Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Published 1/21/2013
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Biology

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Summary

Nous décrivons une méthode de super-résolution d'imagerie pour sonder l'organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d'autres protéines du cytosquelette bactérien.

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Buss, J., Coltharp, C., Xiao, J. Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery. J. Vis. Exp. (71), e50048, doi:10.3791/50048 (2013).

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Abstract

La division cellulaire bactérienne nécessite l'assemblage coordonné de plus de dix protéines essentielles à midcell 1,2. Au cœur de ce processus est la formation d'une superstructure en forme d'anneau (O-ring) par la protéine FtsZ au plan de 3,4 division. Le Z-ring se compose de plusieurs protofilaments FtsZ simple brin, et de comprendre l'agencement des protofilaments à l'intérieur de l'O-ring donnera un aperçu du mécanisme de Z-anneau de montage et de sa fonction en tant que générateur de 5,6 vigueur. Cette information est resté inaccessible en raison des limites actuelles de la microscopie par fluorescence et par microscopie électronique conventionnelle. Microscopie à fluorescence conventionnelle est incapable de fournir une image à haute résolution de l'O-ring en raison de la limite de diffraction de la lumière (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagerie a détecté dispersés dans les petites protofilaments FtsZ C. cellules crescentus 7, mais est difficile à appliquer à des cellules plus grandes telles queE. coli ou B. subtilis. Nous décrivons ici l'application d'une méthode de super-résolution microscopie à fluorescence, microscopie Localisation photoactivé (PALM), pour caractériser quantitativement l'organisation structurelle de l'E. coli O-ring 8.

PALM offre à la fois l'imagerie à haute résolution spatiale (~ 35 nm) et un étiquetage spécifique pour permettre une identification sans ambiguïté des protéines cibles. Nous avons étiqueté FtsZ avec la protéine fluorescente mEos2 photoactivable, qui passe du vert fluorescence (excitation = 488 nm) au rouge fluorescence (excitation = 561 nm) lors de l'activation à 405 nm 9. Au cours d'une expérience PALM, simples FtsZ-mEos2 molécules sont activées stochastiquement et les positions correspondantes barycentre des molécules individuelles sont déterminées avec une précision <20 nm. Une image de super-résolution de l'O-ring est ensuite reconstruite par superposition des positions des centroïdes de tous détectés FtsZ-mEos2 molécules.

<p class = "jove_content"> En utilisant cette méthode, nous avons constaté que l'O-ring a une largeur fixe de ~ 100 nm et est constitué d'un faisceau lâche de protofilaments FtsZ qui se chevauchent les uns avec les autres en trois dimensions. Ces données fournissent un tremplin pour d'autres études sur les changements du cycle cellulaire dépendant de la 10 Z-ring et peut être appliquée à d'autres protéines d'intérêt.

Protocol

1. Préparation des échantillons

  1. Inoculer milieu LB avec une seule colonie de la souche JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Cultivez la nuit dans un shaker à 37 ° C.
  2. Diluer la culture 1:1000 dans M9 + minimes médias [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, acides aminés et vitamines MEM] et passer à la phase mi-log (DO600 = 0.2 à 0.3) en présence de chloramphénicol (150 ug / ml) à température ambiante (RT).
  3. Provoquer la culture avec 20 uM d'IPTG pendant 2 heures (voir note n ° 1).
  4. Culture culot dans microcentrifugeuse (8.000 rpm, 1 min) et remettre en suspension dans un volume égal d'M9 +; répétition. Après la remise en suspension seconde, poursuite de la croissance à la température ambiante pendant 2 heures.
  5. Fixer culture induite avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS (pH = 7,4) à température ambiante pendant 40 min. Culture Pellet et remettre en suspension dans un volume égal de PBS; répétition. Si l'imagerie de cellules vivantes, sautez la fixation, la culture culot et remettre en suspension dans un volume égalde M9 - [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, Acides aminés MEM]; récidivistes.
  6. Diluer perles d'or 1:10 avec la culture remis en suspension. Appliquer l'échantillon dans la chambre d'imagerie préparé (voir étape 2.4).

[1] Remarque: Le protocole d'induction ci-dessus (étapes 1.1 à 1.3) a été optimisé pour le système d'expression de la souche JB281. Conditions d'induction détaillées peuvent varier pour d'autres systèmes d'expression ou protéines d'intérêt.

2. Assemblée de la Chambre d'imagerie

  1. Préparer une solution à 3% (p / v) d'agarose à M9 -. Faire fondre l'agarose à 70 ° C dans un bloc chauffant paillasse pendant 40 mn. Magasin d'agarose fondu à 50 ° C pendant 5 heures.
  2. Placer une lame de nettoyage microaqueduct dans la moitié supérieure de la chambre d'imagerie avec les électrodes se faisant face vers le bas. Aligner le joint d'étanchéité inférieur sur le coulisseau microaqueduct de manière à recouvrir les canaux de perfusion.
  3. Appliquer ~ 50 pl de la fondue agarose vers le centre de la vitrediapositive. Immédiatement haut de la gouttelette gel d'agarose avec un chiffon propre, sec lamelle. Laisser le gel se solidifier à la température ambiante pendant 30 min.
    1. Pour nettoyer des lamelles: organiser des lamelles dans un support en céramique et une sonication pendant 20 min à rotation bains d'acétone, d'éthanol et 1 M de KOH dans des bocaux en verre. Répétez cycle de trois fois, pour un total de 9 sonications, suivie d'une sonication unique dH 2 O. Rangez les lamelles nettoyées en eau douce dH 2 O. Avant l'utilisation, souffler lamelles sèches avec de l'air filtré.
  4. Retirez délicatement la lamelle, laissant coussin de gel sur la diapositive microaqueduct. Ajouter immédiatement 1 ul d'échantillon de culture cellulaire (voir l'étape 1.6) vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min, ce qui permet à la solution soit absorbée par le tampon de gel. Haut coussin de gel avec une vierge, lamelle sec. Assemblez la chambre d'imagerie tout en suivant les instructions du fabricant.

3. Image Acquisition

  1. Allumez le microscope, la caméra et le laser. Ouvrez MetaMorph douceware (Molecular Devices).
  2. Placer appropriées d'excitation / émission de filtres dans le trajet de formation d'image (figure 1).
  3. Définir des puissances laser et les paramètres d'acquisition en conséquence.
    1. 488-nm laser = 15 mW (voir note n ° 2)
    2. 561-nm laser = 75 mW
    3. 405-nm laser = 2 mW ± filtre à densité neutre (Voir note n ° 3)
  4. Verrouiller chambre d'imagerie dans l'étage via l'adaptateur étage complémentaire.
  5. Désigner une région d'imagerie appropriée (100x100 pixel) qui est homogène éclairé par les trois lasers.
  6. Identifier une zone d'échantillonnage qui contient des cellules et des marqueurs de confiance (billes d'or) à proximité mais ne se chevauchent pas.
  7. Focus sur la surface des cellules les plus proches de la lamelle. Acquérir une image à fond clair avec 50 ms de temps d'intégration et de déplacer le focus 0,5 um dans l'échantillon (Figure 3AI).
  8. Acquérir ensemble l'image de fluorescence verte avec l'excitation de la 488-n m laser en utilisant un temps de 50 ms intégration (Figure 3Aii).
  9. Acquérir le streaming vidéo dans le canal rouge avec un éclairage continu à partir de 405-nm et 561 nm lasers. Pour les cellules fixes, un taux de 50 ms cadre est utilisé pour un total de 20.000 cadres (total ~ min 17) avec la puissance du laser 405-nm rampe d'environ 10% tous les 1000 images (voir note n ° 4). Pour les cellules vivantes, un taux de trame de 10 ms est utilisée pour un total de 3.000 cadres (~ 30 s au total) avec une puissance laser 405 nm constante.
  10. Déplacer le foyer arrière de la surface inférieure des cellules et d'acquérir une autre image de champ clair que dans l'étape 3,7.

[2] Remarque: l'intensité intégrée de la fluorescence verte d'une cellule est directement proportionnelle au nombre total de FtsZ-mEos2 molécules exprimées dans la cellule. La puissance d'excitation 488-nm et les paramètres d'ensemble d'acquisition de fluorescence doit être maintenue constante pour toutes les cellules de telle sorte que le rapport FtsZ-mEos2 niveaux d'expression dans des cellules différentes peuvent être comparés.

ontenu "> [3]. Remarque: Les cellules fixées sont imagés avec la densité neutre (ND) (figure 1, de composants optiques n ° 5) en place dans le but d'atteindre un taux d'activation lente, de sorte que chaque molécule individuelle peut être identifié avec précision le filtre ND est retiré lorsque l'imagerie des cellules vivantes pour augmenter la vitesse d'activation, tout en maintenant une faible probabilité de deux molécules étant activés simultanément dans une zone limitée par la diffraction. La vitesse plus rapide appliquée à imagerie des cellules vivantes est nécessaire de diminuer le temps d'acquisition total, ainsi «geler» l'O-ring en temps et en limitant l'effet de photovieillissement de la cellule.

[4] Remarque: Les numéros de trames acquises ont été optimisés pour notre système et dépendent de la structure cellulaire particulier, l'étiquetage densité, taux d'activation et si l'évacuation de l'ensemble du pool de fluorophores est important pour l'analyse. Dans les cellules vivantes, il est important d'obtenir un nombre suffisant de localisations dans une période aussi courte de time que possible pour éviter le flou de l'image dû au bougé de la structure cellulaire.

4. Construction image PALM

  1. Déterminer la position de centre de gravité de chaque spot détecté.
    1. Chargez la pile d'images dans Matlab (The MathWorks, Inc.)
    2. Découper l'empilement d'image à une région autour d'une cellule qui ne comprend pas tous les cordons repères.
    3. Sélectionnez un seuil d'intensité pour la détection endroit qui est au-dessus du niveau de fond, mais en dessous de la moyenne intensité de la tache. Nous tenons compte de la variation du niveau de fond tout au long d'une expérience en calculant la moyenne de fonctionnement de l'intensité maximale en utilisant un cadre de fenêtre 150. Le seuil d'intensité pour chaque trame est ensuite interpolée à partir des valeurs moyennes de fonctionnement.
    4. Soustraire le seuil respectif de chaque trame. Endroits potentiels sont identifiés comme trois pixels adjacents avec des intensités dessus du seuil.
    5. Adapter l'intensité de fluorescence de chaque point potentiel à un Gaussia bidimensionneln fonction [Equation 1] en utilisant un algorithme des moindres carrés non linéaire (figure 2). La précision de localisation de chaque point est calculée en utilisant le nombre total de photons détectés [équation 2]. N'importe quel endroit mal-ajustement avec une précision de localisation supérieure à 20 nm (cellules fixes) ou 45 nm (cellules vivantes) est éliminée (voir note n ° 5). N'importe quel endroit avec une intensité supérieure à deux volets de l'intensité moyenne, probablement à cause de chevauchement des émetteurs, est également rejeté.
    6. Pour les cellules fixes, retirer des observations répétées de la même molécule en faisant abstraction de toute tache dont le centre de gravité se trouve dans la position 45 nm de toute autre tache qui l'a précédé de 6 trames ou moins. Pour les cellules vivantes, tous les points sont conservés.
  2. Calibrer la dérive échantillon en utilisant le mouvement de repère de calage.
    1. Cultures sur une zone de pixels 10x10 autour d'un marqueur de repère.
    2. Soustraire le seuil respectif déterminé en 4.1.3 de chaque trame.
    3. Monter le profil d'intensité dans chaquebâti par l'intermédiaire des moindres carrés algorithme d'ajustement en supposant une forme gaussienne bidimensionnelle.
    4. Calculer le déplacement entre les positions des centroïdes par rapport à l'image 1.
  3. Corriger la position du centre de gravité de chaque molécule unique identifié en 4.1 avec la dérive appropriée de l'échantillon calculée en 4.2. Comparer les images en fond clair acquises en 3,7 et 3,10. Si les cellules sont observées à se déplacer par rapport aux balises de repère, les données sont jetés.
  4. Superposer toutes les positions corrigées centroïde sur une seule image composée de pixels 15x15 nm. Tracer chaque molécule unique comme une unité de surface, à deux dimensions profil gaussien centré à la position de centre de gravité, avec un écart-type égal à la précision de localisation [Equation 2]. Il en résulte une carte de densité de probabilité, où l'intensité d'un pixel est proportionnelle à la probabilité de trouver une molécule dans ce pixel (Figure 3Aiv).
  5. En comparant les images PALM aux images ensemble.
    1. Replot le centropositions id comme en 4.4, mais sur un plan de 150x150 pixels nm et un écart type égal à 250 nm. Cela génère une image qui imite PALM une image de diffraction limitée, qui peut être utilisé pour comparer l'image de diffraction limitée ensemble, acquis en 3,8 (Figure 3Aiii).
    2. Pour confirmer que les molécules détectées sont représentatifs de l'ensemble de la population, comparer l'image d'ensemble reconstruite (Figure 3Aiii, étape 4.5.1) avec l'image de fluorescence ensemble expérimental (Figure 3Aii, étape 3.8) pour confirmer que les deux images montrent des structures de forme similaire , l'orientation et l'intensité relative.

[5] Remarque: La précision de localisation minimum requis a été déterminé de manière empirique pour chaque méthode d'imagerie en traçant les précisions de toutes les molécules d'un échantillon donné et en choisissant un seuil approprié.

5. Analyse d'images PALM

  1. Mesure de Z-Ring Width et diamètre.
    1. Faire pivoter l'image de manière à PALM verticalement orienter l'axe longitudinal de la cellule (figure 4A).
    2. Cultures sur la région cellulaire contenant le O-ring.
    3. Calculer l'intensité cumulée par projection d'une courbe d'intensité le long de l'axe de temps de la cellule.
    4. Adapter le profil d'intensité à une distribution gaussienne. La largeur de l'anneau est défini comme le maximum moitié pleine largeur (FWHM) de la distribution gaussienne ajustée (Figure 4B).
    5. Projeter le profil de l'intensité cumulée 5.1.2 long de l'axe court de la cellule. Le diamètre de l'anneau est définie comme la longueur du profil d'intensité (figure 4C).
  2. Tracé Densité FtsZ (voir note 6).
    1. Replot les positions centroïdes que dans (4,4), mais sans que le profil gaussien de telle sorte que chaque molécule unique est attribué une valeur de 1 et affecté à un seul pixel correspondant à sa position de centre de gravité. De cette façon, l'intensité de chaquepixel représente le nombre total de molécules détectées dans ce pixel. L'image PALM densité peut également être visualisée comme un tracé de contour (figure 5E).
  3. Détermination de la résolution spatiale.
    1. Théoriquement, réalisables résolution spatiale: créer un PSF représentant pour la totalité de l'échantillon en utilisant la précision de localisation moyenne déterminée de toutes les molécules détectées et calculer la FWHM (équation 3).
    2. Expérimentalement atteint une résolution spatiale: calculer le déplacement moyen entre les observations répétées de la même molécule.

[6] Note: Nous avons utilisé une réflexion interne totale PALM (TIR-PALM, figure 1 et 5) pour restreindre l'activation et d'excitation à une couche mince (~ 200 nm) au-dessus de l'interface cellule / verre. de sorte que seules les molécules FtsZ associés à la membrane le plus proche de la lamelle sera détecté.

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Representative Results

Illustré à la figure 3Aiv est un bidimensionnelle, de super-résolution de rendu de l'anneau Z-générée à partir de la méthode d'imagerie PALM décrit ci-dessus. Ci-dessous, nous résumons les informations qualitatives et quantitatives qui peut être obtenu de leur part.

Qualitativement, nous avons observé que l'O-ring est une structure irrégulière qui adopte plusieurs configurations (bande unique ou d'un arc hélicoïdal) qui ne sont pas distinguées dans conventionnelles images de fluorescence (comparer la figure 3A-Dii et iv). De telles observations peuvent être utilisées pour déterminer le pour cent de la population de cellules qui présente une configuration structurelle donnée.

Nous pouvons également mesurer quantitativement les dimensions de l'O-ring. Notre approche pour la détermination de la largeur de l'anneau et le diamètre sont décrits à l'étape 5.1 et illustré à la figure 4. D'après la figure 4B, la largeur de l'anneau était dethermine à 113 (nm FWHM). Cette valeur est supérieure à la largeur prévue d'un seul protofilament FtsZ (5-10 nm après in vitro EM 11). Dans la figure 4C, le diamètre de l'anneau est mesurée en 1.050 nm. Ce diamètre ne peut être utilisée pour décrire quantitativement le degré de constriction pendant la division cellulaire.

Une autre approche quantitative est de calculer la densité des molécules en comptant le nombre de molécules localisées dans une région définie. La mesure de densité fournit des informations sur la façon dont les molécules sont emballés hermétiquement dans la structure. Densité des molécules peuvent être décrites en termes relatifs et absolus. Densité relative (par exemple fraction de molécules dans l'O-ring contre la cellule entière) fournit des informations sur la distribution des molécules dans différentes régions cellulaires. Mesure de la densité absolue est compliquée par le fait que l'image PALM (Figure 3Aiv) est en fait une projection en 2Dd'un objet 3D. Pour contourner cette complication, nous employons TIR DE PALME, qui restreint le plan de détection d'un seul côté de l'O-ring. Les données résultantes sont illustrées dans la figure 5E. Depuis les molécules tracés représentent un sous-ensemble de la population totale FtsZ, la densité déterminée est une limite inférieure de la densité réelle. La densité maximale observée dans les images TIR de l'O-ring suggèrent que certaines sections contiennent chevauchement protofilaments 10.

Figure 1
Figure 1. Un schéma simplifié de notre configuration microscope. Les trois lasers sont contrôlés par un programme d'imagerie personnalisée développée dans MetaMorph qui permet un contrôle précis de la longueur d'onde d'excitation appropriée. La ligne gris foncé indique le trajet de la lumière d'excitation, tandis que la ligne gris clair indique le chemin d'émission. Pour Refle interne totalection (TIR) ​​microscopie, la plate-forme réglable est traduit perpendiculaire à la trajectoire de la lumière de manière à modifier l'angle d'incidence.

Figure 2
Figure 2. Un résumé de la méthode PALM. Initialement, toutes les molécules FtsZ-mEos2 sont à l'état vert-fluorescence. Lors d'une exposition à un éclairement continu par les lasers 405 et 561, molécules simples sont stochastiquement l'état converti en fluorescence rouge. Le taux de ce processus est déterminé par la puissance du laser 405, tandis que le taux de photoblanchiment est déterminé par la puissance de la 405 à la fois et le laser 561. Idéalement, le taux d'activation et de photoblanchiment sont équilibrés de telle sorte que seule une molécule est détecté par trame. Une fois un nombre suffisant de cadres sont acquises, les images sont traitées sous Matlab en équipant chaque endroit identifié comme décrit à l'étape 4.1. Chaque unique molécule est ensuite tracée (étape 4.4) sur un seul plan, générant ainsi une image PALM, montrée ici en pseudo-couleur rouge. Le cadre délimité en rouge a été établi qu'il contient un point répéter de la même molécule que la trame précédente et n'a donc pas été inclus lors de la construction de l'image PALM.

Figure 3
Figure 3. Images représentatifs de cellules fixes (A et B) et en direct (C et D) exprimant FtsZ-mEos2. Pour toutes les cellules, le contour et la forme générale peut être visualisé dans l'image en fond clair (i). Ensemble d'images de fluorescence (ii) sont acquises à partir de l'excitation laser 488 (étape 3,8) et de la répartition de la totalité du panier FtsZ-mEos2. L'image reconstruite à partir de l'ensemble de données PALM (III, étape 5.4) fournit un contrôle qualitatif pour les fidèles de la méthodereprésentation de la structure d'ensemble vrai. L'image générée PALM (iv) est la somme de toutes les uniques FtsZ-mEos2 localisations et représente une carte de densité de probabilité pour FtsZ-mEos2. Le contour des cellules est représenté par la ligne pointillée jaune en images iii et iv. Les cellules A et C montrent FtsZ dans une conformation seule bande, tandis que les cellules B et D illustrent FtsZ adoptant une conformation en hélice arc, qui est indétectable dans le limité par diffraction sur l'image d'ensemble (iii). Barres d'échelle, 500 nm.

Figure 4
Figure 4. A. Une image PALM affichant des représentations schématiques de Z-largeur de la bague (rouge) et Z-bague de diamètre (vert). Largeur B. Anneau est calculée en ajustant le profil de l'intensité projetée (bleu X) le long de l'axe longitudinal de la cellule avec un gaussien de fonction (gradroite y), puis la détermination de la FWHM (pointillés rouges). Ici, la largeur des cernes a été déterminée à 113 nm. Diamètre de l'anneau C est déterminée par la première projection du profil d'intensité le long de l'axe court de la cellule, puis en calculant la longueur (ligne verte en pointillés) du profil d'intensité supérieure à zéro. Le diamètre de l'O-ring a été établie à 1050 nm.

Figure 5
Figure 5. TIR-PALM permet le comptage précis des molécules. Comme dans la figure 3, l'image clair (A), ensemble de fluorescence d'image (B), reconstruite ensemble de fluorescence image (C) et PALM image (D) sont illustrées pour une cellule donnée d'exprimer FtsZ-mEos2. Les mêmes données utilisées pour construire D est retracé comme un tracé de contour de den moléculesité (molécules par pixel) dans E. A partir de cette analyse de la densité, FtsZ-mEos2 était déterminé à être au maximum présents à 8 molécules par pixel. Car une simple couche de protofilaments FtsZ se traduirait par une densité maximale de 5 molécules par pixel 10, cette analyse suggère que l'O-ring est composé de plusieurs couches de protofilaments FtsZ.

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Discussion

Images PALM contiennent des informations sur compte molécules et fonctions au sein d'une cellule, ce qui permet une analyse détaillée de la répartition et l'agencement des molécules de protéines cibles qui est difficile à obtenir par d'autres moyens. Ci-dessous, nous présentons les précautions qui doivent être prises pour en extraire des informations quantitatives précises tout en maintenant la pertinence biologique des images PALM. Nous explorons également les informations qui peuvent être obtenues en utilisant mieux les cellules vivantes par rapport fixe. Enfin, nous proposons des pistes pour obtenir plus de super-résolution des informations sur les mécanismes de la division cellulaire.

La méthode décrite ci-dessus a été optimisé pour produire des images PALM précises de la manière suivante. Tout d'abord, nous avons caractérisé optimisé et la fonctionnalité de la protéine de fusion afin de s'assurer qu'elle sert de marqueur fiable de la structure Z-ring 10. Deuxièmement, nous avons affiné l'expression de la protéine de fusion depuis la suralimentation et de la sous-expression des résultatsdans la formation de la structure aberrante 10,12,13. Troisièmement, nous avons choisi des seuils pour la détermination de molécule unique (étape 4.1.5) basée sur les propriétés des fluorophores photoblinking 14. Photoblinking complique la détermination de molécules uniques et si rien n'est fait, conduit à surdénombrement de molécules uniques. Bien que surdénombrement n'affecte pas les mesures de dimension, il ne amplifier les mesures de densité absolue et peut créer l'apparence de fausses grappes. Tous ces facteurs doivent être considérés lors de l'application de cette méthode à d'autres protéines d'intérêt.

La sélection des cellules vivantes ou fixes pour l'imagerie dépend de l'information souhaitée et du débit. Imagerie des cellules vivantes est des rapports rapides (30 s), mais seulement sur ​​localisables (c.-à-lents) des molécules. Cela signifie généralement que seules les molécules associées à la membrane sont observées dans les cellules vivantes, tandis que les cellules fixes fournir des informations sur toutes les molécules marquées. Imagerie des cellules vivantes provides haute résolution dimensions structurelles et de la morphologie, mais ne peuvent pas fournir des mesures précises de la densité de molécules dues au mouvement des molécules individuelles. Images de cellules fixes peuvent fournir toutes ces informations, mais nécessitent un faible niveau d'activation UV de sorte que les molécules uniques peuvent être identifiés. Cela conduit à des temps d'imagerie prolongées (> 15 min). En outre, la fixation peut provoquer des aberrations chromosomiques de structure. Tous ces facteurs doivent être équilibrés au moment de choisir quel échantillon taper à utiliser.

La méthode que nous avons décrite PALM offre de super-résolution des détails sur la structure de Z-ring qui peuvent être comparés entre les différentes souches du cycle cellulaire, les états et les conditions de croissance. La mise en œuvre des récentes avancées technologiques peuvent donner un aperçu ajouté dans le mécanisme de la cytokinèse O-ring. Par exemple, l'introduction de l'astigmatisme dans la voie de détection est la façon la plus simple d'ajouter trois dimensions des capacités (~ 100 nm z-résolution) à l'illust montage optiqueclassé dans la figure 1 15. En outre, simultanément imagerie de deux ou plusieurs protéines en même temps est devenue une option réaliste avec l'émergence rapide de spectralement distinctes protéines fluorescentes photoactivables. Enfin, le développement d'une protéine fluorescente qui photoactivates d'une manière UV indépendante permettrait de surveillance à long terme d'une seule cellule sans générer le dommage à l'ADN induits par 405 nm éclairage.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Grant: 5RO1GM086447-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 x MEM Amino Acids Sigma M5550
100 x MEM Vitamins Sigma M6895
IPTG Mediatech 46-102-RF
16% Paraformaldehyde Electron Micrsocopy Sciences 15710-S
SeaPlaque GTG Agarose Lonzo 50111
50 nm Gold Beads Microspheres-Nanospheres 790113-010
FCS2 Imaging Chamber Bioptechs
Stage Adaptor ASI I-3017
Inverted Microscope Olympus IX71
1.45 NA, 60x Objective Olympus
IXON EMCCD Camera Andor Technology DU897E
488-nm Sapphire Laser Coherent
561-nm Sapphire Laser Coherent
405-nm CUBE Laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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