一种新的椎稳定制备方法挫伤脊髓损伤

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Medicine
 

Summary

脊椎稳定是必要的最小化可变性,以及生产一致的实验性脊髓损伤。使用与NYU / MASCIS冲击设备一起定制的稳定装置,我们在这里展示了合适的设备和程序,产生重复的半挫伤颈椎(C5)脊髓成年大鼠受伤。

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Walker, M. J., Walker, C. L., Zhang, Y. P., Shields, L. B., Shields, C. B., Xu, X. M. A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (95), e50149, doi:10.3791/50149 (2015).

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Abstract

临床相关的动物颈脊髓损伤(SCI)模型是用于开发和测试潜在的治疗是必不可少的;然而,生产可靠宫颈SCI是困难的,因为缺乏椎体稳定的令人满意的方法。传统的方法来稳定脊柱是通过连接到颈椎棘突夹暂停吻端和尾鳍颈椎。然而,稳定化的这种方法不能防止组织挫伤期间产生的颈椎过程太短被有效地由夹具( 图1)固定。在这里,我们引入一个新的方法,在撞击伤的同一水平,完全稳定的颈椎。这种方法有效地在撞击的部位,从而大大提高了生产一致的SCI的最小化的脊柱运动。我们提供的设备( 图2-4)的直观描述,方法s和一步一步的协议,用于颈椎5椎骨成年大鼠(C5)的稳定化,以执行椎板切除术( 图5),并产生一个挫伤性SCI后。虽然我们只说明使用NYU / MASCIS冲击装置的颈部半挫伤,这种脊椎稳定技术可以应用到脊髓的其他区域,或者适用于其他的SCI的设备。改善通过椎体稳定脊髓曝光和固定可以是用于生产一致和可靠的受伤脊髓有价值。这种脊椎稳定方法也可用于细胞和示踪剂的立体定向注射,以及使用双光子显微镜在各种神经生物学研究的成像。

Introduction

目标脊髓组织一致,且可复制的机械力是最小化的功能和病理变化,并为建立成功的挫伤性脊髓损伤(SCI)模型1-7的关键。施加到脊髓的目标区域的力的大小取决于用于脊柱稳定的方法。目标脊柱的冲击柱塞和脊髓之间接触​​的过程中的位置偏移改变所得伤力。颈椎挫伤性SCI模型是一个更临床相关的模型比其它形式的SCI的,因为约50%的人的SCI的情况下,发生在这个级别8,以及使用动物颈椎损伤模型9-14几个SCI研究已经完成。虽然挫伤性SCI的模型通常通过夹紧棘突前部和后部的损伤部位利用某种形式的稳定化,这种制剂是困难的制造颈脊髓损伤。  如在该演示中,我们开发了稳定的方法是在提高质量和挫伤的再现能力有利。具体地,建立了在试图修改的缺点和其他型号的挑战椎体稳定的这种方法:1)变异椎通过夹紧相邻背侧棘突喙和尾部的椎板切除可能发生的冲击力的作用下屈服。椎移位的程度取决于冲击和被稳定椎骨( 图1)之间的椎关节的数量。因此,多个关节所涉及的不太稳定的脊柱变; 2)背侧棘突是脆弱的,导致钳衰竭为棘突骨折或夹具脱落的过程的结果;和3)对这些椎骨棘突极短的C3至T1椎骨相比,这些胸韦尔特的布雷,用传统的夹具,这使得难以把握棘突稳定颈椎。

在这里,我们描述了一种新的稳定的脊柱对于成年雌性Sprague-Dawley大鼠制备的C5挫伤性SCI的方法。这种方法可以用于其他级别的脊柱和脊髓,和缀合物的稳定性以及与其他挫伤性SCI的设备,包括纽约大学/多中心动物脊髓损伤研究(NYU / MASCIS)冲击15( 图2)精密系统和仪器仪表,LLC无限地平线(IH)装置16,美国俄亥俄州立大学/电磁脊髓损伤设备1,和路易斯维尔损伤系统仪器(LISA)17,允许在SCI研究广泛使用。

Protocol

1.曝光颈椎椎板的

  1. 清洁外科表面用70%的乙醇,预热用加热垫。放置消毒纱布,棉签和蒸压手术工具在手术区域前盖上无菌手术悬垂表面。使用微珠消毒的手术工具间手术消毒。
  2. 麻醉与氯胺酮(87.7毫克/千克)/甲苯噻嗪(12.3毫克/千克)腹腔(IP)的大鼠。麻醉的正常平面达到当动物不再到脚趾捏刺激响应。皮下注入0.01-0.05毫克/公斤丁丙诺啡和5毫克/公斤卡洛芬之前外科手术。丁丙诺啡然后应每天一次给药,每8-12小时,卡洛芬,第4-7天手术后。
  3. 适用于保护软膏动物的眼睛,以防止手术过程中角膜干燥。
  4. 刮胡子手术区的背从中间胸部区域的鼠的头部的后面,快船的表面。用配有HEPA过滤器真空除去剃毛皮。
  5. 应用优碘溶液的剃区域作为外科擦洗然后清洗,用70%异丙醇擦拭的面积。
  6. 使用手术刀刀片从所述头部的基部尾端至中期胸廓进行3-4厘米中线切口,在皮肤上。
  7. 确定筋膜和皮下肌肉前的中线冬眠腺体在较低的颈部;切穿斜方肌和其他肌肉沿中线以减少出血。
  8. 发现脂肪组织的肌肉底层的两个区域的中线;使用小组织牵缩器之前,胸椎T2被达到棘突的水平切脊柱旁肌肉尾端严格沿中线和单独的肌肉层。
  9. 识别并切掉连接到T2棘突肌肉利用THIS结构作为解剖标志。
  10. 取出T2棘突的软骨尖,改善颈椎的知名度。
  11. 从棘突和C4-T1的椎板横向分开椎旁肌肉;然而,饶肌肉覆盖在C3椎板,以防止出血。
  12. 切开肌肉过度从C4-T1中的薄片沿横向朝对脊柱两侧的面。
  13. 后脊柱薄层露出,将动物在稳定器的U形通道的腹面。
  14. 通过从T 2的地标为T1,C7,C6和C5的最后吻侧计数棘突识别C5椎骨。

2.稳定的椎骨和表演的撞击伤

  1. 定位稳定器的两个不锈钢臂通过将臂的锯齿状边缘的拉泰拉下方暂停动物在C5-6椎( 图1C)升面。固定臂与椎骨到位( 图2B)之后,调节稳定装置,以确保脊柱是水平和居中。最后,通过拧紧稳定的指旋螺丝锁定的怀抱。
  2. 切断C4-5和C5-6棘突和薄片之间的韧带,以确定碳五薄层的边缘。
  3. 用微型咬骨钳,夹远离薄片的一半处的C5右侧为用于脊髓损伤( 图5C-E)。椎板切除后,运输的动物与伤病设备下的稳定。与稳定剂上的安装( 图3A-C)的固定的动物一起精确地对准柱塞上使用侧向微型操纵器(图3)脊髓目标。
  4. 在高倍率下,找到了C5和C6背根进入区(DREZs)在未与杜暴露脊髓背侧表面rotomy。瞄准柱塞在两个识别DREZs的中间,并且中途中线和脊髓( 图5B)的横向边缘之间。
  5. 使用NYU / MASCIS冲击装置配备2.5毫米直径的尖端( 图3A&B),由10克杆X12.5毫米高度下降( 图2A)产生C5半挫伤( 图5B&E)。
  6. 通过视觉上的青紫脊髓( 图5E中 ,箭头)验证的伤害和检查由纽约大学软件12,17( 图6)提供的伤害参数。
  7. 缝合肌肉,用无菌4-0薇乔缝合软组织,然后关闭皮肤切口手术钉(EZ剪辑)。
  8. 适用的抗菌药膏到外科手术部位。
  9. 管理将5.0ml无菌0.9%盐水皮下给动物进行水化。
  10. 将动物在热-controlled环境(再循环热水padcage上加热垫)),与设置在寝具(每天更换湿食品),和一个水瓶具有长喷口为方便放置在笼子的地板上。提供护理,以保证有足够的恢复动物返回家笼前。
  11. 因为这是一个单方面的颈椎挫伤性损伤,动物很可能会失去功能同侧前肢,瞬时,开始在最初的几个星期伤后恢复。然而,对侧的功能应保持不变,因此动物应该可以吃喝无损伤,并在运动和疏导只有轻微受损。

Representative Results

在下面这个协议,一致的和可重复的颈椎半挫伤SCI产生( 图5,6)。使用脊椎稳定剂,以稳定相同椎骨在用于脊髓损伤的水平的横向过程允许这种令人满意的结果。使用这种方法,不仅在目标椎骨的C5,而且相邻的C4和C6均刚性地固定。

纽约大学/ MASCIS软件提供的读出与在x和y轴设置的曲线图,以及支持使用我们的脊椎稳定化方法,以及设备( 图6)。稳定化的这种方法减少损伤的变异可导致从目标组织和脊柱( 图1)的向下移动。损伤后,明确单方面偏蓝血肿的C5和C6 DREZs之间居中是可见的( 图5E)。这些受伤的参数是一致的,从动物到ANI发作根据由纽约大学/ MASCIS软件中提供的读出( 图6)。

由于颈椎半挫伤产生明显的前肢赤字,这种模式非常适合评估前肢功能的能力,如深远,疏导13,和对象操纵18-19。由于后肢运动障碍不太突出,巴索,比蒂和布雷斯纳汉(BBB)运动得分规模4是不适合在这个模型中使用。的功能的结果如下损伤是最显着的在同侧前爪伸肌缺陷,其中,所述鼠表现出“杵”握拳所有数字弯曲18。暴露在相同的损伤程度和脊髓级别的所有动物应该表现出类似的赤字在这个协议中说明的同侧前肢,在正确的伤害。动物不当受伤非常不同的表现形式赤字13,18和持续时间可能会出现。

组织学上,这种模式会产生大量的灰质和白质损伤,在损伤震中和延髓和尾鳍受伤的部位,导致相当多病灶和空洞形成包含几乎完全脊髓伤侧内。大,主要是星形胶质细胞为基础的胶质瘢痕的形成与大量的神经元死亡18病灶边界。

图1
图1:脊柱的灵活性期间挫伤SCI与不同的夹紧方式插图。图A和 B显示灵活性,或者当棘突的背部夹紧,使不当影响和不一致的数据脊柱“收益”。于A所示的图显示在冲击(红色虚线更大的灵活性和大弯箭头)相比,在B中所示(更小的弯曲箭头),因为夹具是从椎板和损伤部位更远。 图C示出了侧向稳定性与我们描述的装置与稳定臂下的横突拧紧其中将执行影响的部位的椎骨。有脊椎的在此过程中没有灵活性,因为所关注的椎骨被完全稳定。

图2
图2:NYU / MASCIS冲击和定制的稳定容器。图A显示了零件和纽约大学/ MASCIS脊髓损伤装置的功能,具有对损伤严重多个杆高度设置(插图); 图BC示出了U形的容器用于保存大鼠和锯齿稳定手臂手术和伤病期间安全稳定脊柱(设计和YP张生产)。

图3
图3:自定义安装系统和横向microadjuster在NYU / MASCIS冲击图A详细介绍了U形稳定大鼠脊髓损伤的定制安装系统的不同组件。注意在图A的横向microadjuster,对于大鼠脊髓损伤为精确对准的关键。 图BC提供的稳定剂的进一步描述无(B)和具有U形的大鼠的容器(C)的相对于其它重要伤病设备的组件(安装系统设计和YPž生产挂起)。

图4
图4:手术稳定装置和附件的各个部件的测量尺寸定制稳定系统的每个部件被加亮显示的尺寸和尺度(A,CD)。胸椎稳定臂(B)中示出,以显示在不同的脊柱外科模型使用这种装置的潜在应用。

图5
图5:手术的地标和准备颈椎半挫伤脊髓损伤。图A和 B描绘正确IMPA正确地标对暴露的大鼠脊髓克拉对齐。合适的冲击点是直接的C5和C6背神经根(延髓-尾)和中线和脊髓(B)的横向边缘之间。 图CE显示,在更高的放大倍率,露出所需的一半的过程中颈髓受伤,经过周密的单侧椎板切除术。此外, 数字D和 E之前和脊髓挫伤损伤后表现出的线。请注意可见出血(E)所造成的影响(黑色箭头)。

图6
图6:。可接受与不可接受的数据读出在与NYU / MASCIS冲击影响(C)的例子。上图(A)和顶部的数据集(B)和误差的不正确的冲击所产生的数据(C)。注意初始高度表示的相当大的误差,并开始撞击一滴的时间,由红色箭头所示和下划线。该软件还提供了已经检测这些参数的(图C的底部),该错误的警告。

Discussion

在这里,我们已经表现出了颈椎的稳定制造方法单侧挫伤SCI在C5。这种稳定化方法增加了创伤解剖学的精度,并产生一致的功能缺损13,18。在依赖于棘突背夹紧其他车型,棘突损害或脊椎夹子脱落的风险是相当高的。这些模型也可以允许相当脊柱移位和从挫伤力和脊柱和椎骨柱( 图1AB)的柔性性质产生。组织得到涂改柱塞组织接触时间,并导致不可预测的损伤力( 图1A-B 6B)。我们的描述椎体稳定还提供了其它好处的外科准备:1)该方法充分稳定下的中心在C 5椎骨手术显微镜这增加椎板切除术( 图1C)的精度; 2)安装在所述U形的稳定剂可以直接从手术位置来定制安装附件,避免了重新安装上的SCI设备动物的过程和节省时间采取内的动物; 3)稳定椎骨的伤害水平,直接背和尾部的损伤可以大大减少所造成的呼吸身体运动的目的网站,另一项措施,以减少可变性。

利用该稳定化方法的主要优点是,得到的减少量,或受冲击时的脊髓和列的腹侧运动。基于对一个挫伤​​简单的物理,冲击力和能量将从杆传送到脊髓,最好用软线在撞击的部位吸收能量。但是,如果线下方的脊柱的产量,因为有可能在背棘突夹紧方法( 图1A&B)所示 ,实际的力施加到被减小的线和可变的,这取决于产量的程度。

虽然这段视频显示的颈椎挫伤性脊髓损伤模型的整个过程中,这篇文章的精髓是引进我们的各种应用在我们的实验室使用的脊椎稳定的方法,专门针对SCI研究。这种稳定装置和方法的修改后的版本已被用于对小鼠SCI 23。这个简单的脊柱稳定的方法是一种用于脊髓损伤的研究非常有用的,我们先前已经用这种方法和设备,以执行胸椎挫伤以及裂伤SCI模型。另一个实验室在这22杂志最近描述了这种形式的稳定的宫颈损伤的变化。综上所述,我们介绍的这款新颖的椎体稳定的方法来几个surgic人的程序产生重复性实验SCI从椎板切除损伤的生产。这种稳定装置的优点不限于颈脊髓挫伤,因为此稳定化方法已适应于各种各样的实验,如帧内脊髓注射,细胞移植,脑脊液采集从延髓池,半切和横断损伤,胸椎挫伤损伤, 体内成像采用双光子显微镜,和脊髓电生理记录。增加的脊柱外科和外伤程序的质量,降低了实验变异性将有助于提供洞察损伤和恢复的真实机制,以及筛选对脊髓损伤的破坏性疾病不同疗法的效果。

Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgements

这项工作是由卫生[NS36350,NS52290和NS50243以X-MX]美国国家研究院​​的支持;霍曼马里乔治捐赠基金;印第安纳州;和露丝L.基施施泰国家研究服务奖(NRSA)1F31NS071863到CLW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132
Dukal Gauze Sponges Fisher Scientific 22-415-490
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Webster Veterinary 07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450
Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261
Antiobiotic Ointment Webster Veterinary 07-877-0876
Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific 1006015
Rongeur Fine Science Tools 16000-14
Surigical Scissors Fine Science Tools 15009-08
Scissors (blunt dissection) Fine Science Tools 14040-10
Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
Large Forceps Fine Science Tools 11024-18
Fine Forceps Fine Science Tools 11223-20
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade #15 Fisher Scientific 10015-00
EZ Clips Fisher Scientific 59027
Sterile sutures Fine Science Tools 12051-10
Instrument Sterilizer Fine Science Tools 14040-10
Surgical Stabilizer Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet) Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device Custom Manufactured W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience
Rutgers, The State University of New Jersey
e-mail: impactor@biology.rutgers.edu

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References

  1. Noyes, D. H. Electromechanical impactor for producing experimental spinal cord injury in animals. Med. Biol. Eng. Comput. 25, (3), 335-340 (1987).
  2. Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. J. Neurotrauma. 9, (3), 197-217 (1992).
  3. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury technique with dynamic sensitivity. J. Neurotrauma. 9, (3), 187-195 (1992).
  4. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C., Anderson, D. K., Faden, A. I., Gruner, J. A., Holford, T. R., Hsu, C. Y., Noble, L. J., Nockels, R., Perot, P. L., Salzman, S. K., Young, W. MASCIS evaluation of open field locomotor scores: effects of experience and teamwork on reliability. Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study. J. Neurotrauma. 13, (7), 343-359 (1996).
  5. Jakeman, L. B., Guan, Z., Wei, P., Ponnappan, R., Dzwonczyk, R., Popovich, P. G., Stokes, B. T. Traumatic spinal cord injury produced by controlled contusion in mouse. J. Neurotrauma. 17, (4), 299-319 (2000).
  6. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  7. Ghasemlou, N., Kerr, B. J., David, S. Tissue displacement and impact force are important contributors to outcome after spinal cord contusion injury. Exp. Neurol. 196, (1), 9-17 (2005).
  8. DeVivo, M. J., Chen, Y. Trends in new injuries, prevalent cases, and aging with spinal cord injury. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, (3), 332-338 (2011).
  9. Onifer, S. M., Rodríguez, J. F., Santiago, D. I., Benitez, J. C., Kim, D. T., Brunschwig, J. P., Pacheco, J. T., Perrone, J. V., Llorente, O., Hesse, D. H., Martinez-Arizala, A. Cervical spinal cord injury in the adult rat: assessment of forelimb dysfunction. Restor Neurol Neurosci. 11, (4), 211-223 (1997).
  10. Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Forelimb motor performance following cervical spinal cord contusion injury in the rat. Exp. Neurol. 117, (3), 287-298 (1992).
  11. Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behav. Brain Res. 119, (1), 1-13 (2001).
  12. Pearse, D. D., Lo, T. P. Jr, Cho, K. S., Lynch, M. P., Garg, M. S., Marcillo, A. E., Sanchez, A. R., Cruz, Y., Dietrich, W. D. Histopathological and behavioral characterization of a novel cervical spinal cord displacement contusion injury in the rat. J. Neurotrauma. 22, (6), 680-702 (2005).
  13. Gensel, J. C., Tovar, C. A., Hamers, F. P., Deibert, R. J., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Behavioral and histological characterization of unilateral cervical spinal cord contusion injury in rats. J. Neurotrauma. 23, (1), 36-54 (2006).
  14. Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp. Neurol. 220, (1), 9-22 (2009).
  15. Gruner, J. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. J. Neurotrauma. 9, (2), 123-126 (1992).
  16. Scheff, S. W., Rabchevsky, A. G., Fugaccia, I., Main, J. A., Lumpp, J. E. Jr Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device. J. Neurotrauma. 20, (2), 179-193 (2003).
  17. Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25, (10), 1227-1240 (2008).
  18. Walker, C. L., Walker, M. J., Liu, N. K., Risberg, E. C., Gao, X., Chen, J., Xu, X. M. Systemic bisperoxovanadium activates Akt/mTOR, reduces autophagy, and enhances recovery following cervical spinal cord injury. PLoS One. 7, (1), e30012 (2012).
  19. Irvine, K. A., Ferguson, A. R., Mitchell, K. D., Beattie, S. B., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A novel method for assessing proximal and distal forelimb function in the rat: the Irvine, Beatties and Bresnahan (IBB) forelimb scale. J. Vis. Exp. (46), 2246 (2010).
  20. Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. J Neurotrauma. 26, (7), 1043-1053 (2009).
  21. Cao, Q., Zhang, Y. P., Iannotti, C., DeVries, W. H., Xu, X. M., Shields, C. B., Whittemore, S. R. Functional and electrophysiological changes after graded traumatic spinal cord injury in adult rat. Exp. Neurol. 191 Suppl 1, S3-S16 (2005).
  22. Lee, J. H., Streijger, F., Tigchelaar, S., Maloon, M., Liu, J., Tetzlaff, W., Kwon, B. K. A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor. J. Vis. Exp. (65), e3313 (2012).
  23. Zhang, Y. P., Walker, M. J., Shields, L. B. E., Wang, X., Walker, C. L., Xu, X. M., et al. Controlled Cervical Laceration Injury in Mice. J. Vis. Exp. (75), e50030 (2013).

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