och plus-HAM prover för δ-katenin palmitoylering likna vid behandling med 4 M biotin-BMCC (Figur 2B), med ytterligare bakgrund signaler vid olika storlekar, vilket tyder på att olämpligt biotinylering inträffade.

Hydroxylamin är ett kraftfullt reduktionsmedel som resulterar i begränsad nedbrytning av målproteinet utöver sin effektiv klyvning av tioester bindning. Därför kräver optimering av ABE kemi en att normalisera mängden immunutfällda protein som används för minus-och plus-HAM prover (steg från 3,2 till 3,3). Normalisering kräver användning av dubbla mängden immobiliserat målprotein i plus-vs minus HAM prov, som faktiskt leder skilja Western blotting profiler för målproteinet, såsom visas för δ-catenin (figur 2A, B). Men, om mängden immobiliserat målprotein inte normaliseras mellan minus-och plus-HAM prover, kan den resulterande western blöt signal för målproteinet i plus-HAM prov förlorad, såsom visas för δ-katenin när lika stora mängder protein användes i båda HAM behandlingar (Figur 2C).

Specificiteten för ABE kemi för märkning palmitoylerade proteiner är mycket känslig och kräver optimering. De vanliga fallgropar som uppstår under undersökningsperioden-ABE analysen inkluderar de suboptimala resultat som visas i figurerna 2B och 2C, och nedbrytning av målproteinet, oberoende av HAM behandling, som typiskt orsakas av äldre reagens och buffertar, samt pH-värde felaktig. För att undvika dessa fallgropar och korrigera för suboptimal ABE kemi, färskhet och koncentration av reagens som krävs förbuffertar som anges i tabell 1 bör alltid undersökas och pH-justeringar av alla buffertar bör alltid kontrolleras innan du kör experimentet.

Buffert Working Koncentration Kommentarer
Lyseringsbuffert (LB) I destillerat H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% glycerol N / A Förbered före experimentet och förvara vid 4 ° C
NEM lösning I 100% EtOH: NEM lyofiliserat pulver 2 M Bered färsk, omedelbart före användning.
Stringent buffert I LB: 10 mM MEM 0,1% SDS N / A Förbered strax före användning, hålla på is.
LB pH 7,2 I LB: Justera pH till exakt 7,2 N / A Använd en pH-mätare för att justera pH-värdet omedelbart före användning.
HAM buffert I LB pH 7,2: Stock HAM-lösning 1 M (slutlig HAM koncentration) Bered omedelbart före användning.
LB pH 6,2 I LB: Justera pH till exakt 6,2 N / A Samma som för LB pH 7,2
Stock Biotin-BMCC lösning I DMSO: 2,1 mg Biotin-BMCC lösning 8 mM Bered omedelbart före användning.
Biotin-BMCC buffert I LB pH 6,2: Lägg Biotin-BMCC lösning 1 till 5 M (slutlig biotin-BMCC koncentration) Bered omedelbart före användning.
2x SDS-provbuffert, inga reduktionsmedel I destillerat H 2 O: 5% SDS 5% glycerol 125 mM Tris-HCl pH 6,8 0,01% bromfenolblått N / A Förbered före experimentet, och förvara vid -20 ° C fram till användning. Komplettera med 5 mM DTT före användning.

Tabell 1. Buffertar och reagens som krävs för IP-ABE analys. Många av lys buffertar kan beredas innan experimentet, men pH-värdet bör kontrolleras och justeras omedelbart före användning med en pH-mätare, för att säkerställa framgång för ABE kemi. Majoriteten av stamlösningar bör beredas på nytt för varje experiment omedelbart före användning. Många av de buffertar kräver reagens som är gemensamma för de flesta laboratorier utrustade för biokemi och specialitet reagenser med leverantören informationen i tabellen av reagens och utrustning.


Figur 1. Schematisk av Immunoutfällning och acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) analys för att rena och detektera palmitoylering av neuronala proteiner. Odlade hippocampusneuroner lyseras, (1) är ett målprotein sedan renas med användning av en mål-specifik antikropp, och immobiliseras på Sepharose pärlor belagda med protein G eller A. renade målproteinet är då (2) behandlades med N-ethylmaliemide (NEM) för att irreversibelt binda och blockera fria tiol (-SH)-grupper längs omodifierade cysteiner (C). Målproteinet sedan (3) utsätts för behandling med hydroxylamin (HAM), vilket resulterar i specifik klyvning av tioester obligationer på palmitoylerade cysteiner och avslöjande av en fri palmitoylerad tiolgrupp (-SH). Därefter är målproteinet (4) treated med en tiol-reaktiv biotinmolekyl, biotin-BMCC, resulterar i specifik biotinylering av palmitoylerad cystein. Slutligen, (5) den biotinylerade målproteinet elueras och avlägsnas från antikroppen och vulsten. Målproteinet med dess palmitoylerad cystein (er) märkta med biotin är nu lämplig för SDS poly-akrylamid-gelelektrofores (SDS-PAGE), och western blotting med streptavidin för att detektera för palmitoylering av det renade neuronala proteinet. Klicka här för att visa större siffra .

Figur 2
Figur 2. Detektering av palmitoylering av neuronala proteiner δ-katenin med IP-ABE analys. Var Primära råtta hippocampus neuroner odlas som pregare beskrivits 5, vid en densitet av 130 celler / mm 2 till förfall vid 14DIV, lyserades sedan, och utsattes för den IP-ABE analys för att detektera palmitoylering av en palmitoylerad nyligen identifierats neuronala substrat, δ-katenin 2. Renat immunoprecipitat (IP) av δ-katenin (målprotein) isolerades med användning av 5 pg av δ-katenin antikropp per prov (BD Transduction Laboratories), och utsattes sedan för SDS-PAGE i parallell minus-och plus-hydroxylamin (HAM) prover. Palmitoylering detekterades genom western blotting (WB) med streptavidin-HRP (palmitoylering), och membranet avdrevs och underkastades en reprobe WB för δ-catenin. (A) En optimerad representativ IP-ABE resultat palmitoylerad δ-catenin (pilspets) behandlades med 1 pM biotin-BMCC, illustrerar specificiteten för ABE kemi för detektering tiol-palmitoylerade proteiner från IP prover. (B) En suboptimal reprerepresentant IP-ABE resultat för δ-katenin, där ett överskott koncentration av 4 M biotin-BMCC användes, vilket resulterade i icke-specifika signaler och bakgrund i både minus-och plus-HAM prover (pilar). (C) En annan suboptimal representativ IP-ABE WB för δ-katenin, där en alltför 4 iM koncentration av biotin-BMCC användes, och mängden av protein som används för plus-HAM IP prov inte normaliserades för HAM-medierad proteinnedbrytning, vilket resulterar i en förlorad signal i reprobe WB för δ-katenin. Klicka här för att se större bild .

Discussion

IP-ABE analys presenteras här är en enkel och mycket känslig metod för detektering palmitoylerade proteiner i odlade primära hippocampala neuroner, med mestadels biokemiska standardtekniker. Detta gör analysen lätt kan anpassas för laboratorier som redan är utrustade med Western Blotting material. IP-ABE analys kombinerar en vanlig immunoutfällning protokoll för att isolera och immobilisera sin målprotein, följt av tidigare beskrivna ABE kemi 2-4 för att snabbt upptäcka halter av palmitat på ett substrat protein. ABE tekniken har ett brett användningsområde för att pröva palmitoylerade proteiner i olika vävnader och cellinjer, inklusive storskalig palmitoyl-proteomic screening av globala palmitoylering profiler, och snabb detektion av palmitoylering nivåer av ett enda målprotein.

Tidigare beskrivningar av ABE kemi har använt olika metoder för cell-lys och rengöringsmedel utvinning av neuronal proteins 2, 9, fri tiol-blockad 10, 11, biotinylering, och rening av målproteinet 4, beroende på tillämpningen av experimentet. Tillsatsen av palmitat till neuronala proteiner resulterar i deras inriktning mot cellmembran, och detektion av palmitoylerad fraktionen av ett målprotein kommer att kräva dess extraktion från dessa membran. Tidigare beskrivna ABE metoder har utnyttjat en mängd av jonisk 9 och icke-joniska detergenter 8 för att extrahera önskade målproteiner, och användningen av en särskild tvättmedel beror på målproteinet och dess kända membran handel. Här, använder vi den icke-denaturerande och icke-jonisk detergent IGEPAL CA-630 för att extrahera palmitoylerade proteiner som vi har validerats för utvinning och detektering av palmitoylerad neuronala proteinet δ-catenin (figur 2). Strukturen för IGEPAL CA-630 innefattar en skrymmande och styvt, icke-polära huvudgruppen som intestöra nativt protein konformation eller interaktioner, men som gör att dess samband med de hydrofoba regioner membran-associerade proteiner, varigenom ger blandbarhet till dem och tillåter deras utvinning. Många neuronala proteiner lokaliserade till synaptiska membranet eller postsynaptisk densitet av synapser bör extraheras med IGEPAL CA-630, men vissa kan inte fullständigt solubilisera, och kan kräva användning av en annan icke-denaturerande detergenten som Triton X-100, som har tidigare utnyttjats för ABE kemi 2, 8.

Flera beskrivningar av ABE kemi har också utnyttjat en annan tiolreaktiv biotinyleringsreagens från molekylen vi beskriver här kallas Biotin-HPDP (Thermo Scientific), vilket också kräver en annorlunda sätt av proteinrening 4. Biotin-HPDP är en annan tiol-reaktiva, maliemide-konjugerad biotinmolekyl som innehåller en disulfidbindning i den maliemide kopplingsarmen, strukturellt differentiating det från biotin-BMCC, som inte innehåller denna disulfidbindning. Efter tiol-biotinylering av ett protein fria eller palmitoylerad cystein genom biotin-HPDP, kan den resulterande disulfidbindningen mellan målproteinet och biotingruppen klyvas genom reducerande reagens för att frigöra biotingruppen och regenerera proteinet i sin omodifierade form, vilket gör biotinylering av Biotin-HPDP övergående och reversibla. Därför, användning av denna biotinyleringsreagens kräver rening av ett målprotein genom immobiliserat avidin reagens, såsom streptavidinbelagda kulor. Emellertid, tiol-biotinylering av ett målprotein genom biotin-BMCC, eftersom vi beskriver här, är stabil och relativt permanent och kräver rening av målproteinet med en antikropp riktad mot målet, och immobiliseras på Sepharose-pärlor. Båda ABE tekniker har tidigare utnyttjats för storskaliga skärmar och detektering av palmitoylering av enstaka proteiner 2, 8-10, 12, ochIP-ABE analys beskriver vi här är optimal för snabb detektion av palmitoylering av enskilda neuronala målproteiner.

En överväldigande majoritet av cellulär palmitoylering innebär reversibla tillsättning av palmitat till tiolgruppen i cysteiner (benämnd S-palmitoylering, som vi generalisera som "palmitoylering" i detta protokoll), är dock en mycket begränsad grupp av proteiner utsätts för irreversibel palmitoylering på glycin och cysteinrester genom bildningen av stabila amidbindningar, benämnd N-palmitoylering 13. En begränsning för ABE kemi är dess oförmåga att detektera N-palmitoylering grund av stabiliteten av amidbindningen, och så screening av ett nytt målprotein för palmitoylering ska bekräftas med 3H-palmitat metabolisk märkning 1.

Som tidigare nämnts kan IP-ABE analys enkelt anpassas för att undersöka palmitoylering i proteinextrakt från flera källor, inklusive transfected heterologa cellinjer, primära vävnad och primära neuronala kulturer från flera områden i hjärnan. IP-ABE analys har använts för att undersöka palmitoylering tillräckliga muterade cystein-till-serin proteiner för att identifiera platsen för en palmitoylerad cystein längs ett målprotein 8, för att pröva dynamisk palmitat omsättning på synaptiska proteiner i odlade nervceller i basala förhållanden 10, och förändringar i palmitoylering nivåer av neuronala proteiner efter induktion av nervaktivitet 9. Känsligheten och anpassningsförmåga IP-ABE analys gör den idealisk för att undersöka palmitoylering profiler neuronala proteiner och optimala för att upptäcka dynamiska förändringar i palmitoylering.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats med bidrag från kanadensiska Institutes of Health Research MOP-81.158.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics