EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

1EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322
Biology

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Summary

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。 MultiBacはオープンアクセスプラットフォーム、およびその有用性を最大化するために開発された標準的な操作手順として実装されました。

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Berger, I., Garzoni, F., Chaillet, M., Haffke, M., Gupta, K., Aubert, A. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J. Vis. Exp. (77), e50159, doi:10.3791/50159 (2013).

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Abstract

プロテオミクス研究は、前例のない詳細に真核生物のプロテオームの印象的な複雑さを明らかにした。それは今では、細胞内のタンパク質はほとんど孤立実体としてではなく存在するが、ほとんどすべてではない重要な機能のため、セル内組立ラインを形成し、人間の10以上では、多くの他のタンパク質に関連してその生物学的活性を発揮することが一般的に受け入れられている概念です。1 、これらの多アセンブリの機能とアーキテクチャの2知識は優れた品質と詳細な分析のために十分な量のそれらの提供を必要とします。細胞内の多くのタンパク質複合体の不足は、真核生物において、特に、天然のソースからそれらの抽出を禁止し、組換え生産を必要とする。バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)は真核生物タンパク質を製造するために特に有用であることが証明されて、活性は、多くの場合、翻訳後プロセシングに依存する他の一般的に使用される発現系は、しばしばできることサポートしていない。3 BEVSは、目的の遺伝子が交互に選択したタンパク質を産生昆虫細胞培養物を感染させるために挿入された組換えバキュロウイルスを使用します。 MultiBacは、多くのサブユニットを含有する真核タンパク質複合体の製造に特に調整されているBEVSある。4タンパク質およびそれらの複合体を効率よく製造するための極めて重要な前提条件は、理想的として実装することができる発現実験に関与するすべてのステップのための堅牢なプロトコルである標準作業手順書(SOP)と比較的容易に非専門家ユーザーがまた続く。欧州分子生物学研究所(EMBL)におけるMultiBacプラットフォームは、タンパク質の小規模な分析に異種タンパク質の生産特性のために最適化設計されたバキュロウイルスゲノムに遺伝子を挿入することから開始し、多複雑な式実験に関与するすべてのステップのためのSOPを使用しています生産標本。5-8プラットフォームEMBLグルノーブルでのオープンアクセスモードでインストールされており、タンパク質の複雑な研究​​プロジェクトを加速するために学界と産業界から多くの科学者を支援してきました。

Introduction

生物学的活性は、タンパク質および細胞機能を触媒するために協調して作用する他の生体分子のアセンブリによって制御される。顕著な例は、メッセンジャーRNAへのDNAに含まれる遺伝情報を転写する機械があります。ヒトでは、100以上のタンパク質であるRNAポリメラーゼIIや、TFIID、TFIIHおよび他のような一般的な転写因子。9その他の例を含む10以上のサブユニットを持つ大規模な多タンパク質複合体を形成し、遺伝子を転写するために定義され、規制のプロセスで一緒に来るリボソーム、タンパク質合成、または真核生物の核膜を介して生体分子を往復する責任が核膜孔複合体を触媒する多くのタンパク質およびRNA分子からなる。セル内の本質的にすべての多成分のマシンの詳細な建築と生化学解剖はその機能を理解することが不可欠です。原核生物とeukarの構造解明yoticリボソーム、例えば、これらの高分子マシンはセルでの指定機能を実行する方法に前例のない洞察力を得て構成特徴的なイベント。10,11

リボソームは、最大細胞の質量の30%にすると、リボソームから構成されるという事実のため、培養細胞から内因性の物質を精製することにより詳細な研究のための十分な質および量を得ることができる。 RNAポリメラーゼIIは、桁違いにすでに少ない豊富で、酵母培養の多くは千リットルは、転写の中心、この本質的な複合体の詳細な原子のビューを取得するために処理されなければならなかった。他の本質的な複合体の12圧倒的多数でしかし存在している天然の細胞において非常に低い量、従って、天然源材料から十分に浄化できない。このような複合体をレンダリングするために詳細にアクセス可能な構造と機能解析、組換えTEを使用して異種の生産を必要とするchniques。

組換えタンパク質の生産は、生命科学研究に大きな影響を与えた。多くのタンパク質は、組換え生産され、それらの構造および機能は、高解像度で解剖した。構造的ゲノミクスプログラムは、ハイスループット(HT)モードで全体の生物の遺伝子産物のレパートリーに対処するための多くの生物のゲノムの解明を利用している。タンパク質構造の数千人は、このように決定されている。現在までに、組換えタンパク質の生産に最も豊富に使用されるシステムは、E.されている大腸菌 、多くの発現系は、このホストにおける異種生産のために長年にわたって開発され洗練されてきた。 E.のタンパク質産生を可能にするために官能基の過多を保持するプラスミド大腸菌は、商用プロバイダの全体のカタログを埋める。

しかし、E.大腸菌は、多くの真核生物タンパク質を産生することが適さない特定の制限があり、およびpで多くのサブユニットを有する関節タンパク質複合体。したがって、真核生物宿主におけるタンパク質生産はますます近年の選択の方法となっています。真核生物タンパク質を生成するために特によく適したシステムは、研究室で栽培昆虫細胞培養物を感染させるために異種遺伝子を担持する組換えバキュロウイルスに依存するバキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)である。 MultiBacシステムは、特に、多くのサブユニット( 図1)真核生物タンパク質複合体の製造に合わせて調整され、より最近開発BEVSある。 MultiBacが最初に2004年に導入された図13は 、その導入以来、MultiBacを連続洗練されており、処理を簡略化する標的タンパク質の品質を向上させ、一般的に効率的な標準業務手順書(SOP)を設計することにより、非専門家のユーザーにシステムがアクセスできるようにするためにストリーム並ぶ。 4 MultiBacは、ACで、世界中の多くの研究室で実施されているademiaや業界。グルノーブルEMBLで、国境を越えたアクセスプログラムは、自分の研究を進めるために、この生産システムを利用することを望んだ科学者のためMultiBacプラットフォームで専門的なトレーニングを提供するために、欧州委員会によって所定の位置に置かれた。これまでアクセスできていなかった多くのタンパク質複合体の構造および機能はMultiBacで生成試料を用いて明らかにした。以下、4彼らはEMBLグルノーブルでMultiBac施設で稼動しているように、MultiBac生産の本質的なステップは、プロトコルにまとめる。

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Protocol

1。多重遺伝子発現構築物を作成するためのタンデムコンビニアリング(TR)

  1. 共発現戦略を計画 。供与体および受容体に興味のあるあなたの遺伝子を挿入するための設計手法。あなたの体の潜在的な生理的なサブモジュールは、特定のアクセプタとドナーで一緒にグループ化する必要があります。個々のドナーとアクセプターのプラスミドに発現カセットを組み合わせることのBstXIペア7,8は、in silicoで 、関連するすべての構成要素を作成し、実験的な作業に進む前に、徹底的に戦略を検証-ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)で構成される乗算モジュールを使用します。例えば、目的の遺伝子は、HEまたは他の制限部位と正しいオープンリーディングフレーム(ORF)の存在が検証する必要があるが含まれていないか確認してください。タンパク質産生量ならびに任意のEXIの除去を改善するために昆虫細胞のコドン使用頻度およびmRNAの二次構造のために最適化合成遺伝子の順序を考慮HE目的の遺伝子からサイトを刺す。柔軟性のある、または露出したn-または選択のあなたの蛋白質のC末端に関する文献からのデータに基づいて、精製タグを配置することを検討。個々のタンパク質の相対量は、複雑で化学量論の問題のために制御する必要がある場合は複雑で、いくつかのタンパク質サブユニットの生産を目指すポリ戦略を適用することを検討。4詳述"ハウツー"文書(電子ラボ帳が推奨されます)を含むを準備すべての完全な多重遺伝子構築物(複数可)に至るまで、プロジェクトの実験手順を投影。バーガーグループのホームページ(からダウンロードできCRE-ACEMBLERソフトウェアを使用して、例えばCRE-のLoxP融合プラスミドの電子ファイルを作成www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler )。
  2. 選択したドナーに興味のあるあなたの遺伝子を挿入し、制限酵素とリガーゼを用いることにより、又は、代替的に、公開プロトコルに従ってライゲーションの独立した方法を用いて、アクセプタ。5,6,14は、液体ハンドリングワークステーションへのアクセス権を持っている場合は、生成される構築物の多数(予定がある場合コンビナトリアルアプローチのためなど)リキッドハンドリングワークステーションが使用できない場合はバーガーグループ( 2)。14,15によって開発され、実装されロボットスクリプトの使用を検討し、マイクロタイタープレートを使用して手動操作は、ファッションのようにHTにおいて遺伝子の挿入を可能にします。
  3. 表現のサブユニットの化学量論を制御する必要性によって課される制約が顕在化することができる。タンパク質複合体の個々のサブユニットの化学量論的に不均衡な発現レベルの場合には、sであけ単一の大規模のORFであなたの体のいくつかのサブユニットと特異的プロテアーゼ(例えばタバコエッチウイルスNIAプロテアーゼ)を結合させるためにポリ戦略を適用することを検討pecificタンパク質分解のサイトは、多くのサブユニットと非常に大規模な複合体を持っていると広く、個々のサブユニットの分子量の範囲の場合。4,8つを共発現または単一の発現カセットを持ついくつかのポリタンパク質を検討します。そのタンパク質が低い歩留まりによって特徴づけされている場合はポリで、またはいくつかの同一の発現カセットと同じタンパク質をコードするいくつかの遺伝子を共発現することを検討してください。4,13は
  4. 制限マッピング(オプションで高スループット)とシーケンシングによりクローニングすべてのドナーとアクセプター構造を検証します。選択肢の多重遺伝子発現コンストラクトを生成するCRE-のLoxP組換えによってドナー - アクセプターの組み合わせを融合に進みます。制限マッピングによりアクセプタドナー融合プラスミドを精製した検証、CRE-ACEMBLERまたは基準と同様のプログラムで作成された電子のシーケンスを使用しています。
  5. -20℃で精製し、検証ドナー、アクセプタとドナー·アクセプター融合を保存したり、80℃アーカイブPLasmids、後で使用するために慎重にそれらの配列(Microsoft Excelのは、FileMaker、他)。

2。複合多重遺伝子バキュロウイルスの生成、増幅およびストレージ

  1. DH10ウイルスゲノムを保有する細胞やトランスポゾンTn7転位のために必要な機能に変換することによって、多重遺伝子導入ベクターMultiBacバキュロウイルスゲノムを統合します。 MultibacバキュロウイルスゲノムがトランスポゾンTn7統合を先行する生体内のCre 反応して、独自のloxP部位への関心の特定の遺伝子(YFPマーカー、シャペロンなど)(トランスポゾンTn7結合部位より遠位ゲノムに設計)でプリロードできることに注意してください。 13トランスポゾンTn7移調した後、目的の遺伝子を含む複合バキュロウイルスと細胞は青/白スクリーニング(β-ガラクトシダーゼのα-相補性の喪失に成功トランスポゾンTn7移調結果によって選択されるため、正しいトランスポゾンTn7移調とコロニーが選択的に白のままガーX-galを含むプレート)及びゲノムはアルカリ溶解し、エタノール/イソプロパノール沈殿によって調製される。5,6
  2. トランスフェクションおよび初期ウイルス産生 。滅菌フードに代えて6ウェル組織培養プレート。対数期たSf21昆虫細胞培養物から、説明したように培養培地中で混合精製バキュロウイルスゲノムおよびトランスフェクション試薬を添加することによりウェルとトランスフェクトの細胞のアリコートのうちシード。媒体を除去することにより、48〜60時間後に収穫6の初期ウイルス(高品質、低力価ウイルスV 0、ウェルあたり通常3ミリリットル)。新鮮なメディアを補完し、さらに2〜3日後のタンパク質生産(と、YFPマーカーが蛍光について、存在する場合)のためのテスト。6,7
  3. ウイルスの増幅、低MOI養生法 。小(100〜250ミリリットル)三角シェーカーフラスコ撹拌で対数増殖期にある細胞25〜50ミリリットル(1mlあたりの細胞密度は<1×10 6個の細胞)を感染させるために、V 0ウイルスを使用軌道プラットフォームシェーカー上で( 図3)。細胞をカウントし、細胞が倍加(増殖停止を)停止するまで24時間毎に分割。 (セルあたりのウイルス粒子の感染すなわち番号の多重度)MOI低いレジメン従い細胞を倍増する必要があります(少なくとも)一回(MOI <1)を、そうでなければ、V 0より小さい音量で実験を繰り返した。通常は、V 0 3mlを0.5×10 6細胞/ mlの密度でたSf21昆虫細胞を25mlを感染するために使用される。これは有害な防ぐために必要不可欠である目的の異種遺伝子の損失につながることができるウイルスの過剰増幅と自動削除。細胞をペレット化し、ウイルスを含む培地を除去することにより48-60時間後に収穫V 1ウイルス(25〜50ミリリットル)。 6、1×10 6個の細胞ごとに12または24時間を削除しペレット化し、タンパク質の生産とマーカータンパク質(YFP)信号を検証すること。によってYFPとタンパク質生産のための新鮮な培地とテストと補足、(へウイルスを増幅V 2)は、さらに大きいの発現量は、上記の低MOIレジメン(細胞がV 1と感染後に少なくとも一度は倍増しなければならない)尊重V 1ウイルスに2 Lシェーカーフラスコで400ミリリットルの細胞にまで感染させることにより目的としている場合。厳密に興味のある遺伝子を含む、もはや欠陥ウイルスの蓄積を避けるためないように増幅中タンパク質の生産とマーカータンパク質シグナルをテストします。各増幅で蓄積5-7使用細胞ペレットは、関心の発現タンパク質複合体の精製プロトコールを確立するために、既に手順。
  4. 生産ウイルスのBIICストレージ 。我々は強く、組換えウイルスの修飾( 例えば 、目的の遺伝子の損失)を防止し、高発現を維持するために、BIIC(B aculovirus- 私はCエルボをnsect nfected)メソッドを使用して生産ウイルスとしてV 2ウイルスを保管することをお勧めレベル。増殖停止後の16ペレット感染細胞を24時間が観察さ-彼らがメディアに(出芽によって)解放される直前に、この段階で細胞が完全なウイルス粒子を含んでいます。液体窒素でメディアや細胞ペレットの凍結アリコートを取り出し、無期限に保管してください。7,16は

3。タンパク質の生産と下流の処理

  1. 大(r)は文化や監視YFPに感染 。生産ラン(通常2 Lフラスコ中の400ミリリットル)のため大きな細胞培養に感染するV 1、V 2または冷凍BIICアリコートを使用してください。低MOI養生法(感染した文化が少なくとも一度は倍増するような感染症に使用されたウイルスの音量を調節する)に準拠しています。フラスコの数を乗じて、必要に応じて感染文化ボリュームを拡大します。 YFPマーカータンパク質が存在する場合は、定義された間隔で1×10 6細胞、ペレットを回収し、プラトーインドールを達するまで細胞を溶解し、YFP信号の変化を監視する最大の組換えタンパク質産生をicating。 YFPレベルは、蛍光信号( 例えばテカンSPECTRAFluor)を記録することのできる標準的な96ウェルプレートリーダーで測定することができる。この段階で細胞を回収。 -20°C(短期)または-80°C(長期)で保存細胞ペレット。
  2. 細胞溶解と分別 。あなたの蛋白質の要件(凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、他)に合わせて、選択したお好みの方法で細胞を溶解。興味のあるタンパク質の存在のための5-7分画細胞質と核とテスト。タンパク質精製を簡略化するためにその結果に基づいて精製プロトコールを開発する。あなたのタンパク質が核内に存在する場合、高KClの条件の下で核画分からタンパク質を抽出するために浸漬手続きを適用することを考えてみましょう。7,18
  3. タンパク質精製(マイクロスケール、大規模)。細胞培養のしばしば小さなボリュームが(10または25 ml)のSUであることに注意してくださいバキュロウイルス/昆虫細胞系(L培養物より当たりのタンパク質しばしば10〜100 mg)の中で異種タンパク質の典型高い又は非常に高い生産レベルに起因する関心のあるタンパク質の実質的な量の精製細胞ペレットを得るためのfficient。マイクロ精製(マルチウェルプレート、マイクロチップ法、GEヘルスケアÄKTAmicro系、その他)と一緒に、それはまた、多くの場合、ナノリットル規模ハイスループット結晶化(HTXは、目的のタンパク質との複合体の十分な量の生化学的および活動データを得ることができると)。小さなにおけるイオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと組み合わせて、精製を容易にするために複雑なあなたの蛋白質の露出したサブユニットの金属アフィニティー精製(クロンテックタカラTALON、キアゲンNiNTA金属キレート樹脂)とオリゴヒスチジン(6-10残基)タグを使用することを検討して例えばÄKTAmicroまたは類似少量浄化機( 図4を使用してボリューム

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Representative Results

MultiBacシステムによって達成異種タンパク質の強力な同時発現は、 図1d(懸濁細胞培養物を感染後48時間を取ったプローブ)に示されている。過剰発現したタンパク質のバンドは、全細胞抽出物(SNP)と清澄化ライセート(SN)で明確に識別されています。産生されたタンパク質材料の質と量は、多くの場合、 図1eに示されるように、有糸分裂チェックポイント複合MCCなどのタンパク質複合体の構造決定を可能にするのに十分である。17

図2は、ロボット支援タンデムコンビニアリング(TR)による遺伝子組立実験のワークフローを表示します。堅牢なDNA組立体プロトコルは、多重遺伝子発現コンストラクトの並列化された組立用ロボットルーチンにスクリプトであった。個々のロボットのステップは、スナップショット( - IV図2c、I)に示されている。組み立てられるDNA成分がPCRによって生成され、品質によって制御される電子ゲル( 図2D、左)は、組み立てられた多重遺伝子構築物は同様にプライマーの特別に設計されたセット( 図2D、右)を用いてPCRによって検証されます14,15。

組換えバキュロウイルスの生成と増幅は、標準的な操作手順(概略図3aに表示されます)に従う。単層で培養された細胞のスナップショット(図3b、I.&II。)MultiBacウイルス感染後に示されている。

組換えタンパク質複合体の下流の処理は、次のようなワークフロー小規模システムに統合することにより、複合体のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)が続くアフィニティー精製のためのマルチウェルプレート又はマイクロチップベースのクロマトグラフィーを用いて小型化することができるÄKTAmicro(図4a)。 〜700 kDaのヒト転写因子複合体の代表的なSECプロファイルが示されている。を用いて精製したサンプル小規模でÄKTAmicroは電子顕微鏡(図4b)を含む、生化学的および生物物理学的手段による特性評価のために通常は十分です。

図1
図1。多複雑な生産のためのMultiBacプラットフォーム技術。 (a)は 、目的の遺伝子は青/白スクリーニングと一緒にトランスポゾンTn7転置を用いて、Multibacバキュロウイルスゲノムに組み込まれている。ウイルス骨格上のLoxP部位は、例えば蛍光マーカータンパク質などのさらなる機能性の添加は、ウイルス性能および異種タンパク質の生産を監視することができ、(b)は、バキュロウイルスは、細長い棒状を採用し、収容するように拡張することができる柔軟な包絡線によって特徴付けられる大(> 130キロバイト)環状二本鎖DNAゲノム。ゲノムに大きな異種遺伝子挿入はB許容されるyはエンベロープを長くする。(c)のオービタルシェーカープラットフォーム上の標準三角フラスコがheterologuesタンパク質生産のための大規模な昆虫細胞培養物を成長させるために使用することができます。(d)の MultiBacシステムが効率的で、すでに多くの場合はっきりと表示されている組換えタンパク質生産全体を細胞抽出液(SNP)(e)の有糸分裂チェックポイント複合体の構造はMultiBacシステム17を用いて製造された試料から成長した結晶からのX線回折により明らかにしたより大きい数字を表示するには、ここをクリック

図2
図2。 (自動)タンデムコンビニアリング(TR)。 (a)は、タンデムコンビは、MULTを組み立てるためのドナーとアクセプターの合成プラスミドDNA分子の小さなアレイを利用するというigene発現構築物は、必要に応じてロボット支援モードで液体ハンドリングワークステーション(右)を用いて(b)の TRワークフローが示されている。 SLICは、シーケンスとライゲーション独立クローニングを表し、Creのは、関心のある遺伝子がSLICによって挿入されたにCRE-のLoxP融合連結供与体および受容体の略です。多重遺伝子発現は、その後MultiBacバキュロウイルスゲノムに組み込まれ、組換えウイルスに感染した昆虫細胞培養物中の小さなや大規模発現のために使用されるタンデムSLICしたCreを使用して、このコンビプロシージャによって生成構築する。ロボット支援TRの(c)のスナップショットプロセスは鋳型DNAおよびプライマー(I)の規定を含むように示されている、マルチウェルプレート(II)、DNAのPCR増幅(III)及び多重遺伝子の調製におけるPCR反応の調製は、マルチウェルプレート中のアルカリ溶解によって細菌培養で増殖させた構築物( IV)は、(d)は TRに使用PCR産物は、私たちによって可視化される電子ゲル系(左)る。完成した多重遺伝子構築物は、電子ゲル(右)にロードされた分析のPCR反応によって検証されます。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図3
図3。 MultiBacウイルスの発生、増幅、ストレージ。 (a)は、EMBLグルノーブルにおけるMultiBacプラットフォームの標準操作手順(SOP)が概略図で示されている。組換えウイルスはMultiBac青白スクリーニングによって同定し、細菌培養物から調製される。初期のトランスフェクションは、昆虫細胞の単層(個のSf21、たSf9、Hi5は、他)を播種した6ウェルプレート上で行われます。ウイルスは三角シェーカーで増幅標的タンパク質が生成される。ウイルスは感染した昆虫細胞(BIIC)の凍結アリコートで保存されています。蛍光は、分析ツールかのように記録されYFP(又は他の蛍光タンパク質)MultiBacバキュロウイルスゲノム上に存在するのloxP部位に、例えばマーカータンパク質として統合されている。(b)に MultiBacバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞のスナップショットが示されている。細胞は増殖を停止し、(I.)のサイズが増加します。細胞融合は(II)が観察される。メディアへの感染細胞から出芽ウイルスを採取し、タンパク質の複雑な生産(III、IV)のためのより大きな細胞培養を感染させるために使用されます。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図4
図4。タンパク質複合体の生産とダウンストリーム処理。タンパク質複合試料は、すでに好都合例えば多層または小型化された精製方法を利用して小規模な初期細胞培養物から精製することができるマイクロチップを必要に応じて少量クロマトグラフィーシステム(左)と一緒にベースの浄化、。多くの場合、すでにこれらの"分析"浄化ラン(中央)の収率は、電子顕微鏡(右)など、様々な手段によって精製複合体の構造と機能を解析するために十分である。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

図2図3のビデオスナップショットは多重遺伝子発現のcDNAからロボット支援世代から全体のプロセスを説明すると、タンパク質生産のための昆虫細胞培養の感染にすべての方法を構築します。新しい試薬(プラスミドおよびウイルス)と堅牢なプロトコルは、SOPのに頼ってパイプラインを有効にするために開発されてきた。パイプライン全体は、グルノーブルのEMBLにおけるプラットフォーム技術として実装されています。 MultiBacプラットフォームは多の研究に従事している学界と産業界から多くの科学者によってアクセスされました。訓練へのアクセスは、欧州委員会(P-CUBE、BioSTRUCT-X)によって資金を供給専用アクセスプログラムでサポートされています。

MultiBacシステムを利用してタンパク質の複雑な表現を行うためのSOPの可用性は、非専門家のユーザーに、この技術は簡単に従順でレンダリングしました。ロボット支援操作が参加者を中多複雑な生産を加速ウラルときに複合体の十分な数は、関心のある試料の例示的変異体および変異体のために、並列に生成される必要がある。 SOPのの可用性からしかし、低〜中のスループットで手動操作も大幅なメリット。十分に堅牢なプロトコルは、ロボットを使って互換性があることが得られたまで、我々の経験では、ロボティクス·ルーチンに成功したスクリプトかもしれないプロセスは多大な労力と最初に洗練する必要がありました。そのようなプロトコルは、当社のSOPの基礎を形成する。5,6,14,15は、確かに、ロボットのためのこれらの堅牢なプロトコルの実装は、我々の研究室でも、手動操作の非常にかなりの効率向上につながる。

多くのタンパク質およびタンパク質複合体はされており、我々が開発し、近くに500研究所には、世界全体では、試薬を得たとMultiBacシステムを用いて製造されています。 MultiBacは、構造生物学だけでなく、多くのOTHだけでなく、研究を触媒している大規模なアセンブリ内のタンパク質間の相互作用を調査するか、または利用する生命科学のERエリア。 MultiBacはまたによってさらに最近4、MultiBacはまた、哺乳動物細胞および細胞培養物に遺伝子を送達するために使用されている。有用なワクチン候補となり得るウイルス様粒子を含む、相当な薬理学的関心のあるタンパク質標的を生成するために使用される、あるいは全体の生物されている遺伝子治療。4私たちは、このような貢献に示されるようなアプローチは多アセンブリと健康と病気における細胞プロセスの基礎を形成する生体高分子の複雑な相互作用が関与する研究の多くの分野に有用であることが証明されることを期待しています。

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Disclosures

IBは、ここに記載された技術の一部を詳述する特許および特許出願に発明者である。

Acknowledgements

私たちは、クリストフBieniossek、サイモンTrowitzsch、ダニエル·フィッツジェラルド、雄一郎高木、クリスティSchaffitzel、イヴォンヌウンツィケル、ティモシーリッチモンド、ヘルプやアドバイスバーガー研究室のすべての過去と現在のメンバーに感謝。 MultiBacプラットフォームとその開発がされており、寛大にスイス国立科学財団(SNSF)、アジャンスナショナル·デ·ルシェルシュ(ANR)とセンターナショナル·デ·ルシェルシュ科学研究(CNRS)と欧州委員会(EC)を含む、資金提供機関によってサポートされていますフレームワークプログラムで(FP)6と7。国境を越えたアクセスのサポートはEC FP7プロジェクトP-CUBE(によって提供されますwww.p-cube.eu )とBioStruct-X( www.biostruct-x.eu )。科学フランス語省は特にヴェスD'アベニールプロジェクトFRISBIを通してEMBLでMultiBacプラットフォームをサポートするため認められている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bluo-Gal Invitrogen 15519-028 (1 g)
Tetracycline Euromedex UT2965-B (25 g) 1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine Euromedex EU0420 (25 g) 1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine SIGMA G3632 (5 g) 1,000X at 10 mg/ml
IPTG Euromedex EU0008-B (5 g) 1,000X at 1M
Cre-recombinase New England BioLabs M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent Roche 06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect Thermo Scientific SH 30913.02
6-well plate Falcon Dominique Dutscher 353046
2 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357507
5 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357543
10 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357551
25 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357535
50 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357550
50 ml tube Falcon Dominique Dutscher 352070
15 ml tube Falcon Dominique Dutscher 352096
1.8 ml cryotube Nunc Dominique Dutscher 55005
100 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211917
250 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211918
500 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211919
2 L shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211921
Certomat Orbital Shaker + plateau Sartorius 4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L Fisher Scientific M76801
Biological Safety Cabinet Faster Sodipro FASV20000606
Optical Microscope Zeiss 451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells Invitrogen B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus TECAN
10 μl conductive tips (black), TECAN 10 612 516
200 μl conductive tips (black) TECAN 10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml TECAN 10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted Eppendorf 0030 128.648
96 well V bottom, non sterile BD falcon 353263
96 deepwell plate color natural, PP) Fisher M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom Greiner 655101
96 deepwell plate Thermo scientific AB-0932
24 well blocks RB Qiagen 19583
DpnI restriction enzyme NEB R0176L 20 U/uL
NEBuffer 4 10X NEB B7004S
2X phusion mastermix HF Finnzyme ref F-531L
2X phusion mastermix GC Finnzyme ref F-532L
DGLB 1.5X homemade 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel Life Technologies 10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel Life Technologies 10068-013
E-gel 48 1% agarose GP Life Technologies G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit Macherey Nagel 740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract Macherey Nagel 740 707.2
Gotaq green master mix Promega M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified Novagen 70099-3
DTT 100 mM homemade
Urea 2 M homemade
EDTA 500 mM pH 8.0 Homemade
LB broth (Miller) 500 g Athena ES 103

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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