נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחלות לב וכלי דם נשארת הגורם המוביל למוות בכל העולם 1. הנדסת רקמות לב טומנת בחובו הבטחה רבה כדי לספק תגליות רפואיות פורצות עם המטרות של פיתוח רקמות פונקציונליות להתחדשות לב, כמו גם מבחני מיון במבחנה. עם זאת, את היכולת ליצור מודלים באיכות גבוהה של רקמת לב הוכיחה קשה. של הלב מטריצה ​​תאית (ECM) היא מבנה מורכב בהיקף של שני האותות ביוכימיים ויומכנית החל מיקרו לקנה המידה ננומטרי 2. לאחרונה מקומי תנאי העמסה מכאנית ואינטראקציות התא-ECM הוכרו כמרכיב חיוני בהנדסת רקמות לב 3-5.

חלק גדול מECM הלב מורכב של סיבי קולגן מיושרים עם קטרים ​​בקנה מידה ננו שמשפיע על מבנה רקמה וצימוד אלקטרו 2 באופן משמעותי. למרבה הצער, כמה שיטות havהיה דואר מסוגל לחקות את הארגון של סיבי ECM עד לקנה המידה ננומטרי. הפיתוחים אחרונים בטכניקות nanofabrication, לעומת זאת, מאפשרים לעיצוב וייצור של פיגומי מדרגי המחקים את in vivo רמזי קשיחות מבניים ומצע של ECM בלב 6-9.

כאן אנו מציגים את הפיתוח של שני לשחזור, חסכוני, ותהליכי nanopatterning להרחבה עבור היישור התפקודי של תאי לב באמצעות פולי ביולוגית הפולימר (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 ופוליאוריטן (PU) פולימר מבוסס. מצע nanofabricated anisotropically אלה (ANFS) לחקות את ECM הבסיסי של רקמות מאורגנות היטב, מיושרות והוא יכול לשמש כדי לחקור את תפקידה של nanotopography על מורפולוגיה תא ותפקודו 10-14.

באמצעות אב סיליקון nanopatterned (NP) כתבנית, עובש acrylate פוליאוריטן (רשות החשמל) הוא מפוברק. עובש רשות החשמל זה משמש לאחר מכן לרשותttern הידרוג'ל PU או PLGA באמצעות סיוע UV או ליתוגרפיה בתיווך ממס כוח הנימים (CFL), בהתאמה 15,16. בקצרה, PU או PLGA מראש פולימר הוא טיפה לוותר על coverslip זכוכית ועובש רשות החשמל מונח על גבי. לCFL בסיוע UV, PU מכן נחשף לקרינת UV (λ = 250-400 ננומטר) לריפוי. לCFL בתיווך ממס, PLGA מוטבע באמצעות חום (120 מעלות צלזיוס) ולחץ (100 kPa). לאחר הריפוי, עובש רשות החשמל הוא קילף, והשאיר מאחורי ANFS לתרבית תאים. תאים ראשוניים, כגון myocytes ילוד חדרית העכברוש, כמו גם שריר לב שמקורם בתאים אנושי pluripotent גזע, יכולים להישמר בANFS 2.

Introduction

מחלות לב וכלי דם היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם ולהציג את נטל כלכלי וחברתי כבדות משקל על 1,17 מערכת הבריאות העולמי מתוח כבר. יש הנדסת רקמות לב שתי מטרות נפרדות: (1) כדי להתחדש שריר הלב פגוע לאחר מחלה או קרדיומיופתיה איסכמית או (2) ליצור מודל נאמנות גבוה של הלב במבחנת הקרנת סמים או דוגמנות מחלה.

הלב הוא איבר מורכב שחייבים לעבוד כדי לספק דם לגוף כל הזמן. מבני מינרית בצפיפות של שריר לב ורקמות התומכות מסודרים בדפוסי סליל לאורך קיר לב 18,19. הלב הוא גם בשילוב Electromechanically 20 באופן מתואם מאוד כדי להוציא דם בצורה יעילה לגוף 21. כמה מכשולים עיקריים יישארו לטפל, עם זאת, לפני העיצוב המורכב של הטבע יכול להיות סכם באופן מהימן במבחנה.ראשית, למרות ששיטות בידול cardiomyocyte חזקות תמשיך להיות מפותחות 22, hPSC-CMS עדיין תערוכת פנוטיפים ולא בשלה. מאפייני אלקטרו והמורפולוגיה להתאים באופן הדוק ביותר רמות עובריות 23. שנית, כאשר כל הזמן בתנאי תרבות מסורתיים, שניהם נגזרים תאי הגזע ושריר לב עיקרי לא יצליחו להרכיב למבני ילידים, כמו רקמות. במקום זאת, התאים הופכים לכיוון אקראי ואינו מציגים את המראה בצורת המוט התאגדו של שריר הלב מבוגר 24.

הסביבה תאית מטריקס (ECM) שבה תאי אינטראקציה משחקת תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים רבים 11,13,25. ECM מורכב מרמזים מורכבים, מוגדרים היטב מולקולריים וטופוגרפיים המשפיעים על המבנה ותפקוד של תאים 6,26 באופן משמעותי. בתוך הלב, יישור סלולארי עוקב מקרוב סיבי ECM קנה מידה ננומטרי הבסיסית 2. ההשפעה של nanotopograph אלהרמזי iCal בתא ותפקוד רקמות, עם זאת, הוא רחוק מלהיות מובן לחלוטין. מחקרים ראשוניים של אינטראקציה תא ביולוגי בקנה מידה ננומטרי לציין את החשיבות הפוטנציאלית ואת ההשפעה של רמזים טופוגרפיים תת מיקרון לתא איתות 27, הידבקות 28-30, 31 בצמיחה, ובידול 32,33. עם זאת, בשל הקושי בפיתוח מצעי nanofabricated לשעתק וניתן להרחבה, מחקרים כאלה לא יכולים לשחזר את ההשפעות סלולריות רב היקף של המתחם בסביבת ECM vivo. בפרוטוקול זה, טכניקת nanofabrication פשוטה וחסכונית כדי לייצר פיגומי תרבית תאים מחקה יישור ECM לב סיבי ילידים מתואר, המאפשרת מגוון רחב של חקירות רומן של אינטראקציות cardiomyocyte-ביולוגי. הבנה כיצד שריר לב באינטראקציה עם סביבת ECM ננו עלולה לאפשר את היכולת לשלוט בהתנהגות סלולרית באופן הדוק יותר לחקות תפקוד רקמת ילידtion. יתר על כן, monolayers התא הוא מערכת ניסיונית פשוטה בהשוואה למבני 3D, אך עדיין מפגין התנהגות רב תאית מורכבת לחקירות מעמיקות והקרנה פונקציונלית 2,34-36. לבסוף, יכולים לשמש פיגומים כאלה כדי לשפר את תפקוד שתל סלולארי כאשר מושתלים לתוך הלב למטרות משובי 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת חדר (~ 23 ° C) אלא אם צוינו אחרת.

1. ייצור של הסיליקון מאסטר

  1. פרוסות סיליקון נקיות עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O 2 / N 2 גז.
  2. מניחים פרוסה סיליקון בספין coater במהירויות סיבוב של 2,000-4,000 סל"ד כדי לייצר סרט עבה 0.3-0.5 מיקרומטר.
  3. תבנית סרט photoresist עם המידות הנכונות באמצעות מערכת photolithography
  4. באופן מלא לטבול את פרוסות סיליקון מצופה photoresist דוגמת בנפח מתאים של פתרון photoresist המתפתח.
  5. שוטפים את פרוסות סיליקון מצופה photoresist פיתחו עם מים deionized.
  6. ליצירת מערכים של רכסים בקנה מידה תת מיקרון עם צד קירות ליד אנכיים, לחרוט יון תגובה עמוק הסיליקון החשוף באמצעות מערכת תחריט.
  7. הסר את photoresist שנותר על ידי הנחת פרוסות סיליקון במערכת אשר פלזמה.
  8. חותכים את סיליקון wafers עם חותך יהלום שקצה לאדוני סיליקון בגודל המתאים לדפוס העתק שלאחר מכן.

2. ייצור של עובש רשות החשמל מהסיליקון מאסטר

הערה: נפח שיש להוסיף לאדון סיליקון לnanofabrication ישתנה בהתאם לאזור של המאסטר nanopatterned להיות משוכפל כמו גם הצמיגות של acrylate פוליאוריטן הפתרון (רשות החשמל).

  1. משטח נקי סיליקון הורים עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O 2 / N 2 גז.
  2. הנח בצד דפוס אדון סיליקון בצלחת פטרי.
  3. לאדון סיליקון עם 2 ס"מ X 2 סנטימטר משטח דפוס, פיפטה 40 μl של רשות החשמל על פני השטח התבנית.
  4. הנח גיליון של 4 סנטימטר סרט X 4 סנטימטר שקוף פוליאסטר (PET) על רשות החשמל חילק.
  5. לחץ כלפי מטה על גיליון PET ולהפיץ את הרשות לשירותים הציבורית מתחת לסדין על פני התבנית באמצעות רולר או משטח קצוות שטוח (כגון כרטיס), כך שכלדפוס הוא מכוסה על ידי prepolymer רשות החשמל.
  6. הנח מאסטר סיליקון, prepolymer, וPET כ 10 סנטימטר מתחת אור UV 20 ואט (115 V) (λ = 365 ננומטר) ל50 שניות. כדי להיות יעיל, אורך גל אור UV יכול להיות בכל מקום בין 310-400 ננומטר. עוצמת האור היא 10-15 mW / 2 סנטימטר על פני השטח של המצע.
  7. לאחר הריפוי, להסיר סרט PET לאט עם מלקחיים. רשות לשירותים ציבוריים צריכה לצרף לסרט PET עם שלילי של nanopattern אדון סיליקון.
  8. לרפא nanopatterns רשות החשמל / PET תחת UV לפחות 12 שעה לפני השימוש. חשיפה היא לא בעיה.
  9. כדי לנקות אדוני סיליקון, למקם סרט נוסף של PET על גבי האדון ללא תוספת של רשות החשמל ולחשוף לאור UV (λ = 365 ננומטר) ל50 שניות ולהסיר סרט PET. זו תסיר את כל מונומרים unreacted.
  10. יש לשטוף את אדון סיליקון עם 100% אתנול או קסילן ויבש תחת O 2 / N 2 גז.

3 א. פולימר פוליאוריתן Nanopatterning

  • הכן 25 שקופיות זכוכית עגולות בקוטר מ"מ על ידי הנחת בחדר טיפול באוזון ל10 דקות.
  • הנח שקופיות זכוכית שטופלה באוזון על גבי בלוק PDMS קטן לטיפול קל.
  • החל שכבה דקה של אמרגן הידבקות משטח עם מכחול לשקופיות זכוכית. שקופיות זכוכית אוויר יבשות למשך 30 דקות.
  • מניחים את שקף הזכוכית על פיסת נייר במדפסת.
  • זרוק לוותר 10 μl של פוליאוריטן (PU) מראש פולימר (נועה 76) למרכז שקופית זכוכית. ודא שאין בועות נמצאות אחרי כן.
  • עובש רשות החשמל פלייס, דפוס עם הפנים כלפי מטה, לשקופית הזכוכית. לפזר את יחידת השיטור באופן אחיד על פני השטח של שקופית הזכוכית על ידי גלגול הרים גליל גומי לאורך עובש רשות החשמל. נייר מדפסת יספוג הצפת פולימר.
  • מנורת UV ואט. זמן פלמור של יחידת השיטור תלוי בכוחו של מקור קרינה.
  • הסר את הדגימה ממקור אור UV ולקלף בזהירות את תבנית רשות החשמל משקופיות זכוכית PU מצופה. פלמור של פו נחשב גomplete כאשר קליפות רשות החשמל העובש נקי מן המדגם ושקופיות זכוכית PU יש מראה ססגוני.
  • מקום דגימות סיימו בייבוש לאחסון במשך זמן רב ככל חודש.
  • ב 3. Nanopatterning midi (lactide-Co-Glycolide) Hydrogel

    1. צור עובש PDMS שטוח ידי ערבוב נמרץ בסיס אלסטומר סיליקון וסוכן ריפוי אלסטומר סיליקון ביחס 10:1.
    2. יוצקים מעורב PDMS מבשר פתרון לתוך צלחת פטרי, כך שמבשר PDMS מגיע 5 מ"מ עד הקצה של המנה (כלומר, כך שPDMS הוא 5 מ"מ עובי).
    3. מניחים צלחת פטרי ומבשר PDMS בייבוש במשך שעה 1 לדגה.
    4. להעביר צלחת פטרי ומבשר PDMS לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס למשך לפחות 2 שעות כדי לרפא.
    5. לאחר PDMS נרפא, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את PDMS שטוח לתוך 3 סנטימטר חלקי ריבוע בגודל 3 סנטימטר. אלה יהיו תבניות PDMS השטוח השתמשו מאוחר יותר בתהליך הדפוסים.
    6. שקופיות זכוכית עגולה בקוטר 25 מ"מ נקי על ידי placing באלכוהול איזופרופיל ל30 דקות בsonicator מים.
    7. מגלשות יבשים ניקו זכוכית תחת O 2 / N 2 גז.
    8. זרוק לוותר על פתרון PLGA 100 μl (15% w / v PLGA בכלורופורם) על גבי שקופית זכוכית.
    9. הנח עובש PDMS שטוח על גבי PLGA לוותר לספוג את הממס ולקבל משטח PLGA שטוח. החל לחץ קל (~ 10 kPa) על ידי הצבת משקל 200 גרם בחלק העליון של PDMS במשך 5 דקות.
    10. לאט לאט לקלף עובש PDMS שטוח ומניח את מכסה הזכוכית על צלחת שחומם מראש (120 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות כדי להסיר ממס שיורי ולהגדיל את ההידבקות בין PLGA וכיסוי הזכוכית.
    11. מניחים את התבנית בNP רשות החשמל על גבי PLGA השטוח ולהפעיל לחץ קבוע (~ 100 kPa) וחום (120 ° C) על ידי הצבת במשקל 1 קילוגרם על גבי עובש רשות החשמל בעת על צלחת החימום במשך 15 דקות.
    12. הסר את המשקל מהשקופית לכסות PLGA ולאפשר לקרקע להתקרר לטמפרטורת חדר. אין להסיר עובש רשות החשמל עד לקרקע הייתהמקורר.
    13. ברגע שהמצע התקרר מספיק, לקלף בזהירות את תבנית NP רשות החשמל, חושף את תשתית NP PLGA. תשתית NP PLGA צריכה מראה ססגוני.
    14. מקום דגימות סיימו בייבוש לאחסון במשך זמן רב ככל חודש.

    4. זריעת תאים ותרבות

    הערה: פרוטוקול זה מתאר את התרבות של myocytes ילוד חדרית העכברוש (NRVMs) ושריר לב H7 האנושי גזע עוברי שמקורם בתא (hESC-CMS), אבל מקורות של תאים אחרים עשויים להיות בשימוש.

    1. צרף את coverslips ANFS (PU או PLGA) לצלחת קלקר 35 מ"מ רקמת תרבות. פיפטה 20 μl של Norland האופטי דבק (NOA83H) לתחתית הצלחת ומניח בעדינות את coverslip ANFS על גבי נועה. לאפשר דבק להתפזר ולכסות את תחתית coverslip כולו. לרפא את נועה על ידי חשיפה למנת UV עבור 10 דקות.
    2. לעקר ANFS על ידי שטיפה עם 2 מיליליטר של 70% אתנול פתרון מימיים במשך 5 דקות, פעמיים. הסר דוארthanol ידי שאיפה. לאפשר ANFS לחלוטין אוויר יבש ל~ 1 שעות מתחת למנורת עיקור UV (λ = 200-290 ננומטר) בארון הבטיחות הביולוגית.
    3. הידבקות הסלולר היא משופרת על ידי ציפוי ANFS בפיברונקטין הלילה. לדלל פיברונקטין במים די ל5 מיקרוגרם / מיליליטר. פיפטה 2 מיליליטר של תמיסת פיברונקטין לתוך צלחת. הנח חממה ב 37 ° C ו-CO 2 לילה 5% (לפחות 6 שעות).
    4. השג NRVMs, hESC-CMS, או תאי לב אחרים של עניין על פי פרוטוקולים קודמים 22.
    5. מדגם תא צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 3 דקות עד גלולה התאים.
    6. מוציא בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
    7. Resuspend תאים בתקשורת והתרבות המתאימה לריכוז של 4.6 x 10 6 תאים / מיליליטר.
    8. זהירות פיפטה 200 μl של השעיה תא על ANFS מעוקר. ודא השעיה תא נשארת על coverslip.
    9. מקום תאי חממה ב 37 ° C ו 5%CO 2 למשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לANFS.
    10. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות החמה למנה ולהחליף את תאים בחממה באותם תנאים.
    11. לאחר 24 שעות, להסיר את המדיה ולשטוף עם 2 מיליליטר של DPBS פעמיים כדי להסיר תאים עודפים.
    12. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות החמה למנה ולהחליף את תאים בחממה באותם תנאים. תרבות התאים למפגש. החלף תקשורת בכל יום אחר.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    איור 1 הוא סקירה סכמטי של תהליך הייצור לשתי שיטות הייצור. בשל התאבכות של אור הנגרם על ידי הטופוגרפיה ננומטרי, nanopatterning צריך לגרום ססגוני משטח לANFS. איור 2 מתאר ססגוני משטח זה על coverslip דוגמת היטב 25 מ"מ NP-PU (איור 2 א) עם רכס 800 ננומטר וגרוב רוחב (איור 2). המראה הססגוני של ANFS ישתנה מעט בהתאם לרוחב הרכס וגרוב.

    לאחר זריעת התאים על גבי ANFS, תאים צריכים להתחיל ליישר בכיוון מקביל עם הבליטות של המצע. יישור צריך להיות ברור בתוך שעה 24 הראשונה לאחר זריעה וצריך להישאר לשלמות של תקופת culturing. איור 3 מציג תמונות שדה בהירות נציג NRVMs לאחר 7 ימים של התרבות וhESC-CMS לאחר 48 שעות של התרבות. NRVMsnd hESC-CMS על משטחי NP להראות אנאיזוטרופיה ברור מבני ויישור (3B דמויות ו3D) ואילו שריר לב על משטחי unpatterned באופן אקראי בכיוון (3A דמויות ו3 ג). ניתוח immunohistochemical מדגיש את ההשפעה של nanotopography על יישור cytoskeletal התא. סיבים מיקרוסקופים אקטין (F-אקטין) וactinin α-sarcomeric בתאים בתרבית על ANFS להיות מיושר לאורך ננו הרכסים אך תישאר יחולק באופן אקראי בתאים במצע unpatterned (איור 4). תאי לב פועם תערוכה ספונטנית לאחר 24-48 שעות של התרבות.

    איור 1
    איור 1.   סכמטית Nanofabrication - תרשים של proc שני nanofabrication ס '. (ב '- ד') מתאר UV בסיוע ליתוגרפיה כוח הנימים (CFL), ואילו - H) מתאר CFL בתיווך ממס. (א) רשות לשירותים ציבורי שליליים עשוי מאדון סיליקון. (ב) יחידת השיטור מראש פולימר הוא על גבי זכוכית ועובש רשות החשמל-לוותר טיפה הוא מונח על גבי. (ג) רשות החשמל עובש וcoverslip יחידת השיטור לאחר מכן נחשפו לאור UV כדי לרפא את יחידת השיטור. פתרון פולימר (E) PLGA הוא על גבי זכוכית, לוותר טיפה ועובש PDMS שטוח משמש ליצירת משטח PLGA שטוח. (F) עובש רשות החשמל מונח על גבי PLGA השטוח וחום קבוע (G) ולחץ מוחלים על חם הבלטה NP לPLGA. (D, H) לאחר קילוף עובש רשות החשמל, מצע NP-PU או PLGA הוא נשאר מאחור. אז יכולים להיות שנזרעו תאי לב על גבי משטח NP זה כדי ליצור מערכים מיושרים של תאים.

    דק page = "תמיד"> איור 2
    איור 2. מצע NP-PU. תצלום של פני השטח NP שטח גדול (). המראה הססגוני של coverslip נגרמת על ידי nanotopography. תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (ב) החתך של nanotopography הבסיסי.

    איור 3
    איור 3. Cardiomyocytes המיושר. 10X תמונות שדה בהירים של NRVMs לאחר 7 ימים של התרבות (A, B) וhESC-CMS אחרי 2 ימים של התרבות (C, D). NRVMs תרבית על מצעי NP-PU (ב ') בתערוכת יישור מבני ברור תוך NRVMs על מצעים שטוחים PU () הוא באופן אקראי מיושר. חיצים ב( ב) ו (ד ') מצביעים על כיוון של אנאיזוטרופיה NP. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.

    איור 4
    .. איור 4 confocal ההדמיה Immunofluorescent יישור תאי cytoskeletal ופסים; actinin α-sarcomeric (אדום), גרעיני תאים (כחול), וה-F-אקטין (ירוק). תאים בתרבית על מצעי NP יש מיושר actinin α-sarcomeric וסיבי ה-F-אקטין תוך תאים בתרבית על מצע שטוח יש באופן אקראי בכיוון סיבים. שיבוץ בערוץ actinin α-sarcomeric אדום מראה בבירור sarcomeres המפוספס.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    רקמות לב תפקודית בוגרות חסרות לשניהם in vivo ו במבחנת יישומים של הנדסת רקמות לב. שיטות nanofabrication CFL שתוארו כאן הן טכניקות חזקות להשגת יישור סלולארי והשפעה על תפקוד רקמות מקרוסקופית עקב יכולת ההרחבה של המערכת. יכולים בקלות להיות בדוגמת שטחים גדולים ומשמשים לתרבית תאים. יישור סלולארי מקרוסקופית הוא חיוני בהנדסת רקמת לב על מנת ליצור biomimetic, רקמה תפקודית כפי שהוא משפיע על תכונות שניהם מכאניות וחשמליות של שריר הלב 38.

    השיטות כאן ניתן ליישם במגוון רחב של יישומים בתוך הנדסת רקמות לב. זה בעבר כבר הראה כי רמזי ננו לעזור ליצור נישה תאי גזע לב ולקדם התחדשות 14. כך באמצעות פולימרים מתכלים כגון PLGA, "טלאים" nanopatterned יכולים להיעשות כדי לקדם אתהחלמה לאחר עלבון לב. לחלופין, באמצעות הידרוג עם מודולי אלסטיות דומה כמו הלב המקומי, ניתן ללמוד אינטראקציות cardiomyocyte-ECM במערכת פשוטה, לשחזור.

    שיטות אחרות שונות, כגון הדפסת microcontact, electrospinning, וmicrotopography, בעבר הועסקו כדי לשלוט במבנה של רקמת לב מהונדסת ב39-41 microscale. בעוד טכניקות אלה הוכחו כיעילים בצוברים יישור סלולארי, סביר להניח כי המבנה והתפקוד של in vivo ברקמת לב נשלטות על ידי הרמזים קטנים בהרבה, nanotopographical של ECM ולכן מצע NP שלנו צריך להוכיח את יתרון. בנוסף, יש לי הדפוסים טכניקות microscale אלה חסרונות הטמונים בהשוואה למצעי nanofabricated anisotropically שלנו. לדוגמא, שיטת nanopatterning שלנו היא יותר יעיל וחסכונית ושליטה מאשר electrospinning. הדפסת microcontact, לעומת זאת, relies בתאי שמירה על נתיבים מסוימים כדי לזכות אנאיזוטרופיה מבני. על מנת ליצור monolayer פונקציונלי, תאים חייבים לאחר מכן להתרבות או להגר מהנתיבים האלה כדי ליצור צמתים הדוקים. זה הרבה יותר קשה עבור תאים עם לא מעט יכולת שגשוג כגון שריר לב בילוד. Microtopography גם הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת ליצור monolayers תא בשילוב הדוק. בשל קנה המידה של התאים בהשוואה לmicrotopography, תאים מתגוררים על גבי או בתוך microridges. זה מגביל את כמות האינטראקציה תאי תאים ומקטין את צימוד תאי תאים. בשיטה שלנו, תאים הופכים מיושרים באמצעות הטופוגרפיה בקנה מידה ננו bioinspired וחופשיות יכולים לקיים אינטראקציה עם תאי שכנים כגדלי תכונה הם לפחות בסדר גודל קטן יותר מהתאים עצמם. זה מאפשר ליותר biomimetic, monolayers תאים בשילוב הדוק שנוצר.

    לקבלת תוצאות אופטימליות עם NP-PU אנו ממליצים בחום הבא גרםצעדי טיפול מראש coverslip ילדה. צעדים אלה יגבירו את הידבקות פולימר למשטח הזכוכית. זה יהיה לא רק סיוע בהסרה נקייה של המאסטר רשות החשמל במהלך ייצור, אלא גם למנוע את הפולימר בדוגמת מניתוק מהזכוכית במהלך הניסויים. כדי לבדוק את האפקטיביות של צעדי הטיפול מראש, מקום אחד מצע NP-PU במים ולבחון אם הפולימר נשאר דבק בזכוכית.

    PLGA הוא שיתוף פולימר של חומצה גליקולית וחומצה לקטית, אשר פותחה עבור שניהם מכשיר ואספקת הסמים in vivo. לפיכך, תשתית זו מספקת ECM טוב, ביולוגית לתאים. הנוקשות של PLGA יכולות להיות מווסתת על ידי אחד כוונון היחס של חומצה גליקולית לחומצה לקטית, או על ידי שינוי ההתכווצות של PLGA בכלורופורם.

    בקלות יכולים להיות מגוונים פרמטרים שונים ומותאמים במערכת זו לאופטימיזציה או למטרות מחקריות. פולימרים המבוססים על יחידת השיטור שונים זמינים עם מגוון רחב שלתכונות מכאניות. כך באמצעות טרום פולימרים PU שונים, יכולות להיות מפוברקות קשיחויות מצע שונות על ידי אותו הפרוטוקול. המשתמש יכול גם לשנות את הטופוגרפיה המצע. Nanotopography של המצע תלוי בעיצוב של אמן סיליקון. לכן, מגוון רחב של רוחב רכס וגרוב, כמו גם בגיאומטריות שונות, ניתן בדוגמת על ידי שינוי עיצוב אמן סיליקון כדי לעמוד במפרטים.

    הגודל של ננו הרכסים ישפיע גם על התאים ורקמות התנהגות. רוחב חריץ קטן יותר מאפשר פחות חדירה תא לתוך החריצים ולהגביל את האינטראקציה של התא עם nanotopography ההנדסה 2. זה בתורו לשנות את המידה של התנהגות איזוטרופי של monolayer תא לב. בנוסף, הפרוטוקול המובא מוגבל לתרבות דו ממדים (2D) של תאים ויישור. כמובן, כדי להיות באמת biomimetic, רקמת לב הנדסית הייתה צריכה להיות 3D. עבודה עתידית נחוצה לdesigninגרם צפוף ומיושר functional3D רקמת לב. הפרוטוקול המובא כאן, לעומת זאת, מציע שליטה מעולה של מורפולוגיה של תאי לב ומאפשר שליטה על תפקוד רקמת לב מקרוסקופיים המבוססת על רמזים בקנה מידה ננומטרי.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
    2. Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
    3. Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
    4. Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
    5. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
    6. Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
    7. Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
    8. Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
    9. Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
    10. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
    11. Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
    12. Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
    13. Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
    14. Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
    15. Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
    16. Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
    17. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
    18. Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
    19. Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
    20. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
    21. Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. McGraw Hill Medical. (2010).
    22. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
    23. Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
    24. Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
    25. You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
    26. Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
    27. Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
    28. Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
    29. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
    30. Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
    31. Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
    32. Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
    33. Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
    34. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
    35. Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
    36. Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
    37. Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
    38. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
    39. Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
    40. Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
    41. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics