Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

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Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

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Abstract

Protezione contro le malattie infettive è mediato dal sistema immunitario 1,2. Linfociti T sono coordinatori del master del sistema immunitario, regolando l'attivazione e risposte di molteplici cellule immunitarie 3,4. Attivazione delle cellule T dipende dal riconoscimento di antigeni specifici mostrata dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) è specifico per ogni clone di cellule T e determina specificità antigenica 5. Il legame del TCR all'antigene induce la fosforilazione di componenti del complesso TCR. Al fine di promuovere l'attivazione delle cellule T, questo segnale deve essere trasdotte dalla membrana al citoplasma e il nucleo, avviando varie risposte cruciali quali l'assunzione di proteine ​​di segnalazione al TCR; sito APC (sinapsi immune), la loro attivazione molecolare, riarrangiamento del citoscheletro, elevazione della concentrazione intracellulare di calcio, e cambiamenti nell'espressione genica 6,7. La corretta initiation e la cessazione dei segnali di attivazione è di fondamentale importanza per le risposte delle cellule T del caso. L'attività delle proteine ​​di segnalazione dipende la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina, post traduzionali come fosforilazione proteica, formazione di complessi proteici, ubiquitinazione proteica e l'assunzione di proteine ​​a vari siti cellulari 8. Comprendere il funzionamento interno del processo di attivazione delle cellule T è fondamentale sia per la ricerca immunologica e applicazioni cliniche.

Vari test sono stati sviluppati al fine di indagare le interazioni proteina-proteina, tuttavia, saggi biochimici, come ad esempio il metodo di co-immunoprecipitazione ampiamente utilizzato, non consentono posizione proteina di essere discerne, precludendo così l'osservazione di preziose informazioni sulla dinamica del cellulare meccanismi. Inoltre, questi test di massa di solito si combinano proteine ​​da molte cellule diverse che potrebbero essere in diverse fasi di tindagò processo cellulare. Questo può avere un effetto negativo sulla risoluzione temporale. L'uso di immagini in tempo reale delle cellule vive permette sia il tracking spaziale delle proteine ​​e la capacità di distinguere temporalmente tra eventi di segnalazione, che perde così in luce la dinamica del processo di 9,10. Presentiamo un metodo di imaging in tempo reale della formazione di segnalazione-complesso durante l'attivazione delle cellule T. T-cellule primarie o linee di cellule T, come Jurkat, vengono trasfettate con plasmidi codificanti per proteine ​​di interesse fuse ad proteine ​​fluorescenti monomeriche, impedendo oligomerizzazione non fisiologico 11. Diretta cellule T sono sceso sopra un coprioggetto pre-rivestite con cellule T attivante 8,9 anticorpo, che si lega al complesso CD3/TCR, indurre l'attivazione delle cellule T superando la necessità di antigeni attivatori specifici. Cellule attivate sono costantemente ripreso con l'uso della microscopia confocale. Dati di imaging vengono analizzati per produrre risultati quantitativi, quali il collecoefficiente ocalization delle proteine ​​di segnalazione.

Protocol

1. Trasfezione di cellule T

  1. Preparare la soluzione Nucleofector Amaxa attivato mescolando soluzione "Supplemento" del kit per la soluzione Nucleofector. La soluzione attivata può essere conservato a 4 ° C per tre mesi.
  2. Coltivare le cellule Jurkat in mezzo di coltura [10% siero fetale di vitello (FCS), soluzione di penicillina-streptomicina 1%, e 2 mM L-glutammina in RPMI]. In modo ottimale, le cellule devono essere utilizzati 1-2 settimane dopo lo scongelamento. Utilizzando colture di cellule in crescita logaritmica è cruciale per alta efficienza di trasfezione e la sopravvivenza cellulare. Alternativamente, con piccole modifiche, questo protocollo può essere utilizzato con cellule T primarie, come descritto precedentemente 8. Va sottolineato che la durata del processo di attivazione delle cellule T primarie è più lunga di quella delle cellule T Jurkat (~ 30 min), una fase di microscopio montato sistema di incubazione deve essere utilizzato per mantenere livelli di umidità e temperatura durante la CO 2, processo di attivazione.
  3. Raccogliere 5Cellule × 10 6 log-fase T per trasfezione in una provetta da 15 ml.
  4. Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente.
  5. Durante la centrifugazione, preparare una piastra da 6 pozzetti. Riempire una cavità per ogni trasfezione con 5 ml di terreno di coltura, e pre-incubare a 37 ° C.
  6. Raccogliere le provette dalla centrifuga e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di RPMI.
  7. Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente.
  8. Durante la centrifugazione, preparare la soluzione di trasfezione. In un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, mescolare attivato 100 microlitri soluzione Nucleofector Amaxa preparata nel passaggio 1 con 5 pg di DNA del plasmide di interesse codificante una proteina fluorescente tag. In modo ottimale, la concentrazione di DNA dovrebbe essere maggiore di 1 pg / ml al fine di evitare di diluire la soluzione di trasfezione.
  9. Mescolare bene pipettando dolce.
  10. Dopo centrifugazione delle cellule, rimuovere con attenzione tutto il surnatante mentre non disturbing il pellet.
  11. Pipettare la soluzione di DNA / trasfezione due volte.
  12. Aggiungere la soluzione di DNA / trasfezione al pellet.
  13. Trasferire le cellule alla Amaxa cuvetta.
  14. Inserire la cuvetta nel dispositivo Amaxa Nucleofector.
  15. Utilizzare l'impostazione H-10 Amaxa trasfezione per elettroporazione (per Jurkat) o T-23 (per le cellule T primarie).
  16. Rimuovere la piastra da 6 pozzetti dall'incubatore.
  17. Seguendo elettroporazione, trasferire accuratamente il surnatante con la sospensione cellulare alla piastra da 6 pozzetti con una pipetta Pasteur. Un pellet costituita da detriti cellulari può formare. Evitare di trasferire il pellet.
  18. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C.
  19. Trasferire 2,5 ml di sospensione cellulare da ciascun pozzetto in un nuovo pozzo. Aggiungere 2,5 ml di terreno di coltura caldo (descritto nel passaggio 2) a ciascun pozzetto.
  20. Dopo 72 ore, trasferire le cellule in una provetta sterile e centrifugare per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e sostituirlo wicultura th mezzo supplementato con la cellula di mammifero selezione antibiotica appropriata per il plasmide usato (applicare una concentrazione adatta per gli antibiotici utilizzati; abbiamo usato G418 e / o Hygromycin in concentrazioni di 1,3 mg / ml e / o 0,2 mg / ml, rispettivamente). Coltura la sospensione cellulare in un pozzo fresco. In alternativa, le cellule possono essere trasfettate transitoriamente e ripreso 48 ore dopo la trasfezione. Per preparare le cellule trasfettate transitoriamente, co-trasfezione delle cellule con i due plasmidi contemporaneamente al passaggio 8, continuando normalmente al punto 20, e quindi passare direttamente al punto 23. Si noti che in questo scenario, le cellule devono essere utilizzati immediatamente, e in generale la loro intensità di fluorescenza è eterogeneo e non necessariamente elevato.
  21. Crescere le cellule con terreno di coltura addizionato con l'appropriato antibiotico selezione. Dividere le celle e di integrarle con terreno di coltura antibiotico-integrata, se necessario.
  22. Dopo 2 settimane, verificare trasfezione successo con l'impiego di FACS (influenzacell sorting orescence-attivato) come segue:
  23. Raccogliere 10 6 cellule trasfettate, 10 6 cellule trasfettate fittizi (controllo negativo), e 10 6 cellule che sono noti per esprimere stabilmente la proteina fluorescente tag. Se le cellule vengono trasfettate con più di una proteina fluorescente (vedi passo 27), utilizzare più linee cellulari, singolarmente contrassegnati come controlli positivi.
  24. Centrifugare le cellule per 7 minuti a 400 xg a temperatura ambiente.
  25. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri tampone FACS (PBS w / o Ca 2 + e Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% sodio azide).
  26. Utilizzare un FACS analisi per verificare la fluorescenza cellulare. Confrontare fluorescenza delle cellule trasfettate a quella dei controlli negativi e positivi.
  27. Trasfezione le cellule con un ulteriore, fluorescente con tag proteine, ripetere i passaggi 3-26 utilizzando le cellule transfettate.
  28. Cellule che mostrano alti livelli di fluorescenza dovrebbero essere utilizzati. In modo ottimale, almeno il 50% deile cellule nella coltura dovrebbero essere altamente fluorescente. Cella di fluorescenza può essere aumentato di ordinamento delle cellule tramite FACS.

Eventuali proteine ​​marcate aggiuntivi devono essere fusi a differenti fluorofori ed essere codificati su plasmidi codificanti per diversi antibiotici di selezione. Mezzo di selezione per le cellule trasfettate con più di un plasmide dovrebbe essere integrato con tutti gli antibiotici appropriati.

2. Cellule T Diffondere Assay Preparazione

  1. Utilizza Lab-Tek II tedesca sistema coverglass 4 diapositive da camera. Assicurarsi di non graffiare accidentalmente la superficie interna delle camere, ad esempio con una punta della pipetta, durante la preparazione o l'uso.
  2. Preparare 50 ml di soluzione di preparazione del vetrino: prendere 4,6 ml di 12 M (37%), HCl, aggiungere 38,5 ml di etanolo al 100%, e 6,9 ​​ml di acqua bidistillata.
  3. Riempire ogni camera del vetrino con 500 microlitri soluzione preparazione del vetrino.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  5. Aspirare la cameras, li asciugare completamente.
  6. Incubare i vetrini scoperto per 1 ora a 45 ° C fino a completamente asciutto.
  7. Preparare 0,01% soluzione di poli-L-lisina diluendo 0,1% di poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) in acqua bidistillata.
  8. Applicare 500 microlitri di ciascuna camera.
  9. Incubare il vetrino per 15 min a temperatura ambiente.
  10. Aspirare le camere, li asciugare completamente.
  11. Incubare per 3 ore a 45 ° C fino a completamente asciutto.
  12. Vetrini rivestiti possono essere conservati a secco per parecchi mesi a temperatura ambiente.
  13. Preparare una soluzione di anticorpi attivazione. Utilizzare un anticorpo anti-CD3: o HIT3a (BD Pharmingen, # 555.337) o UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 mg / ml in 400 microlitri di PBS, per ogni camera. Questa soluzione deve essere preparata poco prima della preparazione del vetrino.
  14. Riempire ogni camera con 400 microlitri della soluzione di anticorpi attivazione.
  15. Incubare il vetrino per 2 ore a 37 ° C o, preferibilmente, una notte a 4 ° C.
  16. Rimuovere l'attivazione di anticorpi solution e lavare immediatamente la camera due volte con 300 microlitri di PBS. Da questo punto, assicurarsi che le camere rimangono pieni di buffer.
  17. Conservare il vetrino PBS-riempita a 4 ° C. Ti consigliamo di utilizzare le camere di diapositive preparate entro 1 settimana.

3. L'attivazione delle cellule T e Imaging

  1. Preparare tampone di imaging [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml di FCS, 38,75 ml RPMI senza rosso fenolo]. Tampone di immagini può essere conservato a 4 ° C dopo filtrazione.
  2. Attivare la Zeiss LSM 510 Meta microscopio. Scaldare il telaio di montaggio riscaldabile microscopio a 37 ° C. Selezionare "Expert Mode".
  3. Fare clic sulla scheda "Acquisisci" e aprire le seguenti schede: Laser, Microscopia, configurazione, scansione, Time Series.
  4. Attivare i laser necessari. Per l'eccitazione di MCFP e PFP, impostare l'Argon / 2 del laser di "stand-by" per 5 minuti, poi su "on".
  5. Se avete eseguito questo test live-cell imaging prima, con gli stessi fluorofori, aprire il file LSM visualizzata fare clic sul "riuso" icon, e continuare dal punto 9. In caso contrario, continuare dal passaggio 6.
  6. Definire i canali utilizzando filtri appropriati per l'eccitazione ed emissione delle proteine ​​fluorescenti utilizzate.
  7. Nella finestra "Scansione di controllo", selezionare l'opzione dello stack Z.
  8. Inserire i seguenti parametri di scansione: Numero di fette: 5; intervallo: 0,5 micron; fetta corrente: 3.
  9. Preparare un AccuBlock Digital bagno a (Labnet) a 37 ° C in prossimità del microscopio.
  10. Riscaldare il buffer di imaging a 37 ° C.
  11. Preparare la diapositiva memorizzato aspirando la PBS, sostituendola con 600 ml di buffer di immagini caldo.
  12. Incubare il vetrino a 37 ° C. Tenere la diapositiva in incubatrice fino al passaggio 13, per almeno 15 min.
  13. Raccogliere 5 × 10 5 cellule T trasfettate.
  14. Centrifugare le cellule per 2 minuti a 400 xg.
  15. Scartare il surnatante.
  16. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di imaging caldo, e trasferirli in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
  17. Posizionare il ttubo est sul bagno a Digital AccuBlock.
  18. Prendere il vetrino riscaldato dal termostato, e montarlo sul telaio di montaggio microscopio riscaldata.
  19. Fare clic sull'icona "VIS".
  20. Mescolare la sospensione cellulare e togliere 1-2 microlitri.
  21. Inserire la punta della pipetta nel buffer di imaging di sopra del fondo della diapositiva. Evitare di graffiare il vetrino.
  22. Seed le cellule sopra dell'apertura della oggettiva.
  23. Immediatamente iniziare a tracciare visivamente le cellule fluorescenti mentre scendono. Selezionare una cella che mostra un'elevata fluorescenza in entrambi i canali.
  24. Prima che la cella raggiunge la superficie del vetrino, attivare la modalità LSM.
  25. Alterna un solo laser di eccitazione. Selezionare un laser per il quale si dispone di un canale DIC.
  26. Impostare zoom a 1. Fare clic sull'icona "Fast XY". Fare clic sull'icona "Stop". Utilizzando lo strumento Ritaglia, selezionare un ROI centrata sulla cella.
  27. Impostare zoom a 3. Fare clic sull'icona "Fast XY", quindi impostare manualmente la messa a fuoco per visualizzare in modo ottimale la cella. Fare clic su "Stop" icon.
  28. Alternare tutti i laser di eccitazione necessari.
  29. Avviare la registrazione facendo clic sull'icona "stARTT". Immagine della cella per la totalità del processo di spalmatura (comunemente 5 min). Al termine, fare clic sull'icona "Stop".
  30. Salvare il file.
  31. Per acquisire ulteriori celle, fare clic sull'icona "VIS". Se ci sono cellule che ancora non entrano in contatto con la parte inferiore della diapositiva, continuare dal punto 23. Evitare le cellule di imaging che hanno già iniziato il processo di diffusione. In caso contrario, passare al punto 32.
  32. Se l'area diapositiva osservata è parte privi di cellule, aggiungere un'altra aliquota di cellule (continuare dal passo 20). In caso contrario, passare al punto 33.
  33. Per acquisire ulteriori celle, spostare la slitta in modo che l'area al di sopra dell'apertura del obiettivo è privo di cellule.
  34. Aggiungere un'altra aliquota di cellule (e continuare dal punto 20).
  35. Dopo aver eseguito tutte le immagini desiderato, aprire un file salvato LSM.
  36. Fare clic su "Galleria", "Time + Z" e "sottoinsieme".
  37. Selezionare il relevant periodo e Z stack.
  38. Salvare il nuovo file.
  39. Eseguire i passaggi 35-38 per tutti i file di imaging.

4. Imaging Data Analysis

  1. Aprire i file con il software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurigo, Svizzera).
  2. Fare clic su "Superare". Fare clic sul menu "Image Processing", e selezionare "Swap Tempo e Z". Questo aiuterà nella corretta ritaglio dell'immagine.
  3. Fare clic su "Modifica" barra degli strumenti e selezionare l'opzione "3D Crop" nel menu a discesa. Ritagliare l'immagine per includere solo l'area che circonda la cellula. Ti consigliamo di ritagliare un quadrato di 300 × 300 pixel centrata sulla cella. Si noti che la forma e la posizione della cella possono cambiare nel tempo. Osservando l'asse t, assicurarsi che la cella è all'interno della regione ritagliata a tutti i tempi.
  4. Fare clic sul menu "Image Processing", e selezionare "Swap Tempo e Z" per ripristinare la separazione temporale originale dell'immagine.
  5. Premere il pulsante "Coloc" sulla barra degli strumenti principale. Selezionare "Tempo di costruzione Dep. Coloc ". Imaris calcola automaticamente le soglie di intensità per ogni canale ad ogni tempo.
  6. Guarda i risultati dell'analisi colocalizzazione selezionando "Channel Statistiche". Esportare i dati facendo clic su "Esporta".
  7. Ripetere i passaggi da 1 a 6 per ogni cella creata l'immagine. Si consiglia di almeno 50 cellule analizzate in questo modo.
  8. Calcolare la media coefficiente di colocalizzazione di Pearson e il suo errore standard o scarto.

Representative Results

Vi presentiamo un esempio di immagini di cellule T in diretta e analisi. Prima dell'esperimento di imaging, SLP76 cellule T deficienti (J14) sono stati analizzati con l'uso di FACS per determinare l'espressione delle proteine ​​fluorescenti (Figura 1). Cellule T trasfettate con le proteine ​​di segnalazione con tag MCFP-NCK e SLP76-PFP sono stati depositati su vetrini Attivazione e ripreso durante cellule T spreading (Figura 2). Immagini raccolte mostrano le dinamiche di localizzazione delle proteine ​​durante l'attivazione e diffusione (Figura 3). Elaborazione delle immagini computerizzata fornisce nuove intuizioni e informazioni quantitative dalle celle visualizzate, riducendo al minimo i pregiudizi umani. Per esaminare la colocalizzazione delle due proteine ​​durante tutto il processo di attivazione cellulare, abbiamo utilizzato il tool colocalizzazione del software Imaris (Bitplane AG, Zurigo Svizzera). Confrontando i coefficienti colocalizzazione tra i diversi momenti attraverso le cellule esposta, eravamo in grado di accertare che la colocalizzazione di Nck e SLP76 non cambia in modo significativo durante l'attivazione delle cellule T (p> 0,3) (Figura 4).

Figura 1
Figura 1. Analisi FACS di cellule doppio trasfettate con le proteine ​​fluorescenza marcata I dati sono rappresentati come istogrammi intensità di fluorescenza per (A) MCFP;. (B) PFP, e (C), come un diagramma a punti. Intensità di fluorescenza di J14 cellule trasfettate con MCFP-Nck e SLP76-PFP sono rappresentati in ciano e giallo, rispettivamente. Untransfected J14 cellule di controllo negativo sono indicati da linee nere.

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Figura 2. Una rappresentazione schematica del live cellule T diffusione saggio (A) La preparazione di vetrini attivazione delle cellule T,. (B) vive a cellule T diffusione del test e analisi;. (C) installazione microscopia Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3
Figura 3. Distribuzione di Nck e SLP76 durante il processo di attivazione delle cellule T. Cellule che esprimono MCFP-Nck e SLP76-PFP sono state ritirate nel corso anti-CD3 stimolatori anticorpi coprioggetto pre-rivestite e costantemente esposte per un periodo di 7 min. MCFP-Nck è rappresentata da ciano, mentre SLP76-PFP è evidenziata in giallo.


Figura 4. Analisi quantitativa di colocalizzazione proteica. Elaborazione di immagini di cellule è stata effettuata utilizzando il software Imaris (Bitplane AG, Zurigo, Svizzera). Colocalizzazione è calcolato come coefficiente di correlazione di Pearson tra le intensità del canale MCFP e il canale PFP per ciascun pixel. Di Pearson colocalizzazione coefficienti calcolati da diversi punti di tempo sono confrontati. Trenta secondi dall'inizio del processo di attivazione, il coefficiente di colocalizzazione di MCFP-Nck e SLP76-PFP è stata aumentata in modo significativo (p <0,05). Questi risultati sono stati calcolati analizzando> 50 cellule indipendenti. Media ± sono mostrati errore standard.

Discussion

La regolazione e la funzione di molteplici processi cellulari dipendono la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina. L'imaging microscopico consente il tracciamento in tempo reale delle proteine ​​fluorescenti tag nelle cellule viventi. Colocalizzazione di proteine ​​marcate può suggerire una interazione diretta o indiretta tra le proteine, e può essere utilizzato per rafforzare i risultati ottenuti con metodi biochimici, come la immunoprecipitazione. A differenza dei metodi biochimici, live-cell imaging permette queste interazioni tra proteina da osservare spazialmente e nel tempo, facilitare il controllo di processi fisiologici come avvengono e il rilevamento della distribuzione cellulare delle proteine. Vari strumenti di analisi quantitativa di colocalizzazione sono stati sviluppati; coefficiente di correlazione di Pearson rimane un metodo molto attraente e largamente disponibili per la quantificazione del grado di colocalizzazione tra due proteine ​​12. Mentre fluorescenza di risonanza etrasferimento (FRET) esperimenti nergy consentono il rilevamento di interazioni tra proteine ​​caratterizzate dalla vicinanza (10 nm), questo metodo richiede impostazioni speciali (attrezzature e compatibilità di marcature fluorescenti utilizzate) ed elaborazione di dati complessi. Per la maggior parte degli usi, analisi colocalizzazione, in coniugazione con metodi biochimici, costituisce un facile da usare e semplice metodo per l'osservazione di interazioni proteina-proteina nel tempo.

Stabilire una soglia di fluorescenza intensità di pixel analizzati, ignorando pixel al di sotto della soglia di intensità per entrambi i canali, è di importanza critica per l'analisi di co-localizzazione accurata e sensibile. L'algoritmo comunemente utilizzato per la determinazione oggettiva e automatizzato di tali soglie è stato sviluppato da Costes et al. 13 ed è implementato da programmi di elaborazione di immagini come Imaris e Volocity.

Qui, dimostriamo l'uso del imag cellule T in direttaing metodo per analizzare le dinamiche di SLP76, un ponteggio chiave in cellule T, e Nck, una proteina adattatore, entrambi i quali sono essenziali per l'attivazione delle cellule T 14,15. Immagini di cellule T raccolti durante l'attivazione suggeriscono che le due proteine ​​sono colocalized tutto il processo di attivazione cellulare (Figura 3). Questo è quantitativamente confermata eseguendo test di colocalizzazione di Pearson sulle immagini raccolte durante il processo di attivazione. Colocalizzazione coefficienti gamma di Pearson tra -1 e 1, dove un punteggio di -1 significa anti-correlazione, un punteggio pari a 1 indica colocalizzazione perfetto e 0 significa assenza di correlazione tra i due canali di immagine. Confronto di Pearson colocalizzazione coefficienti calcolati per i diversi momenti e per diverse cellule indica che colocalizzazione di Nck e SLP76 non cambia in modo significativo durante l'attivazione cellulare, ma rimane costante (p> 0,3, Figura 4). Mentre il co complessivo colocalizzazioneefficiente di queste proteine ​​non cambia durante il processo di attivazione, non elimina la possibilità di un processo dinamico di associazione e di dissociazione si verificano tra queste proteine ​​18.

Il protocollo che abbiamo presentato può essere adattato anche ad altre linee di cellule ematopoietiche regolando le condizioni di crescita cellulare come richiesto, la selezione di un ambiente adatto per trasfezione della linea cellulare in questione e modificare il processo di attivazione cellulare, se applicabile. Si prega di notare che, mentre abbiamo utilizzato il LSM 510 Meta microscopio confocale, con le regolazioni e l'uso delle impostazioni appropriate, altri sistemi di microscopia confocale possono essere usati con successo come bene.

L'uso di immagini di cellule T in diretta permette ai processi di regolamentazione e di attivazione di essere monitorati direttamente, di attivare gli eventi di segnalazione da esplorare con risoluzione temporale e spaziale disponibile con metodi biochimici e molecolari. Vi presentiamo un semplice method per eseguire un live cellule T diffusione saggio, monitoraggio proteine ​​rilevanti in tempo reale e l'analisi dei dati per ottenere risultati quantitativi. Risultanti microscopia dati possono anche essere utilizzati per altre applicazioni a valle, come l'analisi dell'indice cellula-figura 16 e FRET analisi 17,18, a seconda della configurazione sperimentale specifico e obiettivi di ricerca.

Disclosures

Noi non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Sophia fritto per l'assistenza tecnica. MBS ringrazia i seguenti agenzie per il sostegno della ricerca: La Fondazione Israel Science per le sovvenzioni no.1659/08, 971/08 1503/08 e 491/10, i Ministeri della Salute e della Scienza per le sovvenzioni non. 3-4114 e 3-6540, la Israel Cancer Association attraverso la Tenuta del compianto Alexander Smidoda, e la Fondazione Famiglia Taubenblatt per la borsa di eccellenza Bio-medicina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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