T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

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Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

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Abstract

전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다.

다양한 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T - 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.

Protocol

1. T-세포의 형질

  1. Nucleofector 솔루션 키트의 "보충"솔루션을 혼합하여 활성화 Amaxa Nucleofector 솔루션을 준비합니다. 활성화 된 솔루션은 3 개월까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 문화 매체 인 Jurkat T 세포를 증가 【10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 2 RPMI에서 mM의 L-글루타민]. 최적의 세포는 1-2주 해동 후 사용한다. 로그 성장 세포 배양을 사용하여 높은 형질 전환 효율과 세포의 생존을 위해 매우 중요합니다. 또는 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 기본 T 세포와 함께 사용할 수 있습니다, 앞에서 8을 설명했다. 그것은 기본 T 세포의 활성화 과정의 기간 더 긴 인 Jurkat T 세포 (~ 30 분)보다 것을 강조되어야한다, 현미경 단계 배양 시스템은 CO 2, 전역 습도와 온도를 유지하는 데 사용해야 장착 활성화 프로세스입니다.
  3. 5 수집15 ML 튜브에 형질 전환 당 × 10 6 로그 상 T 세포.
  4. 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
  5. 원심 분리하는 동안 6 잘 플레이트를 준비합니다. 37 5 ML 문화 매체 및 사전 부화 각 형질에 대해 잘 하나를 채울 ° C.
  6. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상층 액을 버린다. 1 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend.
  7. 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
  8. 원심 분리하는 동안 형질 솔루션을 준비합니다. 96 - 웰 플레이트 잘 하나, 찬란 태그 단백질을 코딩 관심 플라스미드의 5 μg의 DNA와 1 단계에서 제조 된 활성화 100 μl의 Amaxa Nucleofector 솔루션을 섞는다. 최적의 DNA 농도는 형질 솔루션을 희석 방지하기 위해 1 ㎍ / ㎖보다 커야합니다.
  9. 부드러운 피펫으로 잘 섞는다.
  10. 세포 원심 분리 한 후,주의 깊게 상층 액을 제거 D되지 동안펠렛을 isturbing.
  11. DNA / 형질 전환 솔루션 두번을 피펫.
  12. 펠렛의 DNA / 형질 전환 솔루션을 추가합니다.
  13. Amaxa 큐벳에 세포를 전송합니다.
  14. Amaxa Nucleofector 장치에 큐벳을 삽입합니다.
  15. electroporation을위한 H-10 Amaxa의 형질 설정 (인 Jurkat) 또는 T-23 (기본 T 세포)를 사용합니다.
  16. 인큐베이터에서 6 잘 플레이트를 제거합니다.
  17. electroporation에 따라주의 깊게 파스퇴르 피펫을 사용하여 6 잘 플레이트에 세포 현탁액에 뜨는을 전송합니다. 세포 파편으로 구성된 펠렛이 형성 될 수 있습니다. 펠렛을 전송하지 마십시오.
  18. 37 24 시간 동안 세포를 품어 ° C.
  19. 새로운 우물에 각 우물에서 세포 현탁액의 2.5 ML을 전송합니다. 각 well에 2.5 ML 따뜻한 문화 매체 (2 단계에서 설명)를 추가합니다.
  20. 72 시간 후 400 7 분 × g, 실온에서 대한 멸균 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 뜨는을 취소하고이를 위스콘신 교체사용되는 플라스미드에 적합한 포유류 세포 선택 항생제 (, 우리는 각각 1.3 밀리그램 / ML 및 / 또는 0.2 밀리그램 / ML의 농도 G418 및 / 또는 그로 마이신을 사용하는 데 사용되는 항생제에 적합한 농도를 적용) 보충 번째 배지. 신선한 잘있는 문화 세포 현탁액. 또한, 세포는 일시적으로 형질 전환 및 형질 전환 후 48 시간을 이미지 할 수 있습니다. 일시적으로 형질 전환 된 세포를 준비하려면 20 단계로 일반적으로 계속 8 단계에서 동시에 두 개의 플라스미드와 세포를 공동 형질하고 23 단계로 없습니다. 이 시나리오에서, 세포가 즉시 사용되어야합니다, 일반적으로 자신의 형광 강도는 이기종 반드시 높지 않다.
  21. 적절한 선택 항생제가 첨가 배지로 세포를 성장. 세포를 분리하고 필요에 따라 항생제 첨가 배지와 함께 그들을 보충합니다.
  22. 이주 후 FACS의 사용 (독감 성공적으로 형질을 확인로 orescence - 활성화 된 셀 정렬은) 다음 :
  23. 10 6 형질 전환 세포 10 6 모의 형질 세포 (대조군), 그리고 안정적으로 찬란 태그 단백질을 표현하는 것으로 알려져있다 10 6 세포를 수집합니다. 세포가 하나 이상의 형광 단백질 (27 단계 참조) 형질 전환되는 경우에, 긍정적 인 컨트롤 등 여러 단독 태그 세포 라인을 사용합니다.
  24. 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
  25. 상층 액을 버린다. 500 μL FACS 버퍼 (PBS W / O 칼슘 2 +와 마그네슘 2 + 5 % FCS, 0.05 % 나트륨 아 지드)에있는 세포를 resuspend.
  26. 세포의 형광을 확인 분석 FACS를 사용합니다. 부정과 긍정적 인 컨트롤의로 형질 전환 된 세포의 형광을 비교합니다.
  27. 형질 전환 된 세포를 사용하여 추가, 찬란 태그 단백질의 단계를 반복 3-26과 세포를 형질합니다.
  28. 형광의 높은 수준을 표시하는 셀이 사용되어야한다. 의 최적, 최소 50 %문화의 세포가 높은 형광해야한다. 세포의 형광 FACS를 통해 세포 분류에 의해 증가 될 수있다.

모든 추가 태그 단백질은 서로 다른 형광 물질에 융합되어야하며, 다른 선택의 항생제 인코딩 플라스미드에 인코딩. 하나 이상의 플라스미드로 형질 전환 된 세포를 선택하는 매체는 모든 적절한 항생제로 보충해야한다.

2. T 세포 확산 분석 준비

  1. 실험실 테크 II 독일어 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드를 사용합니다. 실수로 준비 또는 사용 중 피펫 팁 예를 들어 챔버의 내부 표면, 스크래치하지 않도록합니다.
  2. 50-ML 슬라이드 준비 솔루션을 준비 : 12 M (37 %), 염산 4.6 mL를 취하여, 38.5 ML 100 % 에탄올 6.9 ML 이중 증류수를 추가합니다.
  3. 500 μL 슬라이드 준비 솔루션 슬라이드의 각 챔버를 채우십시오.
  4. 10 분 실온에서 알을 품다.
  5. 챔버 흡입의, 완전히 건조.
  6. ° C까지 완전히 건조 45 1 시간 동안 폭로 슬라이드를 품어.
  7. 이중 증류수에 0.1 % 폴리-L-라이신 (시그마 - 알드리치)을 희석하여 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션을 준비합니다.
  8. 각 챔버에 500 μl를 적용합니다.
  9. 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어.
  10. 그들을 완전히 건조 챔버를 대기음.
  11. ° C까지 완전히 건조 45 3 시간 동안 품어.
  12. 코팅 된 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 건조 저장할 수 있습니다.
  13. 활성화 항체 솔루션을 준비합니다. HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) 또는 UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 챔버 당 400 ㎕의 PBS에서 10 ㎍ / ㎖ 하나 : 항 CD3 항체를 사용합니다. 이 솔루션은 곧 슬라이드 준비하기 전에 준비를해야합니다.
  14. 활성화 항체 용액 400 μL 각 챔버를 채우십시오.
  15. 4에서 하룻밤, 바람직하게는 37 ° C 또는에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 ° C.
  16. 활성화 항체 졸 제거ution 즉시 300 μL PBS로 두 번 실을 씻는다. 이 시점에서, 실이 버퍼로 가득 남아 있는지 확인합니다.
  17. 4 ℃에서 PBS - 채워진 슬라이드를 저장 우리는 1 주 안에 준비된 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 좋습니다.

3. T 세포 활성화 및 이미징

  1. [1.25 ML의 HEPES (1 M) 10 ㎖ FCS, 38.75 ML RPMI 페놀 레드없이] 이미지 버퍼를 준비합니다. 이미지 버퍼는 4 ° C 후 여과에 저장할 수 있습니다.
  2. 자이스 혈구 LSM 510 메타 현미경을 활성화합니다. 37 현미경 가열이 장착 프레임을 따뜻하게 ° C. "전문가 모드"를 선택합니다.
  3. "취득"탭을 클릭하고 다음 탭을 엽니 레이저, 현미경, 구성, 검사, 시간 시리즈.
  4. 필요한 레이저를 활성화합니다. MCFP 및 mYFP의 자극에 대한 다음 "의"5 분 "대기"로 아르곤 / 2 레이저가 설정합니다.
  5. 당신은 같은 형광체를 사용하기 전에이 라이브 세포 이미징 분석을 수행 한 경우, 결과 LSM 파일을 열고, 나는 "재사용"을 클릭사기꾼, 9 단계에서 계속합니다. 그렇지 않으면 6 단계에서 계속합니다.
  6. 사용 된 형광 단백질의 여기 및 방출에 대한 적절한 필터를 사용하여 채널을 정의합니다.
  7. "스캔 제어"창에서, Z 스택 옵션을 선택합니다.
  8. 0.5 μm의, 현재 조각 : 3; 슬라이스 번호 : 간격 5 다음 검색 매개 변수를 입력합니다.
  9. 현미경 근처에 37 Accublock 디지털 건조한 목욕 (Labnet) ° C를 준비합니다.
  10. 37 ° C.에 이미지 버퍼를 따뜻하게
  11. 따뜻한 이미지 버퍼 600 μL로 대체, PBS를 흡입하여 저장된 슬라이드를 준비합니다.
  12. 37 슬라이드를 품어 ° C. 13 단계까지 적어도 15 분 동안 인큐베이터에서 슬라이드를 유지합니다.
  13. 5를 수집 × 10 5 형질 전환 된 T 세포를.
  14. 400 × g에서 2 분간 세포를 원심 분리기.
  15. 상층 액을 버린다.
  16. 1 ML 따뜻한 이미지 버퍼에있는 세포를 resuspend하고, 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다.
  17. t를 놓고Accublock 디지털 건조한 목욕에 동부 표준시 관.
  18. 인큐베이터에서 따뜻하게 슬라이드를 가지고, 예열 현미경 장착 프레임에 마운트합니다.
  19. "VIS"아이콘을 클릭합니다.
  20. 세포 현탁액을 혼합하고 1-2 μl를 제거합니다.
  21. 슬라이드의 하단에 위의 이미지 버퍼에 피펫의 팁을 삽입합니다. 슬라이드가 긁히지 않도록.
  22. 목표의 구멍에 씨앗 세포를.
  23. 그들이 내려 가면 즉시 시각적으로 형광 세포를 추적을 시작합니다. 두 채널에서 높은 형광을 표시하는 셀을 선택합니다.
  24. 셀이 슬라이드의 표면에 도달하기 전에, LSM 모드를 활성화합니다.
  25. 단 하나의 여기 레이저를 전환합니다. 당신은 DIC 채널을 가지고있는 레이저를 선택합니다.
  26. 1로 줌을 설정합니다. "빠른 XY"아이콘을 클릭합니다. "정지"아이콘을 클릭합니다. 자르기 도구를 사용하여 셀을 중심으로 투자 수익 (ROI)을 선택합니다.
  27. 3 줌을 설정합니다. "빠른 XY"아이콘을 클릭 한 다음 수동으로 최적의 셀을 볼 포커스를 설정합니다. "정지"ICO을 클릭N.
  28. 모든 필요한 여기 레이저를 전환합니다.
  29. "StartT"아이콘을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 이미지 확산 과정 (일반적으로 5 분)의 전체 셀을. 완료되면, "정지"아이콘을 클릭합니다.
  30. 파일을 저장합니다.
  31. 추가 세포를 획득하려면 "VIS"아이콘을 클릭합니다. 아직 슬라이드의 바닥에 접촉하지 않은 세포가있는 경우, 23 단계에서 계속합니다. 이미 확산 과정을 시작했습니다 이미징 세포를 피할 수 있습니다. 그렇지 않으면 32 단계로 진행합니다.
  32. 관찰 슬라이드 영역이 세포의 대부분이없는 경우, 셀 (20 단계부터 계속합니다)의 또 다른 나누어지는을 추가합니다. 그렇지 않으면 33 단계로 진행합니다.
  33. 추가 세포를 얻으려면 목적의 구멍 위의 영역이 세포의 결여되도록 슬라이드를 이동합니다.
  34. 세포 (및 20 단계에서 계속) 다른 나누어지는을 추가합니다.
  35. 원하는 모든 이미지를 수행 한 후, 저장된 LSM 파일을 엽니 다.
  36. "갤러리", "시간 + Z"와 "부분"을 클릭합니다.
  37. relevan을 선택t 시간 범위와 Z 스택.
  38. 새 파일을 저장합니다.
  39. 모든 이미지 파일에 대한 단계 35-38를 수행합니다.

4. 영상 데이터 분석

  1. Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 LSM 파일을 엽니 다.
  2. "능가"을 클릭합니다. "이미지 프로세싱"메뉴를 클릭하고 "시간과 Z 스왑"를 선택합니다. 이 이미지의 정확한 자르기에 도움이 될 것입니다.
  3. "편집"도구 모음을 클릭하고 드롭 메뉴에서 "자르기 3D"옵션을 선택합니다. 세포를 둘러싸고있는 영역 만 포함하도록 이미지를 자르. 우리는 셀을 중심으로 300 × 300 픽셀의 사각형을 자르기 좋습니다. 세포의 모양과 위치가 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있습니다. t 축을 관찰하면 세포가 모든 시간 지점에서 자른 영역 내에 있는지 확인합니다.
  4. "이미지 프로세싱"메뉴를 클릭하고 이미지의 원래 시간적 분리를 복원하는 "시간과 Z 스왑"를 선택합니다.
  5. 기본 도구 모음에서 "Coloc"버튼을 누르십시오. "데 시간 빌드를 선택P. Coloc. "Imaris는 각 시점에서 각 채널에 대한 강도 임계 값을 계산합니다.
  6. "채널 통계"를 선택하여 colocalization을 분석의 결과를 볼 수 있습니다. "내보내기"를 클릭하여 데이터를 내 보냅니다.
  7. 각 군데 셀에 대해 6 단계를 반복합니다. 우리는 적어도 50 세포가 이러한 방식으로 분석하는 것이 좋습니다.
  8. 평균 피어슨의 colocalization을 계수 및 표준 오류 또는 편차를 계산합니다.

Representative Results

우리는 살아있는 T 세포 이미징 및 분석의 예를 제시한다. 영상 실험에 앞서, SLP76 결핍 T 세포 (J14)는 형광 단백질 (그림 1)의 발현을 결정하는 FACS의 사용으로 분석 하였다. 태그 신호 단백질 MCFP - NCK와 SLP76-mYFP로 형질 전환 된 T 세포는 활성화 슬라이드를 통해 입금 및 T 세포의 확산 (그림 2) 중 몇 군데 있었다. 수집 된 이미지 활성화 및 (그림 3) 확산을 통해 단백질 지방화의 역 동성을 보여줍니다. 인간의 편견을 최소화하면서 컴퓨터 이미지 처리, 새로운 통찰력과 시각 세포의 정량적 정보를 제공합니다. 세포의 활성화 과정을 통해 두 단백질의 colocalization을 검토하기 위해, 우리는 Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)의 colocalization을 도구를 활용. 몇 군데 세포에 걸쳐 서로 다른 시간 지점 사이 colocalization을 계수를 비교하여, 우리는 있었다 NCK와 SLP76의 colocalization을이 T-세포 활성화 (p> 0.3) (그림 4)에 걸쳐 크게 변화하지 않는 것을 확인할 수.

그림 1
그림 1. (B) mYFP;. 세포의 FACS 분석은 두 데이터는 (A) MCFP에 대한 형광 강도 막대 그래프로 표시됩니다 형광 표지 된 단백질 형질 전환(C) 도트 플롯으로. MCFP - NCK와 SLP76-mYFP 형질 전환 J14 세포의 형광 강도는 각각 시안과 노란색으로 표시됩니다. Untransfected J14 대조군 세포는 검은 색 선으로 표시됩니다.

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그림 2. 라이브의 개략도 T 세포 분석을 확산 (A) T-세포 활성화 슬라이드의 준비;. (B) T 세포 확산 분석 및 분석을 살고. (C) 현미경 설정 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. MCFP - NCK와 SLP76-mYFP을 표현하는 T 세포의 활성화 과정에서 NCK와 SLP76의 배포. 세포는 항-CD3 자극 항체 사전 코팅 coverslips를 통해 삭제하고 지속적 7 분의 기간 동안 몇 군데 있었다. SLP76-mYFP는 노란색으로 표시되어있는 동안 MCFP - NCK는 청록색으로 표시됩니다.


그림 4. 단백질 colocalization을의 정량 분석. 세포의 이미지 처리는 Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 수행 하였다. colocalization을이 MCFP 채널의 강도와 각 픽셀에 대한 mYFP 채널 사이의 피어슨 상관 계수로 계산됩니다. 서로 다른 시간 지점에서 계산 피어슨의 colocalization을 계수는 비교됩니다. 30 초 활성화 프로세스로, MCFP - NCK와 SLP76-mYFP의 colocalization을 계수는 (p <0.05) 유의하게 증가 하였다. 이러한 결과는> 50 독립 셀을 분석하여 계산 하였다. 평균 ± 표준 오차가 표시됩니다.

Discussion

여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 방법과는 달리, 살아있는 세포 이미징이 간 단백질의 상호 작용이 발생할 때 생리적 인 과정의 모니터링을 촉진하고 단백질의 세포 분포의 검출, 공간적 및 시간에 관찰 할 수 있습니다. colocalization을의 정량 분석을위한 다양한 도구가 개발되었다; 피어슨의 상관 계수는 두 개의 단백질 12 사이 colocalization을 정도의 정량화를위한 ​​아주 매력적이고 널리 사용되는 방법 남아 있습니다. 반면 형광 공명 전자에너 전송 (무서워) 실험 가까이 (10 NM)을 특징으로 간 단백질 상호 작용의 검출을 가능하게,이 방법은 특수 설정 (사용되는 형광 taggings의 장비와 호환) 및 복잡한 데이터 처리를 필요로합니다. 대부분의 용도 colocalization을 분석을 위해, 생화학 적 방법과 활용에는 사용하기 쉬운 구성하고 시간이 지남에 단백질 - 단백질 상호 작용을 관찰하는 간단한 방법.

두 채널의 강도 임계 값보다 픽셀을 무시하고, 분석 픽셀에 대한 형광 강도 임계 값을 설정하면 정확하고 민감한 colocalization을 분석을위한 매우 중요합니다. 이러한 임계 값의 객관적이고 자동화 된 측정을위한 일반적으로 사용되는 알고리즘은 13. Costes 등에 의해 개발되었으며 같은 Imaris 및 Volocity 같은 이미지 처리 프로그램에 의해 구현됩니다.

여기, 우리는 살아있는 T 세포 IMAG의 사용을 보여줍니다SLP76의 역학을 분석 ING 방법은 중요한 T 세포 지지체와 NCK, 어댑터 단백질, 둘 다 T-세포 활성화 14,15를 위해 필수적입니다. 활성화 과정에서 수집 된 T 세포의 이미지는 두 단백질 (그림 3) 세포의 활성화 과정 전반에 걸쳐 colocalized하는 것이 좋습니다. 이 정량적으로 정품 인증 과정을 통해 수집 된 영상에서 피어슨의 colocalization을 테스트를 수행하여 뒷받침된다. -1에서 -1의 점수 안티 상관 관계를 의미한다 1, 피어슨의 colocalization을 계수 범위는 1의 점수는 완벽한 colocalization을하고 0은 두 개의 이미지 채널 간의 상관 관계를 나타냅니다. 서로 다른 시간 포인트를 다른 세포에 대한 계산 피어슨의 colocalization을 계수의 비교 NCK와 SLP76의 colocalization을 크게 세포의 활성화 과정에서 변경되지 않음을 나타냅니다 만, (p> 0.3, 그림 4 참조) 일정하게 유지됩니다. 반면 전체 colocalization을 공동이 단백질의 효율적인 활성화 과정을 통해 변경되지 않습니다, 그것은 협회 및 이러한 단백질 18 사이에서 발생하는 분열의 동적 프로세스의 가능성을 제거하지 않습니다.

우리가 제시 한 프로토콜은 또한 필요에 따라 세포 성장 조건을 조절 문제 세포주에 적합한 형질 전환 설정을 선택하고 해당하는 경우, 세포 활성화 프로세스를 수정하여 다른 조혈 세포 라인에 적용 할 수 있습니다. 우리가 적절한 조정과 설정의 사용으로, LSM 510 메타 공 촛점 현미경을 사용하면서 다른 공 촛점 현미경 시스템이 성공적으로도 사용할 수 있습니다하시기 바랍니다.

라이브 T 세포 이미징의 사용은 생화학 및 분자 방법을 사용하여 공간적 해상도를 사용할 수와 함께 탐험하는 신호 이벤트를 활성화, 규제 및 활성화 과정을 직접 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 간단 마약을 제시, 살아있는 T 세포 확산 분석을 수행하는 실시간 관련 단백질을 모니터링하고 정량적 인 결과를 산출하기 위해 데이터를 분석 OD. 결과 현미경 데이터는 또한 세포 모양 인덱스 분석과 같은 다른 다운 스트림 응용 프로그램, 16에 사용 및 특정 실험 장치 및 연구 목적에 따라 분석 17,18을 무서워 할 수 있습니다.

Disclosures

우리는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

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References

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