Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

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Summary

Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

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Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).

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Abstract

Enfermedades renales que implican la pérdida urinaria de grandes macromoléculas esenciales, tales como albúmina de suero, durante mucho tiempo han sido pensado para ser causada por alteraciones en la barrera de permeabilidad compuesta de podocitos, células endoteliales vasculares, y una membrana basal de trabajo al unísono. Los datos de nuestro laboratorio utilizando microscopía intravital 2 fotones revelaron una barrera más permeable filtración glomerular (GFB) que se creía en condiciones fisiológicas, con la recuperación de la albúmina filtrada que ocurre en un subconjunto inicial de células llamadas células de los túbulos proximales (PTC) 1,2, 3.

Las técnicas anteriores han usado para estudiar la filtración renal y el establecimiento de la característica de la barrera de filtración involucrados micropunción del lumen de estos primeros segmentos tubulares con el muestreo de los contenidos y el análisis de fluido 4. Estos estudios determinaron la concentración de albúmina en el fluido luminal de ser prácticamente inexistente; corresponde estrechamentea lo que se detecta normalmente en la orina. Sin embargo, la caracterización de los polímeros de dextrano con tamaños definidos por esta técnica reveló los de un tamaño similar a la albúmina sérica tenían niveles más altos en el lumen tubular y la orina, sugiriendo aumento de la permeabilidad 5.

En esto es un esquema detallado de la técnica utilizada para visualizar y cuantificar directamente glomerular fluorescente permeabilidad a la albúmina in vivo. Este método permite la detección de la albúmina filtrada a través de la barrera de filtración en el espacio de Bowman (la cámara inicial de la filtración urinaria), y también permite la cuantificación de la albúmina por la reabsorción de los túbulos proximales y la visualización posterior de transcitosis albúmina 6. La ausencia de albúmina fluorescente a lo largo de los segmentos tubulares posteriores en la ruta a la vejiga pone de relieve la eficacia de la vía de recuperación en los segmentos proximales antes del túbulo. Por otra parte, cuando se aplica esta técnica para determinar la permeabilidadSe informó de dextranos que tienen un tamaño similar a los valores de permeabilidad virtualmente idénticos albúmina 2. Estas observaciones apoyan directamente la necesidad de ampliar el foco de muchas enfermedades renales proteinúricas a modificaciones incluidas en la recuperación de células del túbulo proximal.

Protocol

1. Conjugación de albúmina de suero de rata Sulfo-rodamina 101 cloruro de sulfonilo (Rojo Texas)

  1. Disolver 100 mg de albúmina de suero de rata (RSA) en 6.667 ml de 100 mM de bicarbonato de sodio pH 9,0; concentración final 15 mg / ml en un tubo de 50 ml cónico.
  2. Solución Colocar en hielo / agua vaso de precipitados y se enfría a entre 0 y 4 ° C.
  3. Añadir 200 l de formamida dimetil alta calidad anhidra (DMF) a un vial de 10 mg de cloruro de sulfonilo Texas Red (TRSC); vórtice en el medio durante 15 segundos.
  4. Solución RSA Vortex en medio y añadir el TRSC disuelto.
  5. Resumen 50 ml cónica en papel de aluminio (Parafilm se puede utilizar para asegurar un sello hermético se forma), lugar horizontalmente w / hielo y el lugar sólo en eje de balancín para agitar la solución lentamente (evitar la formación de burbujas) en el cubo de hielo, permitir la reacción continúe a 0 a 4 ° C durante 1 hora.
  6. Hacer 5 L de solución salina al 0,9%, y mojar un peso molecular de 50 kDa cortar cámara que puede ser o bien una membrana) de diálisis con clips, b) ditubería de estudio de carácter como en un flotador-un-Lyzer, o c) casete de diapositiva-a-Lyzer (especialmente adecuada para la eliminación de TRSC no conjugada).
  7. Lugar mezcla de reacción en la cámara de diálisis y el lugar en el recipiente de 5 L w / la solución salina al 0,9%, dializa durante la noche a 4 ° C con una agitación suave usando una barra de agitación.
  8. Cambiar la solución de diálisis 5 L en la mañana y en la tarde hasta una incubación durante la noche resultados en prácticamente ningún cambio de color (Esto suele tardar ~ 48 horas con al menos 4 intercambios). Además, con la MWCO de 50 kDa estar tan cerca de la MW de RSA, 66 kDa, es posible nunca producir una solución transparente, lo que será dependiente de la distribución en el tamaño de los poros de la membrana; 60 hr y 5 es intercambios tiempo más que suficiente.
  9. Medir el volumen y dividir el peso inicial de 100 mg por el volumen para obtener una concentración aproximada de TR-RSA; típicamente gama concentraciones del 10-13 mg / ml. El colorante final: cociente albúmina debe ser ~ 04:01, 1 fluoróforo por 15,000 Daltons MW de proteína. Almacenar a 4 ° C; Nunca congele la solución TR-RSA, como resultado la fragmentación que puede ocurrir va a alterar los valores de permeabilidad.

2. Preparación de la platina del microscopio invertido para Ajustes de imagen / Microscopio

  1. Lugar ~ 4-7 piezas de cinta de autoclave (aproximadamente ¾ "de largo) perfectamente apilados uno sobre el otro en el interior de un plato de 50 mm con un cubreobjetos de 40 mm de la parte inferior (cubreobjetos plato inferior). Estos se deben colocar más cerca de uno de los bordes de modo que el borde de la cinta hará contacto con el borde de curvatura del riñón pero no bloquear la trayectoria de luz objetivo (Figuras 1A y 1B); ratas más grandes requerirán más espacio entre la cinta y el borde del plato.
  2. Coloque 2 toallas Repti-Therm próximos al escenario junto con el plato de 50 mm (Figura 1). Coloque una manta camisa de agua de calentamiento sobre el escenario.
  3. Maximizar la eficiencia en la recogida de imágenes, asegurando la torreta objetivo tiene un 10x de aire or 20x (aire o agua de inmersión) objetivo y un objetivo de inmersión en agua de mayor potencia para recopilar imágenes para la cuantificación.
  4. Durante la proyección de imagen de la forma más eficaz de añadir agua a los objetivos consiste en hacer girar a un lado y agregar el agua con una jeringa de 1 cc con un pedazo largo de tubería de PE-200 que se puede llegar a la cima de los objetivos.
  5. Ajuste la intensidad de excitación del láser de 10 vatios ~ 15-20% utilizando los filtros de densidad neutra en el software. El galio-arseniuro fosfuro fotodetectores no descanned se establecen en 750 para recoger el verde, emisiones y 625 para recoger las emisiones rojas. Azul de emisión (por ejemplo, el tinte nuclear Hoechst 33342) se recogió mediante un detector de multialkaline nondescanned estándar con un valor entre 750-800.
  6. Para asegurar la recolección adecuada de las emisiones de baja intensidad dentro del espacio de Bowman, asegurarse de que los límites inferiores de los detectores se establecen a fin de no excluir estos valores. Marcadores de alarma visuales indicarán si la sensibilidadajuste es demasiado bajo y estos valores se les está dando un valor de intensidad de cero.
  7. Cargue una jeringa de 1 cc con ~ 5-8 mg de la solución de albúmina fluorescente diluido con 0,9% de solución salina estéril para criar a un volumen total de 1 cc.

3. La exposición del riñón en una rata Wistar Munich por intravital 2-Photon imágenes

  1. Comience con una rata de pre-anestesiados utilizando Pentabarbitol (50 mg / ml de solución, μl/100 120 g de peso corporal), inactina (130 mg / ml de solución, μ/100 120 g de peso corporal), o isofluorano (5% de inducción, 1.5 al mantenimiento 2,5%), una línea morada venosa acceso (ya sea venosa yugular o femoral), y el flanco izquierdo afeitado desde justo debajo de la caja torácica hasta justo por encima del muslo izquierdo.
  2. Coloque la rata plana en su lado derecho para que el lado izquierdo afeitado quede hacia arriba, asegúrese de que está sobre la mesa, con su postura alargada y no se agachó, con las patas delanteras tocando entre sí y con las patas traseras toquen entre sí (Figura 2A). Muy palpar suavemente para sentir el riñón para determinar donde naturalmente se establecen en el retroperitoneo y trace una línea recta paralela al cuerpo (de la caja torácica hasta el muslo) con un Sharpie (Figura 2A).
  3. Recoge la piel con un par de pinzas dentadas y pellizcar la piel a lo largo de la línea trazada con un par de pinzas hemostáticas para aplastar el tejido y evitar el sangrado. Corte a lo largo de la incisión usando un par de tijeras quirúrgicas. Aplastar la piel exterior y las capas de músculo antes de la de corte se reducirá dramáticamente y típicamente eliminar el sangrado.
  4. Repita este procedimiento para la capa muscular externa, que es delgada.
  5. Para la incisión en la capa muscular interna, que se exponga el peritoneo, re-palpar el riñón para estimar el tamaño. Apriete una línea de incisión más pequeña que el riñón; asegurando la incisión es sólo sobre el riñón. Lo mejor es hacer la incisión muy pequeña y hacerlo más grande si es necesario. Si esto se hace demasiado grande, se requiere sutura.Esta última incisión es crítica; demasiado en uno u otro sentido afectará la estabilidad en el escenario e inducir ya sea artefactos de movimiento de la respiración (el mejor de los casos) o va a estirar la perfusión renal pedículo renal y reducir negativamente (en el peor de los casos).
  6. Localice el riñón (como se muestra en la Figura 2B) y agarre la grasa que rodea el uso de fórceps, trabajando hacia el polo inferior del riñón en una mano sobre mano de la moda.
  7. Una vez que se alcanza el polo inferior del riñón, tire suavemente del riñón a través de la incisión al momento de apretar suavemente por debajo del riñón para exteriorizar. Si la incisión es demasiado pequeño, aplastar la capa muscular y cortar para ensancharlo; repetir el procedimiento para exteriorizar riñón.

4. Colocación de la rata Wistar Munich en el escenario de la Imagen

  1. Coloque el riñón hacia el borde del plato cubreobjetos con el riñón ligeramente girada hacia el (lado posterior) dorsal de la rata por lo que el lado ventral del riñón is de hacer contacto con el plato inferior cubreobjetos (Figura 1A). Añadir un 09. Solución calentada,% de solución salina estéril al plato.
  2. Mire a través del objetivo de 10x o 20x y comprobar el movimiento. Si se detecta movimiento, gire la rata sobre un poco para el tórax es más lejos del plato inferior cubreobjetos, asegúrese de que el riñón está tan cerca del borde del plato sin estirar el pedículo renal (fig. 1B).

5. Adquisición de imágenes para cuantificar la permeabilidad renal de albúmina

  1. Cálculo de la permeabilidad glomerular (Glomeruluar coeficiente de tamizado; SGC) de cualquier macromolécula será necesario tomar imágenes de fondo de referencia glomérulos individuales antes de la infusión de la molécula fluorescente. Si su microscopio está equipado con una platina motorizada capaz de posiciones de marcación, encontrar y centro de glomérulos individuales con el objetivo de menor potencia y marque cada ubicación. Un pase doble fluoresceína / rodamina epifluorescencia filter es ideal para este procedimiento, aunque cualquier filtro de emisión funcionará (contraste de fase o de otras fuentes no fluorescentes de iluminación no funciona). Los glomérulos aparecerá como estructuras circulares vacíos rodeados por túbulos proximales tienen un autoflourescence amarillo-naranja inherente cuando se ve a través del filtro de doble paso.
  2. Si su microscopio no tiene una etapa motorizada, escanear el riñón en un patrón de trama con el objetivo de baja potencia y hacer un mapa rudimentario de donde están situados los glomérulos individuales, basándose en puntos de referencia naturales tales como grandes vasos sanguíneos superficiales situadas por encima de la cápsula renal o manchas de grasa.
  3. Cambie la torreta con el objetivo de inmersión en agua mayor potencia y tomar conjuntos de datos 3D de cada glomérulos asegurándose de que las asas capilares y el espacio de Bowman son claramente visibles. Utilizando una paleta de pseudocolor (algo que no sea B / W) ayudará a visualizar estas estructuras.
  4. Centrarse en un vaso sanguíneo superficial lentamente infundir en tél fluorescente albúmina toma tiempo que se da para permitir la distribución sistémica. Para las moléculas con baja SGC es esencial para maximizar los valores de intensidad en el plasma pero no para llegar a niveles que saturar los fotodetectores en el microscopio. Esto aumenta la detectabilidad de las moléculas de filtrados. Nota: por lo general hay un lapso de 5-7 segundos entre el momento de la albúmina fluorescente se introduce a la vez que aparece en la pantalla (la adquisición de imágenes completas en ~ 1 fotograma / segundo).
  5. Deje aproximadamente 10 minutos para que los pequeños fragmentos posibles peso molecular se desvanezcan antes de la adquisición de volúmenes 3D a intervalos de 1 micras que se utilizarán en el cálculo de GSC albúmina. Por lo general, la tensión de Munich ratas Wistar del Simonsen tiene muchos menos glomérulos superficiales, por lo que todo lo que se puede visualizar son imágenes y cuantificados. La cepa Frömter tiene un número mucho mayor de lo que se limita el número cuantificado de ~ 10.
  6. Al final del estudio, la rata se sacrificó a través de una sobredosis de la anestésicosCI utilizado en el estudio. Un doble pneumothoracotamy se lleva a cabo para asegurar la eutanasia.

6. Cálculo de GSC para fluorescente albúmina de volúmenes 3D

  1. El uso de software de procesamiento de imágenes Metamorph cargar los conjuntos de datos 3D para cada glomérulos, tanto en el conjunto de antecedentes y establecer tomada después de la infusión de albúmina fluorescente.
  2. En el volumen que contiene la albúmina fluorescente localizar un bucle capilar superficial con espacio suficiente espacio vacío entre sus márgenes definidos y el borde de la cápsula de Bowman.
  3. En el volumen de fondo localizar el mismo plano focal que debe contener todas las señales visuales de la imagen que contiene albúmina. Seleccione una región dentro del loop capilar de interés y anote la lectura de intensidad media. A continuación, seleccione una región en el espacio de Bowman y anote la lectura de intensidad media. Estos serán utilizados como los valores de fondo.
  4. Para la cuantificación, seleccione la región similar en el espacio de Bowman en el c albúminaontaining imagen. Haga esto por lo menos otras dos regiones a un valor medio de la intensidad media en el espacio de Bowman.
  5. Seleccione el loop capilar con la intensidad plasma brillante y dibujar una región que lo rodea. Siguiente con la función de umbral, resalte los valores brillantes dentro del plasma circulante, evitando las rayas oscuras que circulan glóbulos rojos. Tenga en cuenta los valores medios de intensidad del plasma del espacio seleccionado. Es importante seleccionar preferentemente las zonas brillantes del plasma debido a factores dentro de la sangre sólo servirá para provocar y la subestimación de los niveles de fluorescencia de plasma.
  6. Usando una hoja de cálculo de Microsoft Excel introducir los valores para calcular el GSC donde:

Figura 1

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Representative Results

La Figura 3 muestra un ejemplo de una imagen tomada de una superficie de un glomérulo Múnich Frömter rata Wistar y las medidas adoptadas para determinar la permeabilidad de la albúmina fluorescente. El valor GSC para la albúmina de 0.0111 deriva de este otoño glomérulo individual dentro del rango observado en esta cepa de ratas Wistar Munich cuando en el estado alimentado 3. La estabilidad se ve en estas imágenes es debido a la planificación y ejecución de las instrucciones representadas en las Figuras 1 y 2 cuidado. Como se dijo anteriormente, la colocación de la incisión utilizada en exteriorizar el riñón es el paso más importante en la producción de imágenes estables libres de artefactos de movimiento.

Figura 1
Figura 1. Un esquema detallado de posicionar una orientaciónde la rata en la platina del microscopio antes de la imagen. yacía suavemente el lado de riñón de rata hacia abajo (como se muestra en A) sobre las almohadillas de calor Repti-Therm con el riñón por la que se en el plato cubreobjetos. Estirar el riñón hacia el exterior (*) de modo que el lado ventral toca la parte inferior cubreobjetos y se hace contacto con la cinta de autoclave (AT). Para minimizar el movimiento de la respiración inducida, rodar la rata hacia adelante (**) de manera que el tórax está fuera de la zona inmediatamente por encima del plato de cubreobjetos. Llene el recipiente con 0,9% de solución salina estéril y cubierta con camisa de agua. Use un termómetro para controlar la temperatura rectal y gire las almohadillas Tore-Therm y bajar según sea necesario. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2 : Src = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Figura 2. . Exteriorización de riñón en Munich Rata Wistar antes de su colocación en platina del microscopio una rata anestesiada se coloca con su tamaño de izquierda a; área entre la caja torácica y la parte superior del muslo afeitado (se muestra en gris, A). Una vez secuenciales incisiones se hacen para cortar a través de la piel, a continuación, la capa muscular interna externa como se muestra por la línea que atraviesa el riñón en A. El riñón con la grasa perirrenal asociado debe ser visible (B). Con un par de pinzas, la grasa se ​​pinza en forma de mano sobre mano hasta que se alcanza el más inferior del poste (BE). Apriete suavemente el área bajo el riñón mientras tira de la grasa de exteriorizar. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3. Imágenes planas individuales tomadas de volúmenes 3D que muestra un glomérulo de una rata Wistar Munich. Paneles A y B muestran imágenes de fondo y una tomada ~ 12 min después de la infusión de Texas Rat Red albúmina sérica (TR-RSA) en blanco y negro. Tenga en cuenta la intensidad de falta discernible de asas capilares (CL) o en el espacio de Bowman (BowSp) en la imagen de fondo (A). El panel C muestra una región tomada desde el panel A en pseudocolor para visualizar mejor los bajos niveles de fondo de intensidad de tejido. Aquí, una pequeña región se dibuja en un loop capilar (ya la región) y en el espacio de Bowman para estimar los niveles de intensidad de fluorescencia pre-existentes, que deben restarse de los valores obtenidos después de la infusión de albúmina fluorescente. Paneles D y E son tomarn desde el panel B se muestra en pseudocolor. Tres pequeñas regiones de interés dibujadas en el espacio de Bowman se utilizan para calcular la intensidad media de fluorescencia de albúmina que se ha movido a través de la barrera de filtración (D). Se registraron valores promedio de intensidad para cada región en el área resaltada en la opción "Mostrar Región Statistics" cuadro de diálogo (panel D '). Para calcular los valores de intensidad de circulación de plasma dentro de los bucles capilares (CL, en el panel E) una región grande se dibuja sobre el más brillante loop capilar y los valores brillantes a lo largo del puesto de relieve el uso de una función de umbral (que se muestra a píxeles de color naranja). Sólo los valores de intensidad de los píxeles resaltados en naranja serán notificados independientemente de la forma o el tamaño de la región circundante. Panel E 'muestra los valores de intensidad promedio bruto de la albúmina en las asas capilares; anote el marcado "Use umbral para mediciones de intensidad" caja que esfacturado. Panel F muestra la progresión de la forma Valores izquierda a derecha empezando por los valores de fondo para las asas capilares y el espacio de Bowman, que se restan de los valores brutos obtenidos dentro de las imágenes. Una vez que se derivan los valores corregidos, espacio valor de la intensidad de Bowman se divide por el valor de la intensidad de bucle capilar para dar el coeficiente de tamizado glomerular, que es una relación de la permeabilidad; moléculas impermeables a tienen un valor de cero (0), mientras que los que se filtran libremente tener un valor de uno (1). Bar = 20 micras. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
La Figura 4. La absorción de albúmina filtrada fluorescente se produce predominantemente in el segmento temprano de los túbulos proximales, los S1. El panel A muestra una sección transversal de un segmento de glomérulo y S1 tomado ~ 20 min después de la infusión de la inicial Rojo Texas RSA bolo. El abrir el espacio de Bowman y la absorción ávida de la albúmina (rojo) es espectáculo en el segmento S1. El panel B muestra un poco profunda 20 micras proyección en 3D del mismo conjunto de datos. Panel C muestra una proyección en 3D usando un menor consumo de energía de 20x objetivo de aproximadamente 60 minutos después de la infusión. Tenga en cuenta el mismo glomérulo visto en los paneles A y B se muestra en C (*) y los niveles más altos de recuperación de albúmina visto en ese segmento frente a otros segmentos del túbulo proximal. Bar = 20 micras. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Los pasos que destacamos a continuación representan lo que sentimos al ser los que van a producir los valores de permeabilidad consistentes y precisos, ya que eludir las trampas siguientes:

  1. Dispersión: El uso de un rojo fluoróforos que emiten permite una mayor eficiencia recaudatoria de la luz ya que los fotones de longitud de onda más largas son menos propensos a la dispersión. Utilizando cualquiera de fluoróforos que emiten verde o azul introducirá una mayor variación en el GSC de debido a la mayor variabilidad en los valores de intensidad de las asas capilares y el espacio de Bowman 3.
  2. Profundidad Image: Aunque se suelen recoger conjuntos de datos 3D profundas (a menudo entre 30-45 micrones de profundidad total), los superiores 10-15 micras representan las profundidades focales más adecuadas para determinar los valores de la SGC. Una vez más con profundidades más profundas viene una disminución de la sensibilidad y un aumento de la variabilidad debida a la dispersión de los fotones emitidos. Más importante, sin embargo es la aglomeración de asas capilares que se produce deeper dentro del glomérulo. Aquí, los bucles capilares son empujados hacia arriba y pegado al borde de la cápsula de Bowman que rodea el espacio de Bowman. Esto aumenta las posibilidades de seleccionar inadvertidamente un área directamente sobre una de las numerosas podocitos que rodean las asas capilares. Esto dará lugar a una subestimación de GSC es porque la verdadera intensidad más alta de la albúmina filtrada, no se informó. Nota Panel B y D en la Figura 3 y la gran cantidad de espacio presente entre el borde de las asas capilares y el borde del espacio de Bowman 3.
  3. Muestreo: Selección de varias regiones dentro del espacio de Bowman asegura la mejor aproximación de la detección de los niveles de albúmina filtrada. También es importante evitar áreas tales como la posición 11 y doce por encima de las asas capilares. Centrándose a través del volumen 3D revela un conjunto de bucles capilares atrapado casi transversalmente justo debajo del plano focal. Esta área le daría un valor GSC falsamente elevada porsobreestimar la albúmina filtrada. A la inversa, es importante para seleccionar la parte más brillante del plasma dentro de los bucles capilares para determinar mejor los verdaderos niveles circulantes de albúmina fluorescente. Aquí subestimar estos niveles también aumentará SGC disminuyendo el valor del denominador en la ecuación.

La validación de esta técnica se produce por formación de imágenes un compuesto libremente filtrada con un SGC de uno (1). Aquí, la preocupación de que subestimar sistemáticamente los niveles plasmáticos de albúmina, debido a las limitaciones ópticas son responsables de sobreestimar permeabilidad a la albúmina, se anulan 3. Además, después de haber determinado un valor para un SGC 70 kDa dextrano que es prácticamente idéntica a la obtenida mediante la medición de los niveles urinarios de despacho / plasma y micropunción demuestran microscopia intravital de 2 fotones es capaz de determinar correctamente la permeabilidad de macromoléculas fluorescentes 2. Por último, la capacidad de visualizar rápidamente ªe glomérulo y segmentos tubulares a lo largo de la ruta de filtrado, con un alto grado de resolución, microscopía de 2-fotón se encuentra una posición única para cuantificar la importancia de la barrera de filtración glomerular y PT en la determinación de protienuria y la albuminuria.

Los protocolos descritos en este documento se basan en el uso de un sistema de 2-fotón con una fase invertida que tiene beneficios en la simplicidad de los procedimientos quirúrgicos que intervienen y la colocación de la rata en el escenario. Para obtener información sobre la utilización de un sistema de 2-Photon con una etapa vertical consulte el capítulo de Dunn et al. 7 en Current Protocols in Citometría (2007).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a los Drs. Silvia B Campos-Bilderback y George J Rodas para completar los procedimientos quirúrgicos que implican la colocación de líneas de acceso venosas. También desean agradecer a Sara E Destete de mantener las colonias Munich-Wistar que consisten tanto Simonsen y cepas Frömter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope Olympus America Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser Spectra-Physics Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors Hamamatsu Corp Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymar T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater ZooMed RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride Invitrogen/Molecular Probes Cat# T-353
Rat Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF Sigma Aldrich Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  7. Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).

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