Capillaire de travail lithographie pour l'ingénierie tissulaire cardiaque

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès dans le monde 1. L'ingénierie tissulaire cardiaque est très prometteur pour livrer découvertes médicales révolutionnaires avec les objectifs de développement de tissus fonctionnels pour la régénération cardiaque ainsi que des tests de dépistage in vitro. Cependant, la capacité de créer des modèles haute-fidélité de tissu cardiaque s'est avéré difficile. Matrice extracellulaire du cœur (ECM) est une structure complexe composée de deux signaux biochimiques et biomécaniques allant de la micro à l'échelle du nanomètre 2. Les conditions locales de chargement mécanique et les interactions cellule-ECM ont été récemment reconnus comme des composantes essentielles de l'ingénierie du tissu cardiaque 3-5.

Une grande partie de l'ECM cardiaque est composé de fibres de collagène alignées avec des diamètres à l'échelle nanométrique, qui influe de manière significative l'architecture tissulaire et de couplage électromécanique 2. Malheureusement, peu de méthodes VHAe été capable d'imiter l'organisation des fibres de l'ECM vers le bas à l'échelle du nanomètre. Les récents progrès dans les techniques de nanofabrication, cependant, ont permis la conception et la fabrication d'échafaudages évolutifs qui imitent les indices de rigidité vivo dans structurelles et substrat de l'ECM dans le coeur 6-9.

Nous présentons ici le développement de deux reproductible, les processus de nanostructuration évolutives pour l'alignement fonctionnel des cellules cardiaques en utilisant le poly biocompatible de polymère (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 et un polyuréthane (PU) polymère à base de coût-efficacité, et. Ces substrats anisotrope nanofabricated (ANF) imitent l'ECM sous-jacente de bien organisées, tissus alignés et peut être utilisé pour étudier le rôle de nanotopographie sur la morphologie et la fonction cellulaire 10-14.

L'utilisation d'un nanostructurés (NP) maître de silicium comme un modèle, un acrylate de polyuréthane (PUA) moule est fabriqué. Ce moule de PUA est ensuite utilisé pour pattern l'hydrogel PU ou PLGA via, assistée UV ou force capillaire solvant médiation lithographie (CFL), respectivement 15,16. En bref, PU ou PLGA pré-polymère est goutte distribuée sur une lamelle de verre et le moule PUA est placé sur le dessus. Pour assistée par UV LCF, l'unité centrale est ensuite exposée à un rayonnement UV (λ = 250 à 400 nm) pour le durcissement. Pour solvant médiation de la LCF, la PLGA est gravé en utilisant la chaleur (120 ° C) et de pression (100 kPa). Après durcissement, le moule PUA est décollée, laissant derrière lui un ANF pour la culture cellulaire. Les cellules primaires, tels que néonatales myocytes ventriculaires de rats, ainsi que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines, peuvent être maintenus sur le ANF 2.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde et de présenter un fardeau socio-économique de poids sur un 1,17 de système de santé mondial déjà tendu. L'ingénierie tissulaire cardiaque a deux objectifs distincts: (1) pour régénérer le myocarde endommagé après une maladie ischémique ou d'une cardiomyopathie ou (2) pour créer un modèle de haute fidélité de cœur pour criblage in vitro de la drogue ou de la modélisation de la maladie.

Le cœur est un organe complexe qui doit travailler constamment à fournir sang dans le corps. Structures laminaires denses de cardiomyocytes et de tissus de soutien sont disposés dans les modèles hélicoïdaux tout au long de la paroi du coeur 18,19. Le cœur est également électromécanique couplé 20 de manière très coordonnée pour éjecter efficacement le sang dans le corps 21. Plusieurs obstacles majeurs restent à relever, cependant, avant la conception complexe de la nature peut être récapitulé de manière fiable in vitro.Tout d'abord, bien que les méthodes de différenciation des cardiomyocytes solides continuent à être développés 22, HPSC-CM exposer encore phénotypes plutôt immatures. Leurs propriétés électromécaniques et morphologie correspondent plus étroitement les niveaux foetus 23. Deuxièmement, lorsqu'il est conservé dans des conditions de culture traditionnelle, à la fois des cellules souches dérivées et cardiomyocytes primaires ne parviennent pas à monter dans les structures indigènes, tissus, etc. Au contraire, les cellules deviennent orientés de façon aléatoire et ne présentent pas l'aspect en forme de tige bandes de myocarde adulte 24.

La matrice (ECM) environnement extracellulaire avec laquelle les cellules interagissent joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires 11,13,25. L'ECM est constitué de signaux moléculaires et topographiques complexes, bien définis qui influencent de manière significative la structure et la fonction des cellules 6,26. Dans le coeur, l'alignement cellulaire suit de près les fibres d'ECM à l'échelle du nanomètre sous-jacente 2. L'impact de ces nanotopographindices iCal sur la fonction cellulaire et tissulaire, cependant, est loin d'être entièrement comprise. Des études préliminaires de l'interaction cellule-biomatériau échelle nanométrique indiquent l'importance et l'impact potentiel de sous-micron repères topographiques pour la signalisation 27 cellulaire, l'adhérence 28-30, une croissance de 31, et la différenciation 32,33. Toutefois, en raison de la difficulté à développer des substrats nanofabricated reproductibles et évolutives, ces études n'ont pas pu reproduire les effets cellulaires multi-échelle du complexe dans un environnement ECM vivo. Dans ce protocole, une technique de nano-fabrication simple et rentable à produire des échafaudages de culture cellulaire mimant l'alignement des fibres de l'ECM cardiaque native est décrite, ce qui permet une large gamme de nouvelles recherches sur les interactions des cardiomyocytes biomatériau. Comprendre comment les cardiomyocytes interagissent avec l'environnement ECM à l'échelle nanométrique pourrait permettre la possibilité de contrôler le comportement cellulaire de plus simulent étroitement la fonction de tissu natiftion. En outre, des monocouches de cellules sont un système expérimental simplifié par rapport à des structures 3D, mais encore ont un comportement multi-cellulaire complexe pour les enquêtes pertinentes et criblage fonctionnel 2,34-36. Enfin, ces échafaudages pourraient être utilisés pour améliorer la fonction du greffon cellulaire lorsqu'ils sont implantés dans le cœur des fins de régénération 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante (~ 23 ° C) sauf indication contraire.

1. Fabrication de la Silicon Maître

  1. Tranche de silicium propre avec 100% d'éthanol ou le xylène et sèche sous O 2 / N 2 gazeux.
  2. Placez la tranche de silicium en spin-coucheuse à des vitesses de rotation de 2,000-4,000 rpm pour produire un film épais de 0,3-0,5 um.
  3. Motif de la pellicule de résine photosensible avec les bonnes dimensions en utilisant un système de photolithographie
  4. Immerger complètement les tranches de silicium revêtues de résine photosensible à motifs dans un volume approprié de solution de résine photosensible en développement.
  5. Rincer les tranches de silicium revêtues de résine photosensible développé avec de l'eau désionisée.
  6. À former des réseaux de sous-micron avec des crêtes d'échelle près des parois latérales verticales, profondeur de gravure par ions réactifs, le silicium exposé en utilisant un système de gravure.
  7. Retirer la résine photosensible restante en plaçant la tranche de silicium dans un système de calcinateur à plasma.
  8. Couper le silicium wAfers avec un couteau dans les maîtres de silicium de taille appropriée diamanté pour réplique ultérieure moulage.

2. Fabrication de PUA moule de la Silicon Maître

NOTE: Volume à ajouter au maître de silicium pour nanofabrication sera variable en fonction de la zone du maître nanostructurés à répliquer aussi bien que la viscosité de l'acrylate de polyuréthane (PUA) de solution.

  1. Nettoyer la surface principale de silicium avec 100% d'éthanol ou le xylène et sèche sous O 2 / N 2 gazeux.
  2. Placer le côté maître de modèle de silicium dans une boîte de Pétri.
  3. Pour un maître de silicium avec un 2 cm x 2 cm de motif de surface, la pipette 40 ul de PUA à la surface du motif.
  4. Placez une feuille de 4 cm x 4 cm transparent polyester (PET) sur la PUA distribué.
  5. Appuyez sur la feuille de PET et de propager la PUA dessous de la feuille sur la face de motif en utilisant un rouleau ou une surface plane tranchant (par exemple une carte) de sorte que l'ensemble demotif est couvert par le prépolymère PUA.
  6. Placez maître de silicium, prépolymère, et PET environ 10 cm au-dessous d'une lumière de 20 watts (115 V) UV (λ = 365 nm) pendant 50 sec. Pour être efficace, la longueur d'onde de la lumière UV peut être n'importe où entre 310-400 nm. L'intensité de la lumière est de 10 à 15 mW / cm 2 à la surface du substrat.
  7. Après durcissement, retirer le film PET lentement avec une pince. PUA doit être fixé au film de PET avec un négatif du maître nanopattern de silicium.
  8. Cure nanomotifs PUA / PET sous UV pendant au moins 12 heures avant de l'utiliser. Surexposition n'est pas un problème.
  9. Pour nettoyer maîtres de silicium, placez un autre film de PET sur le dessus du maître sans l'ajout de PUA et exposer à la lumière UV (λ = 365 nm) pendant 50 sec et retirer le film PET. Cela permettra d'éliminer tous les monomères n'ayant pas réagi.
  10. Rincer maître de silicium avec 100% d'éthanol ou le xylène et sèche sous O 2 / N 2 gazeux.

3a. Polymère polyuréthane Nanopatterning

  • Préparer des lames de verre de 25 mm de diamètre de cercle en plaçant dans une chambre de traitement à l'ozone pendant 10 min.
  • Placez les lames de verre traités à l'ozone sur petit bloc de PDMS pour une manipulation facile.
  • Appliquer une fine couche de surface d'adhérence avec le pinceau sur des lames de verre. Air lames de verre sèches pour 30 min.
  • Placer la lame de verre sur une feuille de papier de l'imprimante.
  • Déposez distribuer 10 ul de polyuréthane (PU) de pré-polymère (NOA 76) au centre de la lame de verre. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes après l'addition.
  • Lieu PUA moule, modèle face vers le bas, sur la lame de verre. Disperser uniformément à travers l'unité centrale de la surface de la lame de verre en faisant rouler un rouleau de cylindre de caoutchouc le long du moule PUA. papier de l'imprimante va absorber trop-plein de polymère.
  • Lampe UV Watt. Le temps de polymérisation de l'unité centrale est reliée à la puissance de la source d'UV.
  • Retirer l'échantillon de la source de lumière UV et détachez soigneusement le moule de PUA de lame de verre enduit PU. Polymérisation du PU est considéré cemplissez lorsque les moules pelures PUA proprement loin de l'échantillon et la lame de verre PU a un aspect irisé.
  • Placer les échantillons finis dans le dessiccateur pour le stockage, aussi longtemps que un mois.
  • 3b. Nanopatterning poly (lactide-co-glycolide) Hydrogel

    1. Créez un moule PDMS plat en mélangeant vigoureusement silicone base élastomère et d'élastomère de silicone agent de durcissement dans un rapport de 10:1.
    2. Verser le mélange PDMS précurseur solution dans une boîte de Petri de sorte que le précurseur PDMS atteint jusqu'à 5 mm du bord de la cuvette (à savoir de telle sorte que le PDMS est de 5 mm d'épaisseur).
    3. Placez boîte de Pétri et précurseur PDMS dans un dessiccateur pendant 1 h à dégazer.
    4. Déplacez boîte de Pétri et précurseur PDMS dans une étuve à 65 ° C pendant au moins 2 heures pour guérir.
    5. Après PDMS est guéri, utiliser un rasoir pour couper les PDMS plat en 3 cm x 3 cm de sections carrés. Ce seront les PDMS plat moules utilisés plus tard dans le processus de structuration.
    6. Diamètre 25 mm propre lames de verre circulaire de placing dans de l'alcool isopropylique pendant 30 minutes dans un sonicateur de l'eau.
    7. Diapositives nettoyés à sec de verre sous O 2 / N 2 gaz.
    8. Déposer dispenser 100 pi de solution de PLGA (15% m / v dans du chloroforme PLGA) sur lame de verre.
    9. Placez un moule PDMS plat sur le dessus de la PLGA Dispensé d'absorber le solvant et obtenir une surface plane PLGA. Appliquer une légère pression (~ 10 kPa) en plaçant un poids de 200 g au-dessus des PDMS pendant 5 min.
    10. Lentement décoller moule PDMS plat et placez le couvercle en verre sur une plaque préchauffé (120 ° C) pendant 5 minutes pour éliminer le solvant résiduel et augmenter l'adhérence entre le PLGA et le couvercle en verre.
    11. Placer le moule NP PUA sur le dessus de la plate PLGA et appliquer une pression constante (~ 100 kPa) et la chaleur (120 ° C) en plaçant un poids de 1 kg sur le dessus du moule PUA tandis que sur la plaque chauffante pendant 15 minutes.
    12. Retirez le poids de PLGA couvercle coulissant et laisser le substrat refroidir à température ambiante. Ne retirez pas PUA moule jusqu'à ce que les substrats ont étérefroidi.
    13. Une fois les substrats ont suffisamment refroidi, soigneusement décoller le moule NP PUA, révélant le substrat NP PLGA. Le substrat NP PLGA doit avoir un aspect irisé.
    14. Placer les échantillons finis dans le dessiccateur pour le stockage, aussi longtemps que un mois.

    4. L'ensemencement des cellules et de la culture

    NOTE: Ce protocole décrit la culture de néonatales myocytes ventriculaires de rat (NRVMs) et cardiomyocytes H7 souches embryonnaires humaines dérivées de cellules (CSEh-CM), mais d'autres sources de cellules peuvent être utilisés.

    1. Fixez les lamelles ANF (PU ou PLGA) à une culture de tissus boîte en polystyrène de 35 mm. Pipette 20 ul de Norland Optical Adhesive (NOA83H) au fond de la boîte et placez doucement la lamelle ANF sur le dessus de l'ANP. Laissez la colle étalée et couvrir le fond de la lamelle entière. Cure NOA en exposant plat aux UV pendant 10 min.
    2. Stériliser ANF par rinçage avec 2 ml de solution à 70% d'éthanol aqueux pendant 5 minutes, deux fois. Retirez eTHANOL par aspiration. Laisser sécher complètement ANF d'air pour ~ 1 h sous la lampe de stérilisation UV (λ = 200-290 nm) dans l'enceinte de sécurité biologique.
    3. L'adhésion cellulaire est renforcée par le revêtement de la ANF dans fibronectine nuit. Diluer la fibronectine dans l'eau DI à 5 pg / ml. Pipette 2 ml de solution de fibronectine dans le plat. Placer dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant la nuit (au moins 6 heures).
    4. Obtenir NRVMs, CSEh-GC, ou d'autres cellules cardiaques d'intérêt selon des protocoles précédents 22.
    5. Centrifugeuse échantillon de cellules à 1000 rpm pendant 3 min pour sédimenter les cellules.
    6. Retirez délicatement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas perturber le culot.
    7. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture approprié à une concentration de 4,6 x 10 6 cellules / ml.
    8. Pipetage soigneux 200 pi de suspension cellulaire sur ANF stérilisés. Assurez-vous que la suspension cellulaire reste sur la lamelle.
    9. Placer les cellules dans l'incubateur à 37 ° C et 5%CO 2 pendant 4 heures pour permettre aux cellules de se fixer à ANF.
    10. Ajouter 2 ml de milieux de culture chaud à plat et remplacer les cellules dans l'incubateur dans les mêmes conditions.
    11. Après 24 heures, retirer les supports et les laver avec 2 ml de DPBS deux fois pour éliminer les cellules excédentaires.
    12. Ajouter 2 ml de milieux de culture chaud à plat et remplacer les cellules dans l'incubateur dans les mêmes conditions. Culture des cellules à confluence. Remplacer médias tous les jours.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    La figure 1 est une vue d'ensemble schématique du procédé de production pour les deux procédés de fabrication. En raison de la diffraction de la lumière causée par la topographie à l'échelle nanométrique, la nanostructuration devrait se traduire par une surface irisée au ANF. Figure 2 représente cette surface irisée sur un 25 mm NP-PU lamelle bien modelé (figure 2A) avec crête de 800 nm et la gorge largeur (figure 2B). L'aspect irisé de la ANF peut varier légèrement en fonction de la largeur de crête et rainure.

    Après l'ensemencement des cellules sur l'ANF, les cellules devraient commencer à aligner dans la direction parallèle aux arêtes du substrat. Alignement devrait être apparent dans les 24 premières heures après l'ensemencement et doit rester pour l'ensemble de la période de culture. Figure 3 montre des images de champ lumineux représentatifs de NRVMs après 7 jours de culture et CSEh-GC après 48 heures de culture. NRVMs unee CSEh-GC sur les surfaces NP montrent anisotropie structurelle évidente et l'alignement (figures 3B et 3D), tandis que les cardiomyocytes sur des surfaces sans motifs sont orientés de façon aléatoire (figures 3A et 3C). L'analyse immunohistochimique met en évidence l'impact de la nanotopographie sur l'alignement du cytosquelette de la cellule. microfilaments d'actine (actine F) et α-actinine sarcomère dans les cellules cultivées sur les ANF sont alignés le long des crêtes des nano-mais restent distribuées de façon aléatoire dans les cellules sur les substrats sans dessin (figure 4). Cellules cardiaques présentent battements spontanés après 24-48 heures de culture.

    Figure 1
    Figure 1.   Nanofabrication schématique - Schéma de la proc deux nanofabricationesses. (B - D) Représenter UV assistée force capillaire lithographie (CFL), tandis que (E - H) solvant médiation CFL représenter. (A) PUA négative est faite à partir d'un maître de silicium. (B) PU pré-polymère est goutte-distribuée sur une lame de verre et le moule PUA est placé sur le dessus. (C) Un PUA moule et PU lamelle sont ensuite exposés à la lumière UV pour traiter le PU. Solution de polymère (E) PLGA est goutte-distribuée sur une lame de verre et un moule PDMS plat est utilisé pour créer une surface plane PLGA. (F) Un moule de PUA est placé sur le dessus du plat et PLGA (G) de la chaleur et de la pression constante est appliquée à chaud gaufrer le NP dans le PLGA. (D, H) Après retirant le moule PUA, un substrat NP-PU ou PLGA est laissé derrière. Cellules cardiaques peuvent être ensemencées sur cette surface NP pour créer des tableaux de cellules alignées.


    Figure 2. Substrat NP-PU. (A) Photographie de grande surface surface NP. L'aspect iridescent de la lamelle couvre-objet est causée par la nanotopographie. (B) l'image au MEB de la section transversale de la nanotopographie sous-jacent.

    Figure 3
    Figure 3. Des cardiomyocytes alignés. 10X images lumineuses de NRVMs sur le terrain après 7 jours de culture (A, B) et CSEh-GC après 2 jours de culture (C, D). NRVMs cultivé sur des substrats NP-PU (B) présentent alignement structurel évident tout NRVMs sur des substrats PU plat (A) sont alignés au hasard. Les flèches dans (B) et (D) indique la direction de NP anisotropie. Barre d'échelle = 100 um.

    Figure 4
    Alignement imagerie confocale par immunofluorescence Figure 4 cellulaire du cytosquelette et des stries..; actinine α-sarcomérique (rouge), les noyaux cellulaires (bleu), et F-actine (vert). Les cellules cultivées sur des substrats NP ont aligné α-actinine sarcomérique et fibres F-actine alors que les cellules cultivées sur des substrats plats ont orienté de manière aléatoire des fibres. Encart sur le rouge canal de actinine α-sarcomérique montrer clairement sarcomères striés.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Tissus cardiaques fonctionnellement matures font défaut à la fois in vivo et in vitro dans des applications de l'ingénierie de tissu cardiaque. Les méthodes de nanofabrication de la LCF décrits ici sont des techniques fiables pour la réalisation de l'alignement cellulaire et d'influencer la fonction des tissus macroscopique en raison de l'évolutivité du système. De vastes zones peuvent être facilement modelé et utilisés pour la culture cellulaire. Alignement cellulaire macroscopique est essentiel dans l'ingénierie du tissu cardiaque afin de créer biomimétique, tissu fonctionnel, car il influence les propriétés mécaniques et électriques du myocarde 38.

    Les procédés ici peuvent être appliqués à une large gamme d'applications dans l'ingénierie de tissu cardiaque. Il a déjà été démontré que les indices à l'échelle nanométrique contribuent à créer une niche de cellules souches cardiaques et de favoriser la régénération 14. Ainsi, en utilisant des polymères biodégradables tels que le PLGA, "patches" nanostructurés pourraient être faits pour promouvoirguérison après un accident cardiaque. Sinon, en utilisant des hydrogels avec des modules d'élasticité similaires comme le cœur natif, interactions cardiomyocytes-ECM peuvent être étudiés dans un système reproductible simplifiée.

    Diverses autres méthodes, telles que l'impression par microcontact, électrofilage, et microtopographie, ont déjà été utilisés pour contrôler la structure de tissu cardiaque à l'échelle microscopique par génie 39-41. Bien que ces techniques ont fait leurs preuves à obtenir l'alignement cellulaire, il est probable que la structure et la fonction du tissu cardiaque in vivo est régie par les plus petites, les indices nanotopographical de l'ECM et donc notre substrat NP devraient s'avérer avantageux. En outre, ces techniques de formation de motifs micrométriques ont des inconvénients inhérents par rapport à nos substrats nanofabricated anisotrope. Par exemple, notre méthode de nanostructuration est plus rentable et contrôlable que électrofilature. L'impression par microcontact, d'autre part, rels sur les cellules adhèrent à des voies spécifiques pour gagner anisotropie structurelle. Afin de créer une monocouche fonctionnel, les cellules doivent alors soit proliférer ou migrer hors de ces voies pour former des jonctions serrées. Ceci est beaucoup plus difficile pour les cellules avec peu ou pas de capacité de prolifération tels que des cardiomyocytes néonataux. Microtopographie est également limitée par l'incapacité à créer des monocouches de cellules étroitement couplées. En raison de l'ampleur des cellules par rapport à la microtopographie, les cellules se trouvent au-dessus ou à l'intérieur des microcrêtes. Ceci limite la quantité d'interaction cellule-cellule et diminue le couplage de cellule à cellule. Avec notre méthode, les cellules s'alignent par la topographie bioinspirés nano-échelle et peuvent interagir librement avec les cellules voisines comme la taille des longs sont au moins un ordre de grandeur plus faible que les cellules elles-mêmes. Cela permet plus biomimétique, étroitement couplées cellules monocouches à créer.

    Pour des résultats optimaux avec le NP-PU nous vous suggérons fortement suite à la glamelle lass étapes de pré-traitement. Ces étapes vont augmenter l'adhérence du polymère à la surface du verre. Ce ne sera pas seulement une aide à l'élimination propre du maître PUA en cours de fabrication, mais aussi empêcher le polymère à motifs de se détacher de la vitre au cours des expériences. Pour tester l'efficacité des étapes de pré-traitement, placer un substrat NP-PU dans l'eau et observer si le polymère reste collée à la vitre.

    PLGA est un co-polymère de l'acide glycolique et l'acide lactique qui a été développé à la fois pour l'appareil et l'administration de médicaments in vivo. Ainsi, ce substrat est un bon, ECM biocompatible pour les cellules. La rigidité de PLGA peut être modulée soit par réglage du rapport de l'acide glycolique à l'acide lactique ou par modification de la contraction de PLGA dans du chloroforme.

    Différents paramètres peuvent facilement être modifiés et ajustés dans ce système pour l'optimisation ou à des fins d'investigation. Divers polymères à base de PU sont disponibles avec une large gamme d'propriétés mécaniques. Ainsi, en utilisant différents prépolymères PU, différentes rigidités de substrats peuvent être fabriqués par le même protocole. L'utilisateur peut aussi modifier la topographie du substrat. Le nanotopographie du substrat dépend de la conception du maître de silicium. Par conséquent, une série de crêtes et de rainures largeurs, ainsi que des géométries différentes, peut être modelée en modifiant la conception du maître de silicium pour répondre aux spécifications.

    La taille des nano-arêtes aura aussi une influence de la cellule et le comportement des tissus. Largeurs de rainures plus petites pour permettre la pénétration de la cellule inférieure dans les rainures et de limiter l'interaction de la cellule avec la nanotopographie de génie 2. Ceci à son tour modifiera la mesure du comportement anisotrope de la monocouche cellulaire cardiaque. En outre, le protocole présenté est limitée à (2D) la culture de cellules à deux dimensions et à l'alignement. Il est évident que, pour être vraiment biomimétique, un tissu cardiaque d'ingénierie devrait être 3D. Les travaux futurs est nécessaire pour designing dense et aligné functional3D tissu cardiaque. Le protocole présenté ici, cependant, offre un meilleur contrôle de la morphologie de la cellule cardiaque et permet le contrôle de la fonction macroscopique du tissu cardiaque sur la base de signaux à l'échelle nanométrique.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
    2. Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
    3. Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
    4. Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
    5. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
    6. Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
    7. Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
    8. Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
    9. Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
    10. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
    11. Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
    12. Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
    13. Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
    14. Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
    15. Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
    16. Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
    17. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
    18. Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
    19. Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
    20. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
    21. Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. McGraw Hill Medical. (2010).
    22. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
    23. Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
    24. Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
    25. You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
    26. Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
    27. Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
    28. Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
    29. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
    30. Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
    31. Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
    32. Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
    33. Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
    34. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
    35. Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
    36. Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
    37. Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
    38. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
    39. Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
    40. Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
    41. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics