הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

שיטה פשוטה להקליט פוטנציאלי שדה תאיים במוח הקדמי דג זברת הזחל מתוארת. השיטה מספקת חזקה

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (71), e50104, doi:10.3791/50104 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אפילפסיה משפיעה על כמעט 3 מיליון בני אדם בארצות הברית ועד 50 מיליון אנשים ברחבי עולם. מוגדר כהתרחשות של התקפי התגרות ספונטניים, אפילפסיה יכולה להיות שנרכשה כתוצאה מפגיעה במוח או מוטציה גנטית. מאמצים להתקפי מודל בבעלי חיים בעיקר נצלו רכשו עלבונות (תרופות convulsant, גירוי או ניזק מוחי) ומניפולציות גנטיות (מציאת antisense, הומולוגי רקומבינציה או transgenesis) במכרסמים. דג זברה הוא מודל למערכת חוליות 1-3 שיכולים לספק חלופה רבה ערך למחקר אפילפסיה מכרסם מבוסס. דג הזברה נמצאים בשימוש נרחב במחקר של חוליות לגנטיקה או פיתוח, להפגין מידה רבה של דמיון גנטי ליונקים ולהביע homologs ל~ 85% ממוטציות אנושיות ידועות בגן בודד אפילפסיה. בשל גודלם הקטן (4-6 מ"מ אורך), זחלי דג זברה יכולים להישמר בנפחי נוזלים נמוכים כמו 100 μl במהלך ההתפתחות המוקדמת וערהyed בצלחות רבות גם. ריאגנטים ניתן להוסיף ישירות לפתרון שבו עוברים מתפתחים, לפשט את מנהל תרופות ומאפשרים מהיר בהקרנת vivo של תרכובות בדיקה 4. oligonucleotides הסינטטי (morpholinos), mutagenesis, אבץ האצבע nuclease וגישות מהונדסות ניתן להשתמש במהירות כדי לייצר מציאת גן או מוטציה בדג זברת 5-7. מאפיינים אלה להרשות מחקרי דג זברת יתרון חסר תקדים סטטיסטי כוח ניתוח על מכרסמים בחקר הפרעות נוירולוגיות כמו אפילפסיה. בגלל "תקן הזהב" למחקר אפילפסיה הוא לנטר ולנתח את ההפרשות החריגות החשמל שמקורן במבנה מרכזי במוח (כלומר, פרכוסים), שיטה יעילה כדי לתעד את פעילות מוח בזחל דג זברה מתוארת כאן. שיטה זו היא עיבוד של טכניקות הקלטה תאיות קונבנציונליות ומאפשרת ניטור יציב לטווח ארוך של פעילות מוחית בזחלי דג זברה ללא פגע. Sהקלטות שפע מוצגות להתקפים חריפים הנגרמים על ידי יישום של תרופות convulsant אמבטיה והתקפים ספונטניים שנרשמו בדגים מהונדסים גנטי.

Protocol

1. ייצור ביצים ואוספות

  1. דג זברת גידול בעלי כדלקמן נהלים סטנדרטיים שתוארו בעבר 8. בקצרה, דג זברה בוגר מוגדר ברביית טנקים עם חוצצים במקום. כאשר האורות בחדר הגיעו בבוקר שלמחרת, חוצצים יוסרו מרביית טנקים ודגים מותרים כ 20-60 דקות של זמן זיווג באין מפריע.
  2. ביצים מטנקי הרבייה נאספות במסננת ולשטוף במי ביצה. ביצים ואז מועברות לצלחת פטרי עם מי ביצה. ביצים ופסולות מופרים יוסרו באמצעות פיפטה העברה.
  3. צלחת פטרי המכילה מקום לביצים שנאספו בחממה (28-32 מעלות צלזיוס). לאחר בקיעה, סביב שני ימים לאחר ההפריה (DPF), להסיר סיסי וכל פסולת אחרת עם פיפטה העברה.
  4. ביום רצוי לאחר ההפריה (3-8 DPF) להסיר צלחת פטרי המכיל זחלי חופשיות חייה ומקום על שולחן מעבדה בטמפרטורת חדר.

ss = "jove_title"> 2. Microelectrode מושך והכנה

  1. שימוש חולץ micropipette, מושך 1.2 מ"מ OD ורוסיליקט זכוכית נימי לשתי מחטים וחנות בצלחת פטרי 150 מ"מ או תיבת פיפטה ריקה על ידי נחת מעל רמפות מרק טיפשיות. מחטים יכולות להיות משך מראש. OD שונות זכוכית נימים ניתן להשתמש בהתאם לסוג של המגבר headstage הזמין.
  2. Backload microelectrode עם פתרון הקלטה תאי (2 M NaCl) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מזרק Nalgene מסנן (4-מ"מ) וMicrofil נימה (מכשירי ורנר Precision) המצורפת. לנער או קש בולוס לעבר קצה המחט עד שיש כמה בועות או לא הנותרים.

3. ריתוק אגר

  1. הכן את פתרון חדש של אגר 1.2% נמוכים היתוך נקודה במי ביצה. פתרון אגר מקום בסט אמבט מים ב ~ 37 ° C.
  2. הכן coverslip עם חדר הקלטה ומקום במקפיא (5-10 דקות). חדר ההקלטה צריך matcשעות שהשתמשו באסדת electrophysiology. אנו משתמשים בחדר בפרופיל נמוך פתוח יהלומי אמבטית הדמיה מורנר מכשירים (הדגם RC-26GLP).
  3. שימוש פסטר או ההעברה פיפטה, מקום דג זברת זחל אחד בטיפה קטנה של מי ביצה בצלחת פטרי צלחת נקיה. לאגל זה, להוסיף טיפה של תמיסה המכילה חומר הרדמה (0.02% tricaine) וסוכן משתק (1 α-bungarotoxin מ"ג / מ"ל).
  4. פקח על דג זברה לאובדן של תנועה (5 עד 10 דקות).
  5. הסר את coverslip / חדר הקלטה ממקפיא. הנח קאמרי על הבמה של stereomicroscope. באמצעות פיפטה העברה, לערבב כמה מ"ל של 1.2% ההיתוך agarose נקודה הנמוך עם פתרון טרנספר (עם דגים) לתא coverslip / הקלטת אגל ו.
  6. באמצעות קצה פיפטה או מחט בוטה בסדר, זחלי עמדה תחת stereomicroscope כך שההיבט הגבי של הדג חשוף למשטח ג'ל agarose. אפשר agarose להקשיח (5-10 דקות), ולאחר מכן באמצעות העברת מרית שטוחה ב אגרתנעל לחדר הקלטה להגדיר על אסדת electrophysiology.

3. הקלטת שדה תאית

  1. הוסף 2-5 מ"ל של הקלטת מדיה דג זברה לתא ההקלטה. אם שינויי סמים קאמריים צורך, ינקבו עם פתרון הקלטה בקצב של כ 1 מ"ל / דקה. אין חמצון של פתרון ההקלטה הוא הכרחי.
  2. הכנס microelectrode (כ 1 מיקרומטר קוטר קצה, 2-7 MΩ) לheadstage המגבר רכוב על micromanipulator תלת ממדי. בדקו שmicromanipulator הוא בתנוחה נכונה על מנת לאפשר טווח התנועה וההסתגלות. הבא את קצה microelectrode לתוך מטוס מבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, ובאמצעות התאמה גסה נמוכים יותר לנקודה שמעל ומעט לפני ראש דג הזברה.
  3. עם המגבר ב"-מהדק נוכחי "מצב אפס אלקטרודה.
  4. באמצעות התאמה גסה נמוכה קצה האלקטרודה כך שהוא רק נוגע בשלurface של דג הזברה, מעט לפני המוח הקדמי.
  5. באמצעות צעדי התאמה עדינים לקדם את קצה האלקטרודה עד שמחורר את העור של דג הזברה. אפשר להתיישב ולאחר מכן לקדם את האלקטרודה כמה מיקרונים לתוך המוח קדמי.
  6. להקליט פעילות חשמלית במצב הנוכחי מהדק באמצעות תוכנת Axoscope. נתונים נרכשים בקצב דגימה של 10 קילוהרץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמאות לפריקת התקפים דמוי electrographic נרשמה במוח הקדמי של זחלי דג זברה אגר-מוטבעים מוצגות באיור 1. פריקת פרץ גדול משרעת רבת עלייה חדה בדגימות אלה הייתה מעורר על ידי יישום אמבט של תרופת convulsant, pilocarpine mM 40 (ב; 6 DPF) או picrotoxin mM 1 (בנקודת B, 8 DPF). בהקלטות אלה, משותקים ודג הזברה אגר משובץ ברציפות נמצאים במעקב לתקופה של עד 90 דקות. דגים נשארים קיימא בתנאים אלה להקלטה של ​​עד 24 שעות. תרופות נוספות לרחצה ובינונית בדרך כלל המפוזרת לאגר כדי לעורר פעילות במוח הקדמי דג זברת הזחל תוך 30 עד 45 דקות. שיטה זו ניתן להשתמש בנפח קטן יחסית פתרון תרופה (2-5 מ"ל) כזחלים אינם דורש זלוף הרציף וניתן להקליט בתצורת אמבטית סטטי במידת צורך. בפנל C, פריקת פרץ ספונטנית מוצגת לדג זברה מהונדסת גנטי בשעת 3 DPF; הקלטה נעשתה בדג הזברההקלטת מדיה. הזרקת oligonucleotide morpholino בשלב התא 1-2 שמשה לביטוי מציאה של גן לטרשת tuberous מורכב (tsc1a), סוג של אפילפסיה בילדים הקשורים להתקפים ואוטיזם. הקלטות תאיות יכולות גם לקבל מtectum האופטי. לדוגמאות, ראה Baraban et al. (2005) 9 או Baraban et al. (2007) 10. כפי שניתן לראות כאן, את האירועים החשמליים יכולים להשתנות בצורת גל ומשך בהתאם למנגנון פעולה המשמש כדי לעורר פעילות התקפים.

איור 1
איור 1. הקלטות שטח תאיות של פעילות פריקה פרץ חריגה נרשמו במוח הקדמי של זחלי דג זברה משותקת ואגר מוטבעים-. אלקטרודות הקלטה ממוקמות תחת חזותיתצפית על מיקרוסקופ זקוף אולימפוס BX50. הקלטות ב() ו (ב) היו ביוזמת כ 40-45 דקות לאחר יישום תרופה. () פריק Multi-ספייק נרשם בpilocarpine, אנטגוניסטית אצטילכולין muscarinic. (ב) שחרורי Burst נרשמו בpicrotoxin, GABA-אנטגוניסטית. (ג) הפרשה מרובה ספייק פרץ יחידה שנרשמה מזחלי דג זברה 3 DPF הוזרקה morpholino נגד tsc1a.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת ההקלטה התאית מוצגת כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של פעילות המוח. הקלטות אלה הן מקבילות לניטור electroencephalographic (EEG) משמש בדרך כלל כדי להעריך את הנוכחות של פריקה חשמלית חריגה (כלומר, תפיסה) במכרסמים של 11 חולי אפילפסיה ו12. הקלטות תאיות יכולות להיות משולבות עם מניפולציות תרופתיות, כפי שמוצג כאן. אלו סוגים של הקלטות יכולים לשמש גם להערכת פנוטיפים אפילפטיים פוטנציאליים בדג זברה מהונדסת גנטי. דג זברה מוטנטים הם בדרך כלל זמין למוטציות גנטיות רבות שזוהו במסכי mutagenesis enu (ראה דג הזברה הבינלאומית מרכז משאבים, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php) או באמצעות מתעורר Tol2 7 מהונדס ו13 טכניקות נוקלאוטיד אצבע אבץ. כפי שהודגם כאן, מציאת הגן מהירה באמצעותoligonucleotides morpholino אחרי ניטור אלקטרו מוקדם ככל 3 DPF מספק דרך נוספת להערכת ליקויי גן התקף וישכנע. האלקטרודה ההקלטה בקלות יכולה להיות ממוקמת בכל מבנה כולל דג זברת tectum או המוח הקטן האופטי, ואלקטרודות הקלטה מרובות ניתן להשתמש במידת צורך. הגבלה של הקלטות אלה היא שזה קשה להעריך את המיקום המדויק של קצה החוט הרושם יחסית לגרעינים מסוימים במוח. הזמינות של דג זברת נושאות כתבי ניאון בגרעינים מסוימים או סוגי תאים תצמצם מגבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

המחבר מבקש להודות לפיטר קסטרו ומתיו Dinday על מאמציהם המוקדמים להקמת דג זברה במעבדה. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק EUREKA (# R01NS079214-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low melting Fisher-Scientific BP1360-100 Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media Fisher-Scientific BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2
pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine Argent Labs MS-222 0.02%
α-bungarotoxin Tocris Bioscience 2133 1 mg/ml
Capillary glass tubing Warner Instruments G120TF-3 Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier Warner Instruments PC-505B We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Filter/amplifier Cygnus Technology FLA-01 We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions.
Axon A/D board and Axoscope software Molecular Devices Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions.
Egg water Instant Ocean 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22, (1), 49 (2011).
  2. Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93, (2), 231 (2011).
  3. Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
  4. Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
  5. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26, (2), 216 (2000).
  6. Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
  7. Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  9. Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, (3), 759 (2005).
  10. Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, (6), 1151 (2007).
  11. Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 39 (2006).
  12. Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51, (4), 592 (2010).
  13. Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138, (20), 4555 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics