टी सेल की वास्तविक समय लाइव इमेजिंग परिसर गठन संकेतन

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

हम टी सेल सक्रियण प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि एक जीवित कोशिका इमेजिंग विधि का वर्णन है. हम मात्रात्मक परिणाम टी सेल सक्रियण भर जटिल गठन के संकेत का पालन करने की उपज के लिए टी सेल प्रसार परख, confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और विश्लेषण के संयुक्त उपयोग को प्रदर्शित करता है.

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Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

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Abstract

Protocol

1. टी सेल अभिकर्मक

  1. Nucleofector समाधान के लिए किट की 'अनुपूरक "समाधान के मिश्रण से सक्रिय Amaxa Nucleofector समाधान तैयार है. सक्रिय समाधान तीन महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. संस्कृति के माध्यम में Jurkat टी कोशिकाओं को विकसित [10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 1% पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, और 2 RPMI में मिमी एल glutamine]. बेहतर, कोशिकाओं 1-2 सप्ताह विगलन के बाद किया जाना चाहिए. लघुगणक विकास में सेल संस्कृतियों का उपयोग उच्च अभिकर्मक दक्षता और सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है. वैकल्पिक रूप से, मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल प्राथमिक टी कोशिकाओं के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा कि पहले 8 वर्णित है. यह प्राथमिक टी कोशिकाओं की सक्रियता प्रक्रिया की अवधि के रूप में लंबे समय तक Jurkat टी कोशिकाओं (~ 30 मिनट) की तुलना में है कि जोर दिया जाना चाहिए, एक खुर्दबीन मंच ऊष्मायन प्रणाली सीओ 2, भर में नमी का स्तर और तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए घुड़सवार सक्रियण प्रक्रिया.
  3. 5 लीजिएएक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अभिकर्मक प्रति × 10 6 लॉग चरण टी कोशिकाओं.
  4. 400 से कम 7 मिनट × छ कमरे के तापमान पर के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  5. Centrifugation के दौरान, एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं. 37 पर 5 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से, और पूर्व सेते साथ प्रत्येक अभिकर्मक के लिए अच्छी तरह से एक भरें डिग्री सेल्सियस
  6. अपकेंद्रित्र से ट्यूबों लीजिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 1 मिलीलीटर RPMI में सेल गोली Resuspend.
  7. 400 से कम 7 मिनट × छ कमरे के तापमान पर के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  8. Centrifugation के दौरान, अभिकर्मक समाधान तैयार करते हैं. एक 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक में, एक fluorescently टैग प्रोटीन एन्कोडिंग ब्याज की प्लाज्मिड के 5 ग्राम डीएनए के साथ कदम 1 में तैयार सक्रिय 100 μl Amaxa Nucleofector समाधान मिश्रण. बेहतर, डीएनए एकाग्रता अभिकर्मक समाधान गिराए से बचने के लिए 1 ग्राम / मिलीलीटर से अधिक होना चाहिए.
  9. कोमल pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  10. कोशिकाओं के Centrifugation के बाद, ध्यान से सभी तैरनेवाला हटाने घ नहीं है, जबकिगोली isturbing.
  11. डीएनए / अभिकर्मक समाधान दो बार पिपेट.
  12. गोली डीएनए / अभिकर्मक समाधान जोड़ें.
  13. Amaxa क्युवेट कोशिकाओं स्थानांतरण.
  14. Amaxa Nucleofector डिवाइस में क्युवेट डालें.
  15. Electroporation के लिए एच 10 Amaxa अभिकर्मक सेटिंग (Jurkat के लिए) या टी 23 (प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए) का उपयोग करें.
  16. इनक्यूबेटर से 6 अच्छी तरह से थाली निकालें.
  17. Electroporation के बाद, ध्यान से एक पाश्चर पिपेट का उपयोग 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए सेल निलंबन के साथ सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. सेल मलबे से मिलकर एक गोली बना सकते हैं. गोली स्थानांतरित करने से बचें.
  18. 37 में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस
  19. एक नए कुएं में प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 2.5 मिलीलीटर स्थानांतरण. प्रत्येक अच्छी तरह से 2.5 मिलीलीटर गर्म संस्कृति मध्यम (चरण 2 में वर्णित) जोड़ें.
  20. 72 घंटे के बाद, 400 पर 7 मिनट × छ कमरे के तापमान पर के लिए एक बाँझ ट्यूब और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और यह वाई की जगहइस्तेमाल किया प्लाज्मिड के लिए उपयुक्त स्तनधारी सेल चयन एंटीबायोटिक (; हम क्रमश: 1.3 मिलीग्राम / एमएल और / या 0.2 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता में G418 और / या hygromycin इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उपयुक्त एक एकाग्रता लागू) के साथ पूरक वें संस्कृति के माध्यम से. एक ताजा कुएं में संस्कृति सेल निलंबन. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं transiently ट्रांसफ़ेक्ट और अभिकर्मक के बाद 48 घंटे imaged किया जा सकता है. Transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को तैयार करने के लिए 20 कदम के लिए सामान्य रूप से जारी रखने के चरण 8, में एक साथ दो plasmids के साथ कोशिकाओं सह transfect, और फिर 23 कदम के लिए सीधे छोड़ें. इस परिदृश्य के तहत, कोशिकाओं तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि नोट, और आम तौर पर उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता विषम और जरूरी उच्च नहीं है.
  21. उपयुक्त चयन एंटीबायोटिक के साथ पूरक मध्यम संस्कृति के साथ कोशिकाओं को विकसित. कोशिकाओं को विभाजित और जरूरत के रूप में एंटीबायोटिक पूरक संस्कृति के माध्यम से उन्हें पूरक.
  22. 2 सप्ताह के बाद, FACS के उपयोग (फ्लू से सफल अभिकर्मक की पुष्टिके रूप में orescence सक्रिय सेल छँटाई) इस प्रकार है:
  23. 10 6 कोशिकाओं, 10 6 नकली ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (नकारात्मक नियंत्रण), और स्थिरतापूर्वक fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है कि 10 6 कोशिकाओं लीजिए. कोशिकाओं को एक से अधिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चरण 27 देखें) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कई, अकेले निशान लगाया सेल लाइनों का उपयोग करें.
  24. 400 से कम 7 मिनट × छ कमरे के तापमान पर के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  25. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 500 μl FACS बफर (पीबीएस w / ओ 2 Ca + और ​​2 मिलीग्राम +, 5% एफसीएस, 0,05% सोडियम) में कोशिकाओं Resuspend.
  26. सेलुलर प्रतिदीप्ति सत्यापित करने के लिए एक विश्लेषणात्मक FACS का प्रयोग करें. नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण की है कि कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तुलना कर लें.
  27. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग एक अतिरिक्त, fluorescently टैग प्रोटीन, दोहराने कदम 3-26 के साथ कोशिकाओं transfect करने के लिए.
  28. प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर पर प्रदर्शित करने में कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. के लिए बेहतर है, कम से कम 50%संस्कृति में कोशिकाओं के अत्यधिक फ्लोरोसेंट होना चाहिए. सेल प्रतिदीप्ति FACS के माध्यम से सेल छँटाई के द्वारा बढ़ाया जा सकता है.

कोई अतिरिक्त टैग प्रोटीन विभिन्न fluorophores के लिए जुड़े हुए किया जाना चाहिए और विभिन्न चयन एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एन्कोडिंग प्लास्मिड पर इनकोड किया. एक से अधिक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए चयन मध्यम सभी उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक होना चाहिए.

2. टी सेल प्रसार परख तैयारी

  1. लैब टेक द्वितीय जर्मन coverglass प्रणाली 4 चैम्बर स्लाइड्स का प्रयोग करें. गलती से तैयार करने या प्रयोग के दौरान एक विंदुक टिप के साथ जैसे कक्षों की भीतरी सतह, खरोंच तक नहीं सुनिश्चित करें.
  2. 50 मिलीलीटर स्लाइड तैयारी समाधान तैयार: 12 एम (37%) एचसीएल की 4.6 मिलीलीटर ले लो, 38.5 मिलीलीटर 100% इथेनॉल, और 6.9 मिलीलीटर दोगुना डिस्टिल्ड पानी जोड़ें.
  3. 500 μl स्लाइड तैयारी समाधान के साथ स्लाइड के प्रत्येक कक्ष भरें.
  4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  5. चैम्बर महाप्राणहै, उन्हें पूरी तरह से सुखाने.
  6. डिग्री सेल्सियस तक पूरी तरह से सूखा 45 पर 1 घंटे के लिए खुला स्लाइड्स सेते हैं.
  7. दोहरा आसुत जल में 0.1% पाली एल lysine (सिग्मा Aldrich) गिराए 0.01% पाली एल lysine समाधान तैयार है.
  8. प्रत्येक कक्ष के लिए 500 μl लागू करें.
  9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं.
  10. उन्हें पूरी तरह से सूखने, कक्षों महाप्राण.
  11. डिग्री सेल्सियस तक पूरी तरह से सूखा 45 पर 3 घंटे के लिए सेते हैं.
  12. लेपित स्लाइड कमरे के तापमान पर कई महीनों के लिए शुष्क संग्रहित किया जा सकता है.
  13. एक सक्रिय एंटीबॉडी समाधान तैयार है. HIT3a (बी.डी. Pharmingen, # 555337) या UCHT1 (बी.डी. Pharmingen, # 555330), चैम्बर प्रति 400 μl पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर या तो: एक विरोधी CD3 एंटीबॉडी का प्रयोग करें. यह समाधान शीघ्र ही स्लाइड तैयार करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए.
  14. सक्रिय एंटीबॉडी समाधान के 400 μl के साथ प्रत्येक कक्ष भरें.
  15. 4 में रात भर, अधिमानतः 37 डिग्री सेल्सियस या, कम 2 घंटे के लिए स्लाइड सेते डिग्री सेल्सियस
  16. सक्रिय एंटीबॉडी प निकालेंution और तुरंत 300 μl पीबीएस के साथ दो बार चैम्बर धो लो. इस बिंदु से, कक्षों बफर से भरा रहना सुनिश्चित करें.
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस भरा स्लाइड स्टोर हम 1 सप्ताह के भीतर तैयार स्लाइड कक्षों का उपयोग कर सुझाव देते हैं.

3. टी सेल सक्रियण और इमेजिंग

  1. [1.25 मिलीलीटर HEPES (1 मी), 10 मिलीलीटर एफसीएस, 38.75 मिलीलीटर RPMI फिनोल लाल बिना] इमेजिंग बफर तैयार. इमेजिंग बफर 4 डिग्री सेल्सियस के बाद निस्पंदन में संग्रहित किया जा सकता है.
  2. Zeiss LSM 510 मेटा माइक्रोस्कोप सक्रिय करें. 37 के लिए माइक्रोस्कोप heatable बढ़ते फ्रेम गर्म डिग्री सेल्सियस "विशेषज्ञ मोड" का चयन करें.
  3. "मोल" टैब पर क्लिक करें और निम्न टैब खुला: लेजर, माइक्रोस्कोपी, विन्यास, स्कैन, समय श्रृंखला.
  4. जरूरत लेज़रों सक्रिय करें. MCFP और mYFP, उत्तेजना के लिए फिर "पर" के लिए 5 मिनट के लिए "स्टैंडबाय" को आर्गन / 2 लेजर, सेट.
  5. आप एक ही fluorophores का उपयोग कर, इस से पहले जीना सेल इमेजिंग परख प्रदर्शन किया है, जिसके परिणामस्वरूप एल एस एम फ़ाइल खोलने, मैं "पुन: उपयोग" क्लिक करेंचोर, और चरण 9 से जारी है. अन्यथा चरण 6 से जारी है.
  6. इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट प्रोटीन की उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर चैनलों को परिभाषित करें.
  7. "स्कैन नियंत्रण" खिड़की में, जेड ढेर विकल्प का चयन करें.
  8. 0.5 माइक्रोन, वर्तमान टुकड़ा: 3;: स्लाइस की संख्या: अंतराल 5 निम्नलिखित स्कैन मापदंडों दर्ज करें.
  9. माइक्रोस्कोप के पास 37 पर एक Accublock डिजिटल सूखी स्नान (Labnet) डिग्री सेल्सियस की तैयारी.
  10. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इमेजिंग बफर गर्म
  11. गर्म इमेजिंग बफर के 600 μl के साथ की जगह, पीबीएस aspirating द्वारा संग्रहीत स्लाइड तैयार.
  12. 37 में स्लाइड सेते डिग्री सेल्सियस चरण 13 तक, कम से कम 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में स्लाइड रखें.
  13. 5 लीजिए × 10 5 ट्रांसफ़ेक्ट टी कोशिकाओं.
  14. 400 × जी पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  15. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  16. 1 मिलीलीटर गर्म इमेजिंग बफर में Resuspend कोशिकाओं, और एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण.
  17. टी रखेंAccublock डिजिटल सूखी स्नान पर ब्याज ट्यूब.
  18. इनक्यूबेटर से गर्म स्लाइड ले लो, और गर्म खुर्दबीन बढ़ते फ्रेम पर माउंट.
  19. "विज़" आइकन पर क्लिक करें.
  20. सेल निलंबन मिक्स और 1-2 μl हटा दें.
  21. स्लाइड के नीचे से ऊपर इमेजिंग बफर में पिपेट की नोक डालें. स्लाइड scratching से बचें.
  22. उद्देश्य के एपर्चर से अधिक बीज कोशिकाओं.
  23. वे उतरना के रूप में तुरंत नेत्रहीन फ्लोरोसेंट कोशिकाओं ट्रैकिंग शुरू करते हैं. दोनों चैनलों में उच्च प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है कि एक कक्ष का चयन करें.
  24. सेल स्लाइड की सतह तक पहुंचने से पहले, एल एस एम मोड सक्रिय करें.
  25. केवल एक उत्तेजना लेजर टॉगल. आप एक डीआईसी चैनल है जिसके लिए एक लेजर का चयन करें.
  26. 1 से ज़ूम सेट करें. "फास्ट xy" आइकन पर क्लिक करें. "बंद करो" आइकन पर क्लिक करें. फसल उपकरण का उपयोग, सेल पर केंद्रित एक रॉय का चयन करें.
  27. 3 से ज़ूम सेट करें. "फास्ट xy" आइकन पर क्लिक करें, फिर स्वयं बेहतर सेल देखने के लिए ध्यान केंद्रित किया. "बंद करो" ico क्लिक करेंएन.
  28. सभी आवश्यक उत्तेजना लेज़रों टॉगल.
  29. "StartT" आइकन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू करो. छवि फैल प्रक्रिया (आमतौर पर 5 मिनट) की सम्पूर्णता के लिए सेल. जब समाप्त हो, "बंद करो" आइकन पर क्लिक करें.
  30. फ़ाइल सहेजें.
  31. अतिरिक्त कक्षों का अधिग्रहण करने के लिए, "विज़" आइकन पर क्लिक करें. अभी तक स्लाइड के नीचे के साथ संपर्क में नहीं आया था कि कोशिकाओं रहे हैं, तो चरण 23 से जारी है. पहले से ही फैल प्रक्रिया शुरू कर दिया है कि इमेजिंग कोशिकाओं से बचें. अन्यथा 32 कदम आगे बढ़ना.
  32. मनाया स्लाइड क्षेत्र कोशिकाओं के ज्यादातर रहित है, तो कोशिकाओं (चरण 20 से जारी) की एक और विभाज्य जोड़ें. अन्यथा 33 कदम आगे बढ़ना.
  33. अतिरिक्त कक्षों का अधिग्रहण करने के लिए, उद्देश्य के एपर्चर ऊपर क्षेत्र कोशिकाओं से रहित है ताकि स्लाइड चाल.
  34. कोशिकाओं (और चरण 20 से जारी) की एक और विभाज्य जोड़ें.
  35. सभी वांछित इमेजिंग प्रदर्शन करने के बाद, एक को बचाया एल एस एम फ़ाइल खोलने.
  36. "गैलरी", "समय + Z" और "सबसेट" पर क्लिक करें.
  37. प्रासंगिक चुनेटी समय सीमा और जेड ढेर.
  38. नई फ़ाइल सहेजें.
  39. सभी इमेजिंग फ़ाइलों के लिए कदम 35-38 प्रदर्शन करना.

4. इमेजिंग डेटा विश्लेषण

  1. Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane एजी, ज्यूरिख स्विट्जरलैंड) का उपयोग एल एस एम फ़ाइलें खोलें.
  2. "पार" पर क्लिक करें. "छवि प्रसंस्करण" मेनू क्लिक करें, और "समय और जेड स्वैप" का चयन करें. इस छवि का सही फसल में मदद करेंगे.
  3. "संपादित करें" उपकरण पट्टी क्लिक करें और ड्रॉप मेनू में "फसल 3 डी" विकल्प चुनें. सेल के आसपास के ही क्षेत्र में शामिल करने के लिए छवि फसल. हम सेल पर केंद्रित एक 300 × 300 पिक्सेल वर्ग फसल का सुझाव है. सेल के आकार और स्थान में समय के साथ बदल सकते हैं नोट. टी अक्ष अवलोकन, सेल सभी समय बिंदुओं पर फसली क्षेत्र के भीतर है कि सुनिश्चित करें.
  4. "छवि प्रसंस्करण" मेनू क्लिक करें, और छवि का मूल अस्थायी जुदाई बहाल करने के लिए "समय और जेड स्वैप" का चयन करें.
  5. मुख्य उपकरण पट्टी पर "Coloc" बटन दबाएं. "डी टाइम गठन का चयन करेंपी. Coloc ". Imaris स्वचालित रूप से हर समय बिंदु पर प्रत्येक चैनल के लिए तीव्रता थ्रेसहोल्ड की गणना करेगा.
  6. "चैनल सांख्यिकी" का चयन करके colocalization विश्लेषण के परिणामों को देखें. "निर्यात" पर क्लिक करके डेटा निर्यात करें.
  7. प्रत्येक छवि सेल के लिए 6 से चरण 1 दोहराएँ. हम कम से कम 50 कोशिकाओं को इस तरह से विश्लेषण किया जा सलाह देते हैं.
  8. मतलब पियर्सन की colocalization गुणांक और अपने मानक त्रुटि या विचलन की गणना.

Representative Results

हम रहते हैं टी सेल इमेजिंग और विश्लेषण का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं. इमेजिंग प्रयोग करने से पहले, SLP76 कमी टी कोशिकाओं (J14) फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 1) की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए FACS के उपयोग के साथ विश्लेषण किया गया. टैग किए गए संकेत प्रोटीन mCFP-NCK और SLP76-mYFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट टी कोशिकाओं को सक्रिय स्लाइड से अधिक जमा और टी सेल प्रसार (चित्रा 2) के दौरान imaged थे. एकत्र छवियों सक्रियण और (चित्रा 3) के प्रसार के दौरान प्रोटीन स्थानीयकरण की गतिशीलता दिखा. मानव पूर्वाग्रह जबकि कम से कम कम्प्यूटरीकृत इमेज प्रोसेसिंग, नई अंतर्दृष्टि और कल्पना की कोशिकाओं से मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है. सेलुलर सक्रियण प्रक्रिया के दौरान दो प्रोटीन की colocalization की जांच करने के लिए, हम Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane एजी, ज्यूरिख स्विट्जरलैंड) की colocalization उपकरण का उपयोग किया. छवि कोशिकाओं भर में अलग अलग समय बिंदुओं के बीच colocalization गुणांक की तुलना करके, हम थे NCK और SLP76 की colocalization टी सेल सक्रियण (पी> 0.3) (चित्रा 4) के दौरान काफी बदलाव नहीं होता है कि पता लगाने में सक्षम.

चित्रा 1
चित्रा 1. (बी) mYFP;. कोशिकाओं के FACS विश्लेषण डबल डाटा (ए) mCFP लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता हिस्टोग्राम के रूप में दिखाया जाता है fluorescently लेबल प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और (सी) एक डॉट साजिश के रूप में. MCFP-NCK और SLP76-mYFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट J14 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता क्रमश: सियान और पीले रंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. Untransfected J14 नकारात्मक नियंत्रण कक्षों काले लाइनों के संकेत हैं.

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चित्रा 2. जीने का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व टी सेल परख प्रसार (ए) के टी सेल को सक्रिय स्लाइड्स की तैयारी;. (बी) के टी सेल प्रसार परख और विश्लेषण रहते हैं;. (सी) माइक्रोस्कोपी सेटअप बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. MCFP-NCK और SLP76-mYFP व्यक्त टी सेल सक्रियण प्रक्रिया के दौरान NCK और SLP76 का वितरण. सेल विरोधी CD3 उत्तेजक एंटीबॉडी पूर्व लेपित coverslips पर गिरा दिया और लगातार 7 मिनट की अवधि के लिए imaged थे. SLP76-mYFP पीले रंग में दिखाया गया है, जबकि mCFP-NCK, सियान का प्रतिनिधित्व करती है.


4 चित्रा. प्रोटीन colocalization के मात्रात्मक विश्लेषण. कोशिकाओं की छवि प्रसंस्करण Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane एजी, ज्यूरिख स्विट्जरलैंड) का उपयोग किया गया था. Colocalization mCFP चैनल की तीव्रता और प्रत्येक पिक्सेल के लिए mYFP चैनल के बीच पियर्सन की सहसंबंध गुणांक के रूप में गणना की है. अलग अलग समय बिंदुओं से गणना पियर्सन की colocalization गुणांक तुलना कर रहे हैं. तीस सेकंड के सक्रियण प्रक्रिया में, mCFP-NCK और SLP76-mYFP की colocalization गुणांक (पी <0.05) काफी बढ़ गया था. इन परिणामों> 50 स्वतंत्र कोशिकाओं का विश्लेषण करके गणना की गई. मतलब ± मानक त्रुटि दिखाई जाती हैं.

Discussion

कई सेलुलर प्रक्रियाओं का विनियमन और समारोह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के गठन और समाप्ति पर निर्भर करते हैं. सूक्ष्म इमेजिंग जीवित कोशिकाओं में fluorescently टैग प्रोटीन की वास्तविक समय पर नज़र रखने की अनुमति देता है. टैग प्रोटीन की colocalization प्रोटीन के बीच एक प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत का सुझाव कर सकते हैं, और इस तरह के immunoprecipitation के रूप में जैव रासायनिक विधियों, के द्वारा प्राप्त निष्कर्षों को सुदृढ़ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जैव रासायनिक विधियों के विपरीत, जीना सेल इमेजिंग इन परस्पर बातचीत प्रोटीन वे होते हैं के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं की निगरानी की सुविधा और प्रोटीन के सेलुलर वितरण का पता लगाने, स्थानिक और समय के साथ मनाया जा सकता है. Colocalization की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विभिन्न उपकरण विकसित किया गया है, पियर्सन की सहसंबंध गुणांक दो प्रोटीन 12 के बीच colocalization की डिग्री की मात्रा का ठहराव के लिए एक बहुत ही आकर्षक और व्यापक रूप से उपलब्ध विधि बनी हुई है. जबकि प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ईnergy हस्तांतरण (झल्लाहट) प्रयोगों करीब निकटता (10 एनएम) की विशेषता अंतर - प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में सक्षम है, इस विधि विशेष सेटिंग्स (प्रयुक्त फ्लोरोसेंट taggings के उपकरण और संगतता) और जटिल डाटा प्रोसेसिंग की आवश्यकता है. अधिकांश का उपयोग करता है, colocalization विश्लेषण के लिए, जैव रासायनिक विधियों के साथ संयोजन में, एक उपयोग में आसान करने के लिए गठन किया है और समय के साथ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अवलोकन के लिए सरल तरीका.

या तो चैनल के लिए तीव्रता सीमा से नीचे पिक्सल की अनदेखी कर रही है, जबकि, विश्लेषण पिक्सल के लिए एक प्रतिदीप्ति तीव्रता दहलीज स्थापना सटीक और संवेदनशील colocalization विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. इन सीमाओं के उद्देश्य और स्वचालित निर्धारण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म 13. Costes एट अल द्वारा विकसित किया गया था और इस तरह के Imaris और Volocity रूप इमेज प्रोसेसिंग कार्यक्रमों के द्वारा कार्यान्वित किया जाता है.

यहाँ, हम रहते हैं टी सेल imag के उपयोग के प्रदर्शनSLP76 की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए आईएनजी विधि, एक प्रमुख टी कोशिकाओं में पाड़, और NCK, एक एडाप्टर प्रोटीन, जो दोनों के टी सेल सक्रियण 14,15 के लिए आवश्यक हैं. सक्रियण के दौरान एकत्र की टी कोशिकाओं की छवियाँ दो प्रोटीन (चित्रा 3) सेलुलर सक्रियण प्रक्रिया के दौरान colocalized रहे हैं कि सुझाव. इस मात्रात्मक सक्रियण प्रक्रिया के दौरान एकत्र की छवियों पर पियर्सन की colocalization परीक्षण प्रदर्शन से मंडित है. -1 से -1 के स्कोर विरोधी सहसंबंध का मतलब है जहां 1, पियर्सन की colocalization गुणांक रेंज, 1 के स्कोर सही colocalization और 0 का मतलब दो छवि चैनलों के बीच कोई संबंध का प्रतीक है. अलग अलग समय बिंदुओं के लिए और विभिन्न कोशिकाओं के लिए गणना पियर्सन की colocalization गुणांक की तुलना NCK और SLP76 की कि colocalization काफी सेलुलर सक्रियण के दौरान परिवर्तन नहीं करता है इंगित करता है, लेकिन (पी> 0.3, चित्रा 4) लगातार बना रहता है. जबकि समग्र colocalization सहइन प्रोटीनों की कुशल सक्रियण प्रक्रिया के दौरान कोई बदलाव नहीं होता, यह संघ और इन प्रोटीनों 18 के बीच होने वाली विसंघटन के एक गतिशील प्रक्रिया की संभावना को खत्म नहीं करता है.

हम प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी आवश्यकता के रूप में सेल के विकास की स्थिति का समायोजन के सवाल में सेल लाइन के लिए उपयुक्त एक अभिकर्मक सेटिंग का चयन और यदि लागू हो, सेलुलर सक्रियण प्रक्रिया को संशोधित करके अन्य hematopoietic सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम उचित समायोजन और सेटिंग्स के उपयोग के साथ, एल एस एम 510 मेटा confocal खुर्दबीन का उपयोग किया है, जबकि अन्य confocal माइक्रोस्कोपी सिस्टम सफलतापूर्वक अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कृपया ध्यान दें.

जीना टी सेल इमेजिंग के उपयोग के जैव रासायनिक और आणविक विधियों का उपयोग कर अस्थायी और स्थानिक संकल्प अनुपलब्ध साथ पता लगाया जाएगा संकेत घटनाओं को सक्षम करने, विनियामक और सक्रियण प्रक्रियाओं सीधे नजर रखी जा करने की अनुमति देता है. हम एक सरल मेथ पेश, एक जीवित टी सेल प्रसार परख बाहर ले जाने के लिए वास्तविक समय में प्रासंगिक प्रोटीन की निगरानी और मात्रात्मक परिणाम के लिए डेटा का विश्लेषण करने के लिए ओवर ड्राफ्ट. परिणामस्वरूप माइक्रोस्कोपी डेटा भी इस तरह के सेल आकार सूचकांक विश्लेषण के रूप में अन्य बहाव के अनुप्रयोगों, 16 के लिए इस्तेमाल किया और विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप और अनुसंधान उद्देश्यों पर निर्भर करता है, विश्लेषण 17,18 झल्लाहट किया जा सकता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी सहायता के लिए सोफिया फ्राइड धन्यवाद. अनुदान no.1659/08, 971/08, 1503-1508 और 491/10, कोई अनुदान के लिए स्वास्थ्य एवं विज्ञान के मंत्रालयों के लिए इसराइल विज्ञान फाउंडेशन: एमबीएस उनके शोध के समर्थन के लिए निम्नलिखित एजेंसियों धन्यवाद. 3-4114 और 3-6540, देर अलेक्जेंडर Smidoda के एस्टेट के माध्यम से इसराइल कैंसर एसोसिएशन, और जैव चिकित्सा उत्कृष्टता अनुदान के लिए Taubenblatt परिवार फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

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References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

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