Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Vi beskriver en live-cell imaging metode, der giver indsigt i protein dynamik under T-celleaktivering proces. Vi viser den kombinerede anvendelse af T-celle-spredning assay konfokal mikroskopi og billedbehandling analyse at give kvantitative resultater til følge signaleringskomplekser dannelse hele T-celle aktivering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beskyttelse mod smitsomme sygdomme medieres af immunsystemet 1,2. T-lymfocytter er master koordinatorer af immunsystemet, regulere aktiveringen og reaktioner af multiple immunceller 3,4. T-celle-aktivering er afhængig af anerkendelse af specifikke antigener vises af antigenpræsenterende celler (APC'er). T-celle antigen (TCR) er specifik for hver T-celleklon og bestemmer antigenspecificitet 5.. Bindingen af ​​TCR til antigenet inducerer phosphorylering af komponenter af TCR-komplekset. For at fremme T-celleaktivering, skal dette signal transduceret fra membranen til cytoplasmaet og kernen, indlede forskellige afgørende reaktioner såsom rekruttering af signalering proteiner til TCR, APC stedet (immun synapse), deres molekylære aktivering, cytoskelet omlejring, forhøjelse af intracellulær calciumkoncentration, og ændringer i genekspression 6,7. Den korrekte iitiation og opsigelse af aktiverende signaler er afgørende for passende T-celle responser. Aktiviteten af signalanlæg proteiner er afhængig af dannelsen og afslutning af protein-protein interaktioner, posttranslationelle modifikationer, såsom proteinphosphorylering, dannelse af protein-komplekser, protein ubiquitylering og rekruttering af proteiner til forskellige cellulære steder 8. Forståelse af de indre funktioner i T-celle aktivering processen er afgørende for både immunologiske forskning og kliniske anvendelser.

Forskellige assays er blevet udviklet med henblik på at undersøge protein-protein interaktioner, men gør biokemiske assays, såsom udbredte co-immunpræcipitering metoden, ikke tillade protein sted at være skelnes, hvilket udelukker observation af værdifuld indsigt i dynamikken af ​​cellulær mekanismer. Derudover disse bulk-assays sædvanligvis kombinere proteiner fra mange forskellige celler, der kan være på forskellige stadier af than undersøgte cellulære proces. Dette kan have en skadelig virkning på tidsmæssig opløsning. Brugen af real-time scanning af levende celler tillader både den rumlige sporing af proteiner og evnen til timeligt skelne mellem signalanlæg begivenheder, og dermed kaste lys over dynamikken i processen 9,10. Vi præsenterer en fremgangsmåde til tidstro billeddannelse af signalering-kompleks formation under T-celleaktivering. Primære T-celler eller T-cellelinjer, såsom Jurkat, transficeres med plasmider, der koder for proteiner af interesse fusioneret til monomere fluorescerende proteiner, hindrer ikke-fysiologisk oligomerisering 11. Levende T-celler kastet over et dækglas præcoatet med T-celle-aktiverende antistof 8,9, som binder til CD3/TCR-komplekset, inducere T-celle-aktivering, mens overvinde behovet for specifikke aktiverende antigener. Aktiverede celler er konstant afbildet med anvendelse af konfokal mikroskopi. Imaging data analyseres for at give kvantitative resultater, såsom colocalization koefficient for de signalproteiner.

Protocol

1.. T-celle-transfektion

  1. Forbered aktiverede Amaxa Nucleofector løsning ved at blande kit er "tillæg" løsning på Nucleofector Solution. Den aktiverede opløsning kan opbevares ved 4 ° C i op til tre måneder.
  2. Grow Jurkat T-celler i dyrkningsmedium [10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin-opløsning og 2 mM L-glutamin i RPMI]. Optimalt bør celler bruges 1-2 uger efter optøning. Brug cellekulturer i logaritmisk vækst er afgørende for høj transfektion effektivitet og celle overlevelse. Alternativt, med mindre modifikationer, kan denne protokol anvendes med primære T-celler, som tidligere beskrevet 8.. Det skal understreges, at da varigheden af aktiveringen af primære T-celler er længere end Jurkat T-celler (~ 30 min), et mikroskop stadium monteret inkubation systemet skal anvendes til at opretholde CO 2, luftfugtighed og temperatur i hele aktiveringsprocessen.
  3. Saml 5× 10 6 log-fase T-celler pr transfektion i en 15-ml rør.
  4. Centrifuger cellerne i 7 minutter ved 400 x g ved stuetemperatur.
  5. Under centrifugering, forberede en 6-brønds plade. Fyld en brønd for hver transfektion med 5 ml dyrkningsmedium, og præ-inkuberes ved 37 ° C.
  6. Saml rørene fra centrifugen og supernatanten. Resuspender cellepelleten i 1 ml RPMI.
  7. Centrifuger cellerne i 7 minutter ved 400 x g ved stuetemperatur.
  8. Under centrifugering, forberede transfektion løsning. I en brønd i en plade med 96 brønde, bland aktiveret 100 pi Amaxa Nucleofector opløsning fremstillet i trin 1 med 5 ug DNA af plasmidet af interesse koder for et fluorescerende mærket protein. Optimalt bør DNA-koncentration være større end 1 ug / ml for at undgå fortynding af transfektion løsning.
  9. Bland godt ved forsigtig pipettering.
  10. Efter centrifugering af cellerne, omhyggeligt fjerne al supernatanten mens ikke disturbing pelleten.
  11. Pipette DNA / transfektion opløsning to gange.
  12. Tilsæt DNA / transfektion løsning til pelleten.
  13. Overfør celler til Amaxa kuvetten.
  14. Isæt kuvetten ind i Amaxa Nucleofector enhed.
  15. Bruge H-10 Amaxa transfektion indstilling til elektroporation (til Jurkat) eller T-23 (til primære T-celler).
  16. Fjern 6-brønds plade fra inkubatoren.
  17. Efter elektroporation, overføre omhyggeligt supernatanten med cellesuspensionen til 6-brønds plade under anvendelse af en Pasteur-pipette. En pellet bestående af cellerester kan danne. Undgå at overføre bundfaldet.
  18. Inkubér cellerne i 24 timer ved 37 ° C.
  19. Overfør 2,5 ml cellesuspension fra hver brønd i en ny brønd. Tilsæt 2,5 ml varm dyrkningsmedium (beskrevet i trin 2) til hver brønd.
  20. Efter 72 timer, overføres cellerne til et sterilt rør og centrifugeres i 7 minutter ved 400 x g ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og erstatte det with dyrkningsmedium suppleret med pattedyrcelle udvælgelse antibiotikum passende for det anvendte plasmid (anvende en koncentration egnet til de anvendte antibiotika, vi brugte G418 og / eller hygromycin i koncentrationer på 1,3 mg / ml og / eller 0,2 mg / ml). Kultur cellesuspensionen i en frisk godt. Alternativt kan celler transficeres forbigående og afbildes 48 timer efter transfektion. For at forberede forbigående transficerede celler, co-transfektion af cellerne med de to plasmider samtidigt på trin 8 og fortsætter normalt til trin 20, og derefter gå direkte til trin 23.. Bemærk, at i henhold til dette scenario, skal cellerne anvendes straks, og generelt deres fluorescensintensitet er uensartet og ikke nødvendigvis højt.
  21. Grow celler med dyrkningsmedium suppleret med passende udvælgelse antibiotikum. Split cellerne og supplere dem med antibiotika-suppleret dyrkningsmedium efter behov.
  22. Efter 2 uger, kontrollere vellykket transfektion med anvendelse af FACS (influenzaorescence cellesortering) som følger:
  23. Indsamle 10 6 transficerede celler, 10 6 mock-transficerede celler (negativ kontrol), og 10 6 celler, der er kendt for at stabilt udtrykke fluorescerende mærkede protein. Hvis celler transficeret med mere end én fluorescerende protein (se trin 27), bruge flere, enkeltvis mærkede cellelinier som positive kontroller.
  24. Centrifuger cellerne i 7 minutter ved 400 x g ved stuetemperatur.
  25. Supernatanten. Resuspender celler i 500 pi FACS buffer (PBS w / o Ca2 + og Mg2 +, 5% FCS, 0,05% natriumazid).
  26. Brug en analytisk FACS at kontrollere cellulær fluorescens. Sammenlign fluorescens af de transficerede celler til at af de negative og positive kontroller.
  27. At transficere cellerne med en ekstra, fluorescens mærkede protein, skal du gentage trin 3-26 ved hjælp af de transfekterede celler.
  28. Celler, som viser høje niveauer af fluorescens bør anvendes. Optimalt mindst 50% afcellerne i kulturen skal være meget fluorescerende. Cell fluorescens kan øges ved cellesortering via FACS.

Eventuelle yderligere mærkede proteiner skal fusioneres til forskellige fluoroforer og kodes på plasmider, der koder for forskellige valg antibiotika. Selektionsmedium for celler transficeret med mere end én plasmid bør suppleres med alle de passende antibiotika.

2.. T-celle Spredning Assay Forberedelse

  1. Brug Lab-Tek II German dækglasfundament systemet 4 kammer dias. Sørg for ikke at uheld ridse den indvendige overflade af kamrene, fx med en pipettespids under tilberedning eller brug.
  2. Forbered 50 ml præparatglaspræpareringsprotokol opløsning: Tag 4,6 ml af 12 M (37%) HCI, tilsættes 38,5 ml 100% ethanol og 6,9 ml dobbeltdestilleret vand.
  3. Fyld hvert kammer i slæden med 500 ul præparatglaspræpareringsprotokol løsning.
  4. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  5. Aspirer kammerets, tørre dem helt.
  6. Inkuber de udækkede dias til 1 time ved 45 ° C indtil fuldstændig tør.
  7. Forbered 0,01% poly-L-lysin ved at fortynde 0,1% poly-L-lysin (Sigma-Aldrich) i dobbelt destilleret vand.
  8. Påfør 500 pi til hvert kammer.
  9. Inkubér objektglasset i 15 minutter ved stuetemperatur.
  10. Aspirere kamrene, tørre dem helt.
  11. Inkuber i 3 timer ved 45 ° C indtil fuldstændig tør.
  12. Coatede objektglas kan opbevares tørt i flere måneder ved stuetemperatur.
  13. Forbered en aktiverende antistof løsning. Brug et anti-CD3 antistof: enten HIT3a (BD Pharmingen, # 555.337), eller UCHT1 (BD Pharmingen, # 555.330), 10 ug / ml i 400 pi PBS, per kammer. Denne løsning bør være forberedt kort før præparatet.
  14. Fyld hvert kammer med 400 ul af aktiverende antistof løsning.
  15. Inkubér objektglasset i 2 timer ved 37 ° C eller fortrinsvis natten over ved 4 ° C.
  16. Fjern aktiverende antistof solution og vaske kammeret to gange med 300 pi PBS. Fra dette punkt, skal du sørge kamrene forbliver fyldt med buffer.
  17. Opbevar PBS fyldt slide ved 4 ° C. Vi foreslår at bruge den forberedte dias kamre inden for 1 uge.

3.. T-celle aktivering og Imaging

  1. Forbered imaging puffer [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml FCS, 38,75 ml RPMI uden phenolrødt]. Imaging buffer kan opbevares ved 4 ° C efter filtrering.
  2. Aktiver Zeiss LSM 510 Meta mikroskop. Varm mikroskopet opvarmes monteringsramme til 37 ° C. Vælg "Expert mode".
  3. Klik på "Acquire" fanen og åbne følgende faner: Lasere, Mikroskopi, konfiguration scanning, tidsserier.
  4. Aktiver de nødvendige lasere. For excitation af mCFP og mYFP, indstilles Argon / 2 laser til "standby" i 5 min, derefter til "on".
  5. Hvis du har udført denne live-cell imaging assay før, bruger de samme fluoroforer åbne den resulterende LSM-filen, klik på "genbrug" icon, og fortsætte fra trin 9. Ellers fortsætte fra trin 6..
  6. Definer kanaler ved hjælp filtre egnede til excitation og emission af de fluorescerende anvendte proteiner.
  7. I "Scan kontrol" vinduet, skal du vælge Z stakken mulighed.
  8. Indtast følgende indlæsningsparametre: Antal skiver: 5; Interval: 0,5 m; Current skive: 3..
  9. Forbered en Accublock Digital Dry Bad (LabNet) ved 37 ° C i nærheden af mikroskopet.
  10. Varm billeddannelse puffer til 37 ° C.
  11. Forbered lagrede slide ved at aspirere PBS og erstatte den med 600 ul varm imaging buffer.
  12. Inkuber slæden ved 37 ° C. Hold slide i inkubatoren før trin 13, for mindst 15 min.
  13. Saml 5 × 10 5 transficerede T-celler.
  14. Centrifuger celler for 2 minutter ved 400 x g.
  15. Supernatanten.
  16. Resuspender cellerne i 1 ml varm imaging buffer, og overføre dem til en 1,5-ml Eppendorf rør.
  17. Placer test rør på Accublock Digital Dry Bath.
  18. Tag varmede dias fra rugemaskinen, og montere den på varmede mikroskop monteringsramme.
  19. Klik på "VIS"-ikonet.
  20. Bland cellesuspensionen og fjerne 1-2 pi.
  21. Sæt spidsen af ​​pipetten ind i imaging buffer over bunden af ​​diaset. Undgå at ridse diaset.
  22. Frø cellerne over objektivets blænde.
  23. Straks begynder visuelt spore de fluorescerende celler som de ned. Marker en celle, der viser høj fluorescens i begge kanaler.
  24. Før cellen når overfladen af ​​objektglasset, aktivere LSM tilstand.
  25. Slå kun én excitation laser. Vælg en laser, som du har en DIC-kanal.
  26. Indstil Zoom til 1.. Klik på "Fast XY" ikonet. Klik på "Stop"-ikonet. Ved hjælp af værktøjet Beskæring, et ROI centreret om cellen vælger.
  27. Indstil zoom til 3.. Klik på "Fast XY" ikonet, derefter manuelt indstille fokus optimalt se cellen. Klik på "Stop" icon.
  28. Slå alle de nødvendige excitation lasere.
  29. Begynd optagelsen ved at klikke på "StartT" ikonet. Billede cellen for hele spreading proces (almindeligvis 5 min). Når du er færdig, klik på "Stop" ikonet.
  30. Gem filen.
  31. At erhverve yderligere celler, skal du klikke på "VIS"-ikonet. Hvis der er celler, der endnu ikke kommer i kontakt med slæden bund, fortsætte fra trin 23. Undgå billeddannelse celler, der allerede er indledt spredning processen. Ellers fortsæt til trin 32..
  32. Hvis den observerede diasområdet er for det meste blottet for celler, tilføje en anden portion af celler (fortsætte fra trin 20). Ellers fortsæt til trin 33..
  33. At erhverve yderligere celler flytte dias, så området over objektivets blænde er blottet for cellerne.
  34. Tilføj endnu portion af celler (og fortsætte fra trin 20).
  35. Efter at have udført alle de ønskede billedbehandling, åbne en gemt LSM-fil.
  36. Klik på "Galleri", "Time + Z" og "Subset".
  37. Vælg relevant tidsområde og Z stakken.
  38. Gem den nye fil.
  39. Udfør trin 35-38 for alle de billeddannende filer.

4.. Imaging Data Analysis

  1. Åbn LSM filer ved hjælp Imaris software (Bitplane AG, Zürich Schweiz).
  2. Klik på "overgå". Klik på "Image Processing" menuen, og vælg "Swap Time og Z". Dette vil hjælpe i den rigtige beskæring af billedet.
  3. Klik på "Rediger" værktøjslinjen og vælg "Crop 3D" i drop-menuen. Beskære billedet til kun at omfatte området omkring cellen. Vi foreslår beskæring en 300 x 300 pixel kvadrat centreret på cellen. Bemærk, at formen og placeringen af ​​cellen kan ændre sig over tid. Observere t-aksen, sørg for, at cellen er inden for det beskårne område på alle tidspunkter.
  4. Klik på "Image Processing" menuen, og vælg "Swap Time og Z" for at genoprette den oprindelige tidsmæssig adskillelse af billedet.
  5. Tryk på "Coloc" knappen på de vigtigste værktøjslinjen. Vælg "Build Time Des.. Coloc ". Imaris vil automatisk beregne intensitetsværdier tærskler for hver kanal på hvert tidspunkt.
  6. Se resultatet af colokalisering analyse ved at vælge "Channel Statistics". Eksportere data ved at klikke på "Eksporter".
  7. Gentag trin 1 til 6 for hver afbildet celle. Vi anbefaler, at mindst 50 celler analyseres på denne måde.
  8. Beregn den gennemsnitlige Pearsons colokalisering koefficient og dens standard error eller afvigelse.

Representative Results

Vi præsenterer et eksempel på levende T-celle billeddannelse og analyse. Forud for billeddannelse eksperiment blev SLP76 deficiente T-celler (J14) analyseret med anvendelse af FACS for at bestemme ekspression af de fluorescerende proteiner (figur 1). T-celler transficeret med de mærkede signalproteiner mCFP-Nck og SLP76-mYFP blev aflejret over aktiverende dias og afbildes i T-celle-spredning (figur 2). Indsamlede billeder viser dynamikken af protein lokalisering hele aktivering og spredning (figur 3). Edb billedbehandling giver nye indsigter og kvantitative oplysninger fra visualiserede celler, og samtidig minimere menneskelig bias. At undersøge colokalisering af de to proteiner hele cellulær aktivering proces, vi udnyttet colokalisering redskab for Imaris software (Bitplane AG, Zurich Schweiz). Ved at sammenligne colokalisering koefficienter mellem forskellige tidspunkter på tværs filmede celler, vi var i stand til at fastslå, at colokalisering af Nck og SLP76 ikke ændres væsentligt i hele T-celle aktivering (p> 0,3) (Figur 4).

Figur 1
Figur 1. FACS-analyse af celler dobbelt transficeret med fluorescens-mærkede proteiner Data vises som fluorescensintensitets histogrammer for (A) mCFP,. (B) mYFP og (C) som et punktdiagram. Fluorescensintensitet af J14-celler transficeret med mCFP-Nck og SLP76-mYFP er repræsenteret i cyan og gul, hhv. Utransficerede J14 negative kontrolceller er angivet med sorte linier.

/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Figur 2. En skematisk fremstilling af levende T-celle spredning assay (A) Fremstillingen af T-celleaktiverende lysbilleder,. (B) levende T-celle spredning assay og analyse. (C) mikroskopi setup Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Fordeling af Nck og SLP76 under T-celle aktivering proces. Celler, der udtrykker mCFP-Nck og SLP76-mYFP blev droppet i løbet af anti-CD3 stimulerende antistof præcoatede dækglas og konstant filmede i en periode på 7 min. mCFP-Nck er repræsenteret af cyan, mens SLP76-mYFP er vist med gult.


Figur 4.. Kvantitativ analyse af protein colokalisering. Billede behandling af celler blev udført ved anvendelse af Imaris software (Bitplane AG, Zurich Schweiz). Colokalisering beregnes som Pearsons korrelationskoefficient mellem intensiteterne af mCFP kanalen og mYFP kanal for hver pixel. Pearsons colokalisering koefficienter beregnet ud fra forskellige tidspunkter sammenlignes. Tredive sekunder inde i aktiveringsprocessen, blev colokalisering koefficient på mCFP-Nck og SLP76-mYFP steget betydeligt (p <0,05). Disse resultater blev beregnet ved at analysere> 50 uafhængige celler. Gennemsnit ± standardafvigelse er vist.

Discussion

Regulering og funktion af flere cellulære processer afhænger af dannelse og opsigelse af protein-protein interaktioner. Mikroskopisk billedbehandling giver real-time sporing af fluorescens mærkede proteiner i levende celler. Colokalisering af mærkede proteiner kan foreslå en direkte eller indirekte interaktion mellem proteinerne, og kan anvendes til at styrke konstateringer opnået ved biokemiske metoder, såsom immunopræcipitation. I modsætning biokemiske metoder, tillader live-cell imaging disse inter-protein-interaktioner, der skal overholdes rumligt og over tid, lette overvågningen af ​​fysiologiske processer, som de forekommer og påvisning af den cellulære fordeling af proteiner. Forskellige værktøjer til kvantitativ analyse af colokalisering er udviklet; Pearsons korrelationskoefficient er fortsat et meget attraktivt og bredt tilgængelige metode til kvantificering af graden af colokalisering mellem to proteiner 12. Mens fluorescens resonans eenergiprodukter, (FRET) eksperimenter muliggøre påvisning af inter-protein interaktioner karakteriseret ved umiddelbar nærhed (10 nm), denne metode kræver specialiserede indstillinger (udstyr og kompatibilitet af fluorescerende anvendte mærkninger) samt komplekse databehandling. For de fleste anvendelser, colokalisering analyse i konjugation med biokemiske metoder udgør en nem at bruge og enkel metode til at observere protein-protein interaktioner over tid.

Etablering af en fluorescens-intensiteten tærsklen for analyserede pixels, og samtidig ignorere pixels under intensiteten tærsklen til enten kanal er af afgørende betydning for nøjagtig og følsom colokalisering analyse. Den almindeligt anvendte algoritme til objektiv og automatiseret opgørelse af disse tærskler blev udviklet af Costes et al. 13 og implementeres af billedbehandling programmer såsom Imaris og Volocity.

Her viser vi brug af levende T-celle imagningsmetode til analyse af dynamikken i SLP76, en nøgle stillads i T-celler, og Nck, en adapter protein, som begge er af afgørende betydning for T-celle-aktivering 14,15. Billeder af T-celler opsamlet under aktiveringen tyder på, at de to proteiner er colocalized hele cellulær aktivering proces (figur 3). Dette er kvantitativt bekræftes ved at udføre Pearsons colokalisering test på billeder indsamlet gennem aktiveringsprocessen. Den Pearsons colokalisering koefficienter spænder fra -1 til 1, hvor en score på -1 betyder anti-korrelation, en score på 1 betyder perfekt colokalisering og 0 betyder ingen sammenhæng mellem de to billed-kanaler. Sammenligning af Pearsons colokalisering koefficienter beregnet for forskellige tidspunkter og for forskellige celler indikerer, at colokalisering af Nck og SLP76 ikke ændres signifikant cellulær aktivering, men forbliver konstant (p> 0,3, figur 4). Selv om det overordnede colokalisering coeffektive af disse proteiner ændrer ikke hele aktiveringsprocessen, betyder det ikke eliminere muligheden for en dynamisk proces med forenings-og afstandtagen forekommer mellem disse proteiner 18.

Protokollen præsenterede vi også kan tilpasses til andre hæmatopoietiske cellelinjer ved at justere celle vækstbetingelser som påkrævet, at vælge en transfektion indstilling egnet til cellelinie pågældende og ændring af cellulær aktivering processen, hvis relevant. Bemærk, at mens vi brugte LSM 510 Meta konfokal mikroskop med passende justeringer og brug af indstillinger, kan andre konfokal mikroskopi systemer med succes anvendes som godt.

Brugen af ​​levende T-cell imaging giver de lovgivningsmæssige og aktivering processer at være direkte overvåget, så signalering begivenheder, der skal udforskes med tidslige og rumlige opløsning utilgængelig hjælp biokemiske og molekylære metoder. Vi præsenterer en enkel method til udførelse af en levende T-celle spredning assay overvåge de relevante proteiner i realtid og analysere dataene for at give kvantitative resultater. Resulterende mikroskopi data kan også anvendes til andre downstream-applikationer, såsom celle-facon indeks analyse 16 og FRET analyse 17,18, afhængigt af den specifikke forsøgsopstillingen og forskningsformål.

Disclosures

Vi har ingen interessekonflikter til at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne takker Sophia Fried til teknisk bistand. MBS takker følgende agenturer for deres forskning support: The Israel Science Foundation tilskud no.1659/08, 971/08, 1503-1508 og 491/10, ministerier for Health & Science om tilskud ikke. 3-4114 og 3-6540, Israel Cancer Association gennem Estate af den afdøde Alexander Smidoda og Taubenblatt Family Foundation for biomedicin excellence tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics