Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Neuroscience
 

Summary

Die reversible Zugabe von Palmitat an Proteine ​​ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Protein-Trafficking. Dies ist von besonderem Interesse, wo viele Neuronen synaptische Proteine ​​palmitoyliert. Wir nutzen einen einfachen biochemischen Verfahren zur palmitoylierten Proteinen in kultivierten Neuronen, die für mehrere Zelltypen und Gewebe angepasst werden kann zu detektieren.

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Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

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Abstract

Palmitoylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die Lipid die Befestigung einer 16-Kohlenstoff-gesättigten Fettsäure, Palmitat, um Cysteinreste des Substrats durch eine labile Proteine ​​Thioesterbindung [Übersicht in 1]. Palmitoylierung von einem Substrat-Protein erhöht die Hydrophobie, und in der Regel erleichtert die Bekämpfung Richtung Zellmembranen. Neuere Studien haben gezeigt, Palmitoylierung einem der häufigste Lipidmodifikationen in Neuronen 1, 2 sein, was nahe legt, dass Palmitat Umsatz ist ein wichtiger Mechanismus, durch den diese Zellen regulieren die Targeting und Trafficking von Proteinen. Die Identifizierung und Erkennung von palmitoylierten Substrate können und daher besser unser Verständnis von Protein-Trafficking in Neuronen.

Detektion von Protein Palmitoylierung in der Vergangenheit wurde technisch aufgrund des Fehlens einer Konsensussequenz unter Substratproteine ​​behindert, und die Abhängigkeit von metabolischen labeling von Palmitoyl-Proteine ​​mit 3 H-Palmitat, ein zeitaufwändiger biochemischen Assay mit niedriger Empfindlichkeit. Entwicklung des Acyl-Biotin Exchange (ABE) Assay ermöglicht schnelleren und hohe Empfindlichkeit Nachweis von Proteinen palmitoylierten 2-4 und ist optimal zur Messung des dynamischen Umsatz von Palmitat auf neuronalen Proteinen. Die ABE Assay wird von drei biochemischen Schritten (Figur 1) umfasst: 1) irreversiblen Blockade von unmodifizierten Cystein-Thiolgruppen unter Verwendung von N-ethylmaliemide (NEM), 2) spezifische Spaltung und Demaskierung der palmitoylierten Cystein die Thiolgruppe von Hydroxylamin (HAM) und 3) selektive Markierung des palmitoylierten Cystein mit einem Thiol-reaktiven Biotinylierungsreagenz, Biotin-BMCC. Die Reinigung der Thiol-biotinylierten Proteine ​​nach den ABE Schritte hat unterschieden, je nach dem allgemeinen Ziel des Experiments.

Hier beschreiben wir eine Methode, um eine palmitoylierten Protein von Interesse in der primären Hippocamp reinigenal Neuronen durch einen anfänglichen Immunopräzipitation (IP) unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein, von dem ABE und Western Blot-Assay zum direkten Messen Palmitoylierung Niveaus dieses Proteins, der die IP-ABE Assay bezeichnet wird gefolgt gerichtet. Low-Density-Kulturen von embryonalen Ratten hippocampalen Neuronen wurden häufig verwendet, um die Lokalisation, Funktion und Menschenhandel neuronaler Proteine ​​zu untersuchen, so dass sie ideal geeignet für die Untersuchung neuronaler Protein Palmitoylierung über die IP-ABE-Assay. Die IP-ABE Assay erfordert hauptsächlich Standard IP und Western Blot Reagenzien und wird nur durch die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen das Zielsubstrat begrenzt. Dieser Assay kann leicht zur Reinigung und zum Nachweis von transfizierten palmitoylierten Proteine ​​in heterologen Zellkulturen, primären neuronalen Kulturen von verschiedenen Hirngewebe von Maus und Ratte abgeleitet sind und auch primäre Hirngewebe selbst angepasst werden.

Protocol

Ein. Extraktion von Zielprotein aus kultivierten primären hippocampalen Neuronen

  1. Vor der Ernte endogenes Protein aus primären Zellen des Hippocampus, bereiten Sie einen Lysepuffer (LB; Tabelle 1) mit Protease-Inhibitoren. Zu 10 ml Lyse-Puffer, 0,1 ml Lösung Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) auf eine Endkonzentration von 10 mM, und es wird 1 Proteaseinhibitorcocktail Tablette.
  2. Planen N-Ethylmaleimid (NEM)-Lösung (Tabelle 1) aus lyophilisierten Pulvers. Sanft in 100% EtOH lösen sich bei Raumtemperatur (RT). Immer vorzubereiten NEM-Lösung frisch für den Tag des Experiments.
  3. Weiter kombinieren die Lysepuffer und NEM. 0,5 ml 2M NEM-Lösung zu einem frischen 50 ml konischen Röhrchen. 20 ml LB über Oberseite und schnell erfolgt LB + NEM (Endkonzentration 50 mM) auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C in vollem Umfang für 5 min mischen. Immer fügen NEM / EtOH-Lösung ersten und zweiten LB, um richtig mischen die beiden.
  4. Entfernen Sie kultivierten Neuronen aus Inkubator und auf Eis *. Entfernen Sie vorsichtig zellulären Medien und sanft zweimal waschen mit kaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1x. 300 ml LB + 50 mM NEM in die erste Vertiefung der Neuronen im Hippocampus, und kratzen Zellen unter Verwendung eines Einweg-Zelle Heber. Sammeln Sie die Zelllysat, dann entladen, das Lysat in die nächste Vertiefung dieser Gruppe. Kratzen Zellen innerhalb des zweiten auch unter Verwendung der Zellen Heber, sammeln, und wiederholen Sie mit einer dritten, bei Bedarf auch weiter zu konzentrieren das Lysat.
  5. Sammle Zelllysat in eine vorgekühlte (auf Eis), 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 1,4 mit 100 ul LB + 50 mM NEM, um alle verbleibenden Zelllysat zu sammeln. Pass Ganzzelllysat durch eine 26 ½ Manometer Spritze 5-6 mal in mechanische Lyse helfen, wobei darauf zu nicht blasen Blasen in der Lösung. Man kann statt für 15 sec beschallen auf Eis, wenn die Ausrüstung zur Verfügung steht. Nutieren Zelllysat für ≥ 30 min bei 4 ° C.
  6. Klären Sie die Zelle lysate durch Zentrifugation bei 16.000 × g / 30 min, um Pellets nicht lysierten Zellen und Detergens-unlöslichen Material.
  7. Sammle gelöscht Zelllysat (Überstand) in einem neuen vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Wiederholen Ernte Protokoll für alle Gruppen von Zellen. Maßnahme Proteinkonzentration in allen Proben unter Verwendung Lysat BCA-Assay, und Normalisierung des Volumens aller Lysatproben von Gruppen von Zellen zu genau gleich Gesamtprotein haben, mit einem empfohlenen minimalen von 500 ug. Füllen Sie alle Proben mit LB + 50 mM NEM zu 500 ul Gesamtvolumen.
  8. Hinzufügen 1-5 ug primären Antikörper gegen das Zielprotein gerichtet zu jedem Lysat Probe. Nutieren die Antikörper-Lysat Mischproben über Nacht bei 4 ° C.

* Die primären Ratten-Hippocampus-Neuronen in einer Dichte von ca. 250.000 Zellen sollten / Vertiefung in einer 6-Well-Platte kultiviert werden, in einem serumfreien Medium, das eine neuronale B27 Ergänzung, wie zuvor beschrieben, 5, und für den Wunsch gezüchtetd Zeitdauer, typischerweise 14-16 Tage-in-vitro (DIV) zur Reife zu erreichen. Ein Minimum von 500 ug des Gesamtproteins empfiehlt sich erfolgreich immunpräzipitieren und Biotinylierung eines Ziel neuronaler Protein, was typischerweise 2 bis 3 Vertiefungen einer 6-well-Schale.

2. Präzipitation von Antikörper-gebundenem Zielprotein

  1. Vor Ausfällen und Immobilisieren eines Zielproteins, bereiten eine 50% ige Aufschlämmung von Protein-A oder Protein-G-Sepharose beschichteten Perlen. Insbesondere, fügen ≥ 60 ul Sepharosebeads pro Probe bis 1,5 ml Röhrchen, sicherzustellen, dass alle Proben gleiche Mengen von Perlen haben. Magnetkügelchen eignen sich auch, wenn das Gerät zur Verfügung steht.
  2. Hinzufügen eines gleichen Volumens 50% Aufschlämmung auf jeden Antikörper-Lysat Probe und nutieren für ≥ 1 h bei 4 ° C.

3. Acyl-Biotin Exchange: Hydroxylamin (HAM) Spaltung

  1. Während der Durchführung von Schritt 2.2, vorzubereiten eine Anzahl von Rohren mit Lysispuffer (LB) Different pHs. Der pH-Wert ist sehr wichtig für diese Schritte und sollten immer eingestellt unter Verwendung eines pH-Meters wird. Planen 2 ml LB pH 7,2 pro Probe und 0,5 ml Puffer pro Stringente Probe (Tabelle 1). Bereiten auch 0,5 ml LB + 10 mM NEM pro Probe, wie in Schritten von 1,1 bis 1,3. Hinzufügen PMSF und Proteaseinhibitor-Tabletten zu allen Lysepuffer, wie in Schritt 1.1.
    1. Hydroxylamin (HAM) ist ein starkes Reduktionsmittel, deren Spaltung von Palmitat aus Cysteinen für Biotinylierung (Abbildung 1) erforderlich ist, und der Wegfall der HAM-Spaltung dient als negative Kontrolle. Split jede Probe von Kügelchen in zwei Proben, ein Weglassen des HAM Spaltungsschritt (-HAM) und eine einschließlich der HAM Schritt (+ HAM). Um für den Proteinabbau durch HAM Behandlung verursacht normalisieren, sollte man jede Probe in Drittel aufgeteilt, mit 1/3 der Kügelchen für die HAM-Steuerung verwendet und die restlichen 2/3 für die + HAM Behandlung verwendet.
    2. Bereiten Sie zusätzlich 1.5 ml Röhrchen auf Eis, da die-HAM Steuerung für jede Probe beschriftet. Nach Schritt 2,2, sanft zentrifugiert Alle Proben 'Perlen bei 0,5 ug / 1 min bei 4 ° C (Zentrifuge bei dieser Geschwindigkeit, Dauer und Temperatur für alle weiteren Schritte, sofern nicht anders angegeben), legen Sie die Röhrchen auf Eis, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Perlen in 600 ul LB + 10 mM NEM.
  2. Nach Resuspendieren der Proben "Perlen in Lysepuffer + NEM 10mM sofort sammeln 200 ul der Probe Lysat-Kügelchenaufschlämmung und Einleitung in die Probe-HAM Röhrchen auf Eis. Fügen Sie eine weitere 300 ul LB + 10 mM NEM die-HAM Probe und eine zusätzliche 100 ul der + HAM Probe für insgesamt 500 ul in jeder Probe. Die Röhrchen für 10 min auf Eis.
  3. Resuspendieren (waschen) the-HAM und + HAM Proben vorsichtig mit 0,5 ml strengen Puffer pro Probe. Diesen Schritt schnell, wie ein längerer Inkubation in SDS Entfernung von gebundenem Antikörper aus dem Ergebnis wirdPerlen.
  4. Vorsichtig waschen Alle Proben dreimal in 0,5 ml / Probe LB pH 7,2, und Spin-down zwischen Wäschen in Schritt 3.2b.
  5. Während der Durchführung von Schritt 3,5, bereiten Sie einen HAM-Puffer (Tabelle 1). Hinzufügen geeigneten Volumen Hydroxylaminlösung in ein neues Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 M in einem Volumen von 0,5 ml LB pH 7,2, pro Probe + HAM erreichen. Immer Vorbereitung der HAM-Puffer frisch für den Tag des Experiments. 0,5 ml / Probe der LB pH 7,2 bis alle Proben-HAM und 0,5 ml / Probe des HAM-Puffer für alle + HAM Proben.
  6. Nutieren alle Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT). Nicht mehr als 1 Stunde.

4. Acyl-Biotin Exchange: Biotin-BMCC Labeling

  1. Während der Durchführung von Schritt 3.6, vorzubereiten 2 ml LB pH 6,2 pro Probe (Tabelle 1), wie in Schritt 3.1. Legen Sie die LB pH 6,2 auf Eis, bis sie benötigt. Bereiten auch eine Stammlösung von Biotin-BMCC (Tabelle 1) unmittelbar vor Gebrauch. Abwiegen exactly 2,1 mg Biotin-BMCC, in einem 1,5-ml-Tube sammeln und vorsichtig in 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu lösen, indem auf einem Schüttler bei RT bis 8mm Konzentration (verwenden Sie nicht eine Pipette zum Aufbrechen des Pulvers zu erreichen ).
  2. Sobald der Schritt 3,6 abgeschlossen ist, vorsichtig waschen die Perlen einmal in pH 6,2 Lysepuffer, um restliche HAM Puffer zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand und legen Sie die Proben auf Eis.
  3. Biotin-BMCC ist ein maliemide konjugierten Biotin-Molekül, das eine hohe Affinität zu freien Thiolgruppen der Cysteine ​​(Abbildung 1) weist. Während der Durchführung von Schritt 4,2, bereiten 0,5 ml Biotin-BMCC Buffer (Tabelle 1) pro Probe auf Arbeitsebene Konzentration zwischen 0,5 uM bis 5 uM. Konzentrationen von mehr als 5 uM wird wahrscheinlich zu sättigen das Zielprotein 6, und in der Regel nicht überschritten werden sollte, aber dies kann je nach der gewünschten Zielproteins. 0,5 ml Biotin-BMCC Puffer zu jeder Probe, und nutieren genau 1 Stunde bei 4 ° C Nicht mehr als 1 Stunde.

5. Elution von Biotin-konjugiertem Zielprotein und SDS-PAGE

  1. Sobald der Schritt 4,3 abgeschlossen ist, vorsichtig waschen alle Proben einmal in LB pH 6,2. Bewahren Sie alle Proben auf Eis zwischen Wäschen. Entfernen 2x SDS Probenpuffer ohne Reduktionsmittel (Tabelle 1) von -20 ° C Lagerung und langsam auf Eis auftauen.
  2. Vorsichtig waschen Proben dreimal in LB pH 7,5 + PMSF / Inhibitoren, und halten Proben auf Eis zwischen Wäschen.
  3. Entfernen des Überstands des dritten Wäsche, so dass die pelletierten Kügelchen in einer Aufschlämmung mit verbleibenden Puffer in dem Boden des Röhrchens. Tauchen Sie ein Pipette mit einem kleinen Durchmesser Spitze (a Spitze für Gel-oder P2 Pipettenspitze sind ausreichend) in die ganz unten auf der Röhre durch den Schlamm und schnell zu sammeln alle verbleibenden Puffer, man aufpassen, nicht zu nehmen keine Perlen.
  4. Ergänzen Sie die 2x SDS Probenpuffer mit DL-Dithiothreitol (DTT) bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zu erreichen. Hinzufügen40-50 ul 2x Probenpuffer + 5mM DTT zu jeder Probe. Wenn nötig, Wirbel die Perlen vollständig mit dem Probenpuffer vermischt und sofort mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um alle Perlen in einem Pellet, in Probenpuffer untergetaucht zu sammeln.
  5. Sieden alle Proben 10 Minuten lang bei 75-80 ° C. Lassen Proben cool RT für ≥ 10 min auf der Bank oben und Zentrifuge bei 16.000 xg / 3 min vollständig Pellet der Perlen.
  6. Fügen gesamte Volumen der eluierten Protein (Überstand) von jeder Probe zu einer einzigen Spur in einem Polyacrylamidgel für Western Blot, mit SDS-PAGE 7. Alle Proben anzuordnen, so daß die Steuerung-HAM Elutionsmittel und + HAM Eluent für eine einzelne Probe unmittelbar benachbart zueinander während der SDS-PAGE (Abb. 2) ausgeführt werden. Nach der SDS-PAGE, einem PVDF oder Nitrozellulosemembran übertragen.

6. Western Blot und Detektion von Palmitoylierung von Target Protein

  1. Sobald der Schritt 5,6 abgeschlossen ist, waschen Sie die Membranzweimal in Saline (TBS 1x) für 10 min auf einer Schüttelplattform bei RT Tris-gepuffert.
  2. Vorbereiten einer Blocking Buffer um nicht-spezifische Markierung durch Auswiegen Bovine Serum Albumin (BSA), zu 3% Gewicht in einem Volumen von TBS 1x erreichen blockieren Tween-20 + 0,05% (TBS-T), die ausreicht, um vollständig eintauchen die Membran . Für Streptavidin Blotting, immer mit BSA blockiert und nicht Milchpulver. Blockieren der Membran für 1 h bei RT auf einem Schüttler Plattform.
  3. Bereiten Sie eine Antikörper-Lösung der TBS-T + 0,3% BSA. Hinzufügen Streptavidin-HRP-Antikörper rekonstituiert auf 1 mg / ml in destilliertem Wasser bei 1:5,000-1:10,000 verdünnt. Sobald der Schritt abgeschlossen ist 6,2, waschen die Membran einmal in TBS-T für 10 min, dann Inkubieren der Membran in Streptavidin-Antikörper-Lösung auf einem Schüttler für entweder für 1 h bei RT, oder über Nacht bei 4 ° C.
  4. Waschen der Membran dreimal in TBS-T für 10 min auf einem Schüttler Plattform. Um die Palmitoylierung Signal zu erfassen, das HRP freizulegen Lumineszenz unter Verwendung einer chemiluminescent Substrat-Kit.
  5. Um Palmitoylierung Ebenen zu der Menge des Proteins von Interesse, immunpräzipitiert wurde normalisieren, Streifen der Membran unter Verwendung Westernblot Stripping Puffer für 5-10 min auf einer Schüttelplattform bei RT. Die Schritte von 6,1 bis 6,4 mit dem primären Antikörper gegen das Protein von Interesse, die ursprünglich für die Immunpräzipitation verwendet wurde.
  6. Quantifizieren Palmitoylierung des Proteins von Interesse unter Verwendung der Bildanalyse-Software, und normalisieren Palmitoylierung Ebenen zur Höhe des immunpräzipitierten Protein.

Representative Results

Die IP-ABE Assay detektiert spezifisch Thiol-Palmitoylierung von Cysteinresten entlang Substrat Proteine ​​und können verwendet werden, um die Palmitoylierung von immunpräzipitierten neuronaler Proteine ​​in einer Weise in 1 dargestellt detektieren. Behandlung des Proteins mit neuronalen immunpräzipitierten HAM (Abbildung 1) spaltet die Thioesterbindung zwischen Palmitat und einem Cystein der Thiolgruppe, so dass für spezifische Einbau von Biotin-BMCC auf die neu verfügbaren Thiolgruppe, die anschließend nachgewiesen werden kann unter Verwendung von Western Blotting. Das Weglassen HAM (minus-HAM) Spaltung verhindert die Inkorporation von Biotin-BMCC und fungiert als negative Kontrolle für Palmitoyl-spezifische Biotinylierung des Plus-HAM Probe, und sollte daher stets benachbarte laufen an den Plus-HAM Probe werden für westlichen Blotting durch SDS-PAGE (Abb. 2).

In einer optimierten Experiment (2A), die PalmitoylierungSignal der neuronalen Proteinextravasation δ-Catenin 2 kann leicht durch Blotting für Biotin-BMCC bei einer Konzentration von 1 nM, unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert mit HRP, gegen parallel minus-und plus-HAM Proben nachgewiesen werden. Die spezifische Palmitoylierung Signal für δ-Catenin erscheint an dessen vorhergesagten Größe von 160kD, nur in der Plus-HAM Probe. Die Spezifität dieses Signals wurde durch Rehybridisierung für δ-Catenin mit dem spezifischen Antikörper, die ursprünglich verwendet wurde, um es immunpräzipitieren, was in einem Signal in beiden HAM Behandlungen gleichzeitig vorhergesagten Größe bestätigt. Optimierung der IP-ABE Assay (2A) wird in einem Western-Blot-Profil einer Minus-HAM Probe, die leicht von dem Plus-HAM Probe führen wird und eine minimale bis keine Palmitoylierung Signal.

Die Konzentration von Biotin-BMCC zur palmitoylierten Cysteine ​​beschriften erfordert eine sorgfältige Optimierung, und wenn ein super-Sättigungskonzentration von biOtin-BMCC wird während der ABE Chemie Schritte (2B), übermäßige Hintergrund und unspezifische Signale sichtbar sein wird. Eine lineare Kennlinie für die Biotinylierung eines palmitoylierten neuronaler Protein, dem nikotinischen Acetylcholinrezeptor α7, unter Verwendung von Biotin-BMCC wurde zuvor 6 bestimmt und zeigt nahezu vollständigen Sättigung bei einer Konzentration von 5-10 pM. Obwohl die optimale Konzentration von Biotin-BMCC wird abweichen leicht je nach neuronalen Zielprotein, wird die Behandlung mit Biotin-BMCC in einer Konzentration von mehr als 5 uM wahrscheinlich super-Sättigung des Zielproteins und resultieren in einem Western Blot Profil mit sichtbarer Hintergrund und unspezifische Signale. Eine Konzentration von 0,5 pM für Biotin-BMCC wurde zuvor verwendet, um die Palmitoylierung von anderen neuronalen Proteinen einschließlich SNAP-25, Huntingtin, AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und GluA1 GluA2 und Paralemmin 8, und Bestimmung der optimalen Konzentration eines neuartigen detektierenZielprotein kann durch Versuch und Irrtum in linearer Weise bewerkstelligt werden, beginnend im Bereich von 0,5 bis 5 uM, daß wir hier beschreiben. Die daraus resultierenden Streptavidin Western-Blot-Profile unter den Minus-und Plus-HAM Proben für δ-Catenin Palmitoylierung ähnlich aussehen, wenn sie mit 4 uM Biotin-BMCC (2B), mit zusätzlichen Hintergrundinformationen Signalen in verschiedenen Größen, so dass unangemessen Biotinylierung aufgetreten ist behandelt.

Hydroxylamin ist ein starkes Reduktionsmittel, das zu begrenzter Abbau des Zielproteins neben seiner effizienten Spaltung Thioesterbindung. Folglich erfordert Optimierung ABE Chemie ein, die Menge an Protein für immunpräzipitierten minus-und plus-HAM Proben (Schritte 3.2 - 3.3) verwendet normalisieren. Normalisierung erfordert die Verwendung der doppelten Menge an immobilisiertem Zielprotein in der Plus-Minus-vs-HAM Probe, die tatsächlich zu ununterscheidbar western Blotting Profile für das Zielprotein, wie für δ-Catenin (Abbildung 2A, B) gezeigt. Wenn jedoch die Menge der immobilisierten Ziel-Protein nicht zwischen minus-und plus-HAM Proben normalisiert, kann das resultierende Westernblot Signal für das Zielprotein in der Plus-HAM Probe verloren, da für δ-Catenin gezeigt, wenn gleiche Mengen an Protein wurden in beiden Behandlungen HAM (2C) verwendet.

Die Spezifität der ABE Chemie für die Kennzeichnung palmitoylierte Proteine ​​ist sehr empfindlich und erfordert die Optimierung. Die häufige Fehler bei der IP-ABE Assay angetroffen umfassen die suboptimalen Ergebnissen in den 2B und 2C gezeigt, und Abbau des Zielproteins, unabhängig von HAM Behandlung, die typischerweise durch ältere Reagenzien und Puffer verursacht werden und falsche pH. Um diese Fehler zu vermeiden und zu korrigieren suboptimale ABE Chemie, die Frische und Konzentration der Reagenzien für die erforderlichePuffern in Tabelle 1 aufgelisteten sollte immer geprüft werden, und die pH-Einstellungen aller Puffer sollten immer vor der Ausführung des Experiments überprüft werden.

Puffer Working Concentration Kommentare
Lysispuffer (LB) In destilliertem H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% Glycerin N / A Vorbereiten, bevor Experiment und bei 4 ° C
NEM-Lösung In 100% EtOH: NEM lyophilisierte Pulver 2 M Ansetzen, unmittelbar vor Gebrauch.
Strenge Buffer In LB: 10 mM MEM 0,1% SDS N / A Planen kurz vor Gebrauch auf Eis zu halten.
LB pH 7,2 In LB: pH-Wert auf genau 7,2 N / A Verwenden Sie einen pH-Meter auf pH unmittelbar vor Gebrauch einzustellen.
HAM Buffer In LB pH 7,2: Auf HAM-Lösung 1 M (final HAM Konzentration) Planen unmittelbar vor Gebrauch.
LB pH 6,2 In LB: Der pH-Wert exakt 6,2 N / A Gleiche wie für LB pH 7,2
Lager Biotin-BMCC Lösung In DMSO: 2,1 mg Biotin-BMCC Lösung 8 mM Planen unmittelbar vor Gebrauch.
Biotin-Buffer BMCC In LB pH 6,2: In Biotin-BMCC Lösung 1 bis 5 uM (final Biotin-BMCC Konzentration) Planen unmittelbar vor Gebrauch.
2x SDS Sample Buffer, keine Reduktionsmittel In destilliertem H 2 O: 5% SDS 5% Glycerol 125mm Tris-HCL pH 6,8 0,01% Bromphenolblau N / A Vorbereiten, bevor Experiment, und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Ergänzung mit 5 mM DTT vor Gebrauch.

Tabelle 1. Puffer und Reagenzien für die IP-ABE-Assay benötigt. Viele der Lysepuffer kann vor Beginn des Experiments, aber der pH-Wert sollte überprüft werden und unmittelbar vor der Verwendung mit einem pH-Meter eingestellt, um den Erfolg der ABE Chemie sicher vorbereitet werden. Die Mehrheit der Stammlösungen sollten bereit sein, für jedes Experiment frisch, unmittelbar vor Gebrauch. Viele der Puffer erfordern Reagenzien in den meisten Laboratorien für Biochemie ausgestattet und spezielle Reagenzien mit Lieferanteninformationen sind in der Tabelle von Reagenzien und Geräten angegeben.


Abbildung 1. Schema der Immunpräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) Assay zur Reinigung und detektieren Palmitoylierung neuronaler Proteine. Kultivierten hippocampalen Neuronen lysiert werden, (1) ein Ziel-Protein wird dann unter Verwendung einer Ziel-spezifischen Antikörper, und immobilisiert auf Sepharose Kügelchen mit Protein G oder A beschichtet Das gereinigte Zielprotein dann (2) mit N-ethylmaliemide (NEM) irreversibel zu binden und blockieren freie Thiol (-SH) Gruppen entlang unmodifizierte Cysteine ​​(C). Das Zielprotein wird dann (3) auf eine Behandlung mit Hydroxylamin (HAM) unterzogen, wodurch spezifische Spaltung von Bindungen an Thioester palmitoylierten Cysteinen und die Demaskierung eines freien palmitoylierten Thiolgruppe (-SH). Als nächstes wird das Zielprotein (4) treated mit einem Thiol-reaktiven Biotin-Molekül, Biotin-BMCC, wodurch spezifische Biotinylierung des Cysteins palmitoylierten. Schließlich, (5) das biotinylierte Zielprotein eluiert und aus dem Antikörper und Wulst. Das Zielprotein mit seinen palmitoylierten Cystein (s) mit Biotin markiert ist nun für SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot mit Streptavidin für Palmitoylierung des gereinigten neuronalen Protein nachzuweisen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Detektion Palmitoylierung des neuronalen Proteinextravasation δ-Catenin unter Verwendung der IP-ABE Assay. Primären Ratten hippocampalen Neuronen wurden als Pre gezüchtetbisher beschriebenen 5, bei einer Dichte von 130 Zellen / mm 2 bis zur Fälligkeit bei 14DIV wurden dann lysiert, und einer der IP-ABE Assay Palmitoylierung eines kürzlich identifizierten palmitoyliert neuronalen Substrat, δ-Catenin 2 zu erfassen. Gereinigtes Immunpräzipitaten (IPs) von δ-Catenin (Zielprotein) wurden isoliert unter Verwendung von 5 ug δ-Catenin-Antikörper pro Probe (BD Transduction Laboratories), und wurden dann in SDS-PAGE parallel minus-und plus-hydroxylamin (HAM) ausgesetzt Proben. Palmitoylierung wurde durch Western-Blot (WB) mit Streptavidin-HRP (Palmitoylierung) erfasst wird, und die Membran wurde gestrippt und einer reprobe WB für δ-Catenin. (A) Eine optimierte repräsentativen IP-ABE Ergebnis für palmitoylierten δ-Catenin (Pfeilspitze) behandelt mit 1 uM Biotin-BMCC, welche die Spezifität der ABE Chemie zum Nachweis von Thiol-palmitoylierten Proteine ​​aus IP Proben. (B) A sub-optimal vertretenrepräsentativen IP-ABE Ergebnis für δ-Catenin, in denen ein Überschuß Konzentration von 4 Biotin-BMCC uM verwendet wurde, was zu nicht-spezifische Signale und Hintergrund in beiden minus-und plus-HAM Proben (Pfeile). (C) Ein weiterer suboptimalen repräsentativen IP-ABE WB für δ-Catenin, in denen eine übermäßige Konzentration von 4 uM Biotin-BMCC verwendet wurde, und der Menge an Protein für die plus-HAM IP Probe verwendet wurde nicht für HAM-vermittelte normalisiert Proteinabbau, was zu einem Signal verloren in der reprobe WB für δ-Catenin. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Die IP-ABE-Assay präsentiert hier ist eine einfache und hochempfindliche Methode zur Detektion palmitoylierte Proteine ​​in kultivierten primären hippocampalen Neuronen, die meist von biochemischen Standardtechniken. Dies macht den Test leicht anpassbar für Labore bereits mit Western-Blot-Materialien ausgestattet. Die IP-ABE-Assay kombiniert eine Standard-Immunopräzipitation-Protokoll zu isolieren und zu immobilisieren eigenen Zielprotein durch zuvor beschriebenen ABE Chemie 2-4 gefolgt, um schnell zu erkennen Ebenen Palmitat auf einem Substrat Protein. Die ABE Technik weist ein breites Spektrum von Anwendungen zum Überprüfen palmitoylierten Proteine ​​in verschiedenen Geweben und Zelllinien, einschließlich großflächigen Palmitoyl-Proteom Screening von globalen Palmitoylierung Profile und schnellen Nachweis von Palmitoylierung Ebenen eines einzelnen Zielproteins.

Vorherige Beschreibungen der ABE Chemie haben verschiedene Methoden Zelllyse und Detergenzextraktion neuronaler prot genutzteins 2, 9, freie Thiol-Blockade 10, 11, Biotinylierung, und Aufreinigung des Zielproteins 4, abhängig von der Anwendung des Experiments. Die Zugabe von Palmitat zu neuronalen Proteinen führt zu deren Ausrichtung in Richtung Zellmembranen, und Detektion des palmitoylierten Bruchteil eines Zielproteins erfordert ihre Extraktion aus dieser Membranen. Zuvor beschriebenen Methoden ABE haben eine Vielzahl von ionischen 9 und nicht-ionischen Detergenzien 8 bis gewünschten Zielproteine ​​extrahieren verwendet, und die Verwendung eines bestimmten Detergens abhängig vom Zielprotein und seiner bekannten Membranverkehr. Hier nutzen wir das nicht denaturierende und nichtionischen Detergens IGEPAL CA-630 bis palmitoylierten Proteine, die wir für die Extraktion und Detektion des palmitoylierten neuronaler Protein δ-Catenin (Abbildung 2) bestätigt wurden extrahieren. Die Struktur IGEPAL CA-630 enthält einen sperrigen und starren nicht-polaren Kopfgruppe, die nichtstören nativen Proteinkonformation oder Wechselwirkungen, die aber ihre Verbindung kann mit den hydrophoben Bereichen von Membran-assoziierten Proteinen, um dadurch Übertragung Mischbarkeit zu ihnen und ermöglicht ihre Extraktion. Viele neuronaler Proteine ​​lokalisiert dem synaptischen Membran oder postsynaptische Dichte von Synapsen extrahiert werden soll, indem IGEPAL CA-630 werden jedoch einige möglicherweise nicht vollständig löslich zu machen, und kann die Verwendung eines anderen nicht-denaturierenden Detergenz, wie Triton X-100, die erforderlich ist zuvor für ABE Chemie 2, 8 genutzt.

Mehrere Beschreibungen von ABE Chemie haben auch einen anderen thiolreaktive Biotinylierungsreagenz aus dem Molekül Wir beschreiben hier, genannt Biotin-HPDP (Thermo Scientific), die auch bedingt eine unterschiedliche Mittel Proteinreinigung 4 ausgenutzt. Biotin-HPDP ist ein weiteres thiolreaktive, maliemide-konjugierten Biotin-Molekül, das eine Disulfidbindung in der Linkerarms maliemide enthält, strukturell differentiating aus Biotin-BMCC, die nicht enthält dieses Disulfidbindung. Nach Thiol-Biotinylierung eines Proteins frei oder palmitoylierten Cystein durch Biotin-HPDP, kann die resultierende Disulfid-Bindung zwischen dem Zielprotein und dem Biotin-Gruppe durch reduzierenden Reagenzien, um die Biotin-Gruppe freizugeben und zu regenerieren, die das Protein in seiner unmodifizierten Form abgespalten werden, wodurch Biotinylierung von Biotin-HPDP vorübergehend und reversibel. Daher verwenden hierfür Biotinylierungsreagenz erfordert Reinigung eines Target-Proteins durch immobilisiertes Avidin Reagenzien wie Streptavidin-beschichtete Beads. Jedoch Thiol-Biotinylierung eines Zielproteins durch Biotin-BMCC, wie hier beschrieben wird, ist stabil und relativ dauerhaft und braucht Reinigung des Zielproteins durch einen Antikörper, der gegen das Ziel, und immobilisiert auf Sepharosebeads. Beide ABE Techniken wurden bisher für große Bildschirme und Erkennung von Palmitoylierung einzelner Proteine ​​2, 8-10, 12 eingesetzt, und dieIP-ABE Assay Wir beschreiben hier optimal ist für die schnelle Erkennung der Palmitoylierung von einzelnen neuronalen Zielproteine.

Eine überwältigende Mehrheit der zellulären Palmitoylierung beinhaltet die reversible Addition von Palmitat an die Thiolgruppe von Cysteinen (sog. S-Palmitoylierung, die wir als 'Palmitoylierung' in diesem Protokoll zu verallgemeinern), sind jedoch eine sehr begrenzte Gruppe von Proteinen zu irreversiblen Palmitoylierung am Glycin ausgesetzt und Cysteinreste durch die Bildung stabiler Amidbindungen, N-Palmitoylierung 13 bezeichnet. Eine Einschränkung von ABE Chemie ist ihre Unfähigkeit, N-Palmitoylierung wegen der Stabilität der Amidbindung zu detektieren, und so Screening einer neuartigen Zielprotein für Palmitoylierung sollte bestätigt mit 3H-Palmitat metabolische Markierung 1 werden.

Wie zuvor erwähnt, kann die IP-ABE Assay zur Untersuchung leicht Palmitoylierung in Proteinextrakten aus verschiedenen Quellen, einschließlich tran angepasst werdensfected heterologen Zelllinien, primären Gewebes und primären neuronalen Kulturen von verschiedenen Gehirnregionen. Die IP-ABE Assay wurde für die Prüfung Palmitoylierung ausreichenden mutierten Cystein-zu-Serin Proteine ​​an der Position eines Cysteins palmitoylierten entlang eines Zielproteins 8 kennzeichnen, der für die Prüfung dynamischer Palmitat Umsatz an synaptischen Proteinen in kultivierten Neuronen unter basalen Bedingungen 10 verwendet worden, und Veränderungen in Palmitoylierung Ebenen neuronaler Proteine ​​nach Induktion der neuronalen Aktivität 9. Die Empfindlichkeit und Anpaßbarkeit der IP-ABE Assay ideal geeignet ist für die Prüfung Palmitoylierung Profilen neuronaler Proteine ​​und optimale zur Erfassung dynamischer Veränderungen Palmitoylierung.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Canadian Institutes of Health Research MOP-81158 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

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References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

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