MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

1EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Белковые комплексы катализируют ключевые клеточные функции. Подробные функциональные и структурные характеристики многих важных комплексов требует рекомбинантного производства. MultiBac является бакуловирус / клетка насекомого разработана специально для выражения эукариотических белков и их комплексов. MultiBac был реализован как открытая платформа доступа, и стандартных оперативных процедур разработаны для максимального использования ее полезности.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Berger, I., Garzoni, F., Chaillet, M., Haffke, M., Gupta, K., Aubert, A. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J. Vis. Exp. (77), e50159, doi:10.3791/50159 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Протеомики исследования показали впечатляющие сложности эукариотических протеомов в беспрецедентных деталях. Теперь это общепринятое понятие, что белков в клетках основном существуют не как изолированные сущности, но проявляют свою биологическую активность в сотрудничестве со многими другими белками, у человека десять и более, образуя сборочных линий в клетке для большинства, если не всех жизненно важных функций. 1 , 2 Знание функции и архитектура этих мультибелковых сборки требует их положение высшего качества и в достаточном количестве для детального анализа. Недостатком многих белковых комплексов в клетках, в частности у эукариот, запрещает их извлечения из природных источников, и требует рекомбинантной продукции. Вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs) оказалась особенно полезной для производства белков эукариот, деятельность которых зачастую зависит от посттрансляционное обработки, которые обычно используются другие системы экспрессии часто можетне поддерживают. 3 BEVs использовать рекомбинантный бакуловирус, в который ген был вставлен инфицировать насекомое клеточных культур, в свою очередь продуцировать белок выбора. MultiBac является BEVs, которая была разработана специально для производства эукариотических белковых комплексов, которые содержат множество субъединиц. 4 жизненно важным условием для эффективного производства белков и их комплексов являются надежными протоколов для всех операций, связанных выражение эксперимент, который идеально может быть реализован как стандартные операционные процедуры (СОП) и последуют и неспециалисту пользователей сравнительно легко. MultiBac платформы на Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) использует СОП для всех операций, связанных мультибелковый сложный эксперимент выражения, начиная с введения генов в геноме инженерных бакуловирусные оптимизирован для гетерологичными свойствами производства белка мелким анализа белка образцов, полученных. 5-8 платформыустановлен в открытом доступе в режиме EMBL Гренобля и поддержал многие ученые из академических и промышленных ускорить белковый комплекс исследовательских проектов.

Introduction

Биологическая активность контролируется сборки белков и других биомолекул, которые действуют совместно, чтобы катализировать клеточных функций. Известные примеры включают механизм, который расшифровывает наследственной информации, содержащейся в ДНК в РНК. У людей, более 100 белков собрались вместе в определенной и регулируемым процессом, чтобы расшифровать гены, образуя крупные комплексы мультибелковых с 10 и более субъединиц РНК-полимеразы в том числе II и общих факторов транскрипции, таких как TFIID, TFIIH и другие. 9 Другие примеры рибосомы, состоящие из многих белков и РНК, который катализирует синтез белка, или ядерного комплекса пор, который отвечает за челночные биомолекул посредством ядерной оболочки у эукариот. Подробные архитектурные и биохимические вскрытия практически всех многокомпонентных машин в клетке важно понять их функции. Выяснение структуры прокариотических и eukaryotic рибосомы, например, составили отличительной чертой событий получая беспрецедентное понимание, как эти машины макромолекулярными выполнять свои определенными функциями в клетке. 10,11

Рибосомы могут быть получены достаточные количества и качества для детального исследования путем очистки эндогенного материала из культивируемых клеток, в связи с тем, что до 30% от клеточной массы состоит из рибосом. РНК-полимераза II уже менее обильными на порядки, и многие тысячи литров дрожжевой культуры должны были быть обработаны для получения детальной атомной связи с этим необходимо, чтобы комплекс центральной транскрипции. 12 Подавляющее большинство других важных комплексов, однако в настоящее значительно ниже суммы в нативных клетках, и таким образом не может быть очищена от родных адекватно исходный материал. Оказывать такие комплексы доступными для детального структурного и функционального анализа требует гетерологичными производства с помощью рекомбинантных TEchniques.

Рекомбинантного белка оказала большое влияние на жизни научных исследований. Многие белки были получены рекомбинантным, а их структура и функция расчлененный с высоким разрешением. Структурной геномики программ воспользовались выяснение геномы многих организмов для решения репертуаром генов произведения целых организмов в высокой пропускной способности (HT) режиме. Тысячи белковых структур таким образом, были определены. На сегодняшний день наиболее плодотворно использовать системы для производства рекомбинантных белков была E. палочка, и многие системы экспрессии были разработаны и уточнены в течение многих лет для гетерологичной производства в этой хоста. Плазмиды, несущие множество функциональных чтобы белка в E. палочка заполнить все каталоги коммерческих провайдеров.

Тем не менее, E. палочка имеет определенные ограничения, которые делают его непригодным для производства многих эукариотических белков и в рсуставной белковые комплексы со многими субъединиц. Поэтому белка в эукариотических хозяев становится все более предпочтительным методом в последние годы. Особенно хорошо подходит система для получения эукариотических белков вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs), которая опирается на рекомбинантного бакуловируса проведение гетерологичных генов инфицировать насекомое клеточных культур выращивали в лаборатории. Система MultiBac является более недавно разработанных BEVs который особенно приспособлены для производства эукариотических белковые комплексы со многими субъединиц (рис. 1). MultiBac был впервые представлен в 2004 году. +13 С момента своего появления, MultiBac была постоянно совершенствуется и усовершенствованной для упрощения обработки, улучшения качества белка-мишени и в целом делает систему доступной для неспециалиста пользователей путем разработки эффективных стандартных операционных процедур (СОП). 4 MultiBac была реализована во многих лабораториях во всем мире, в соотademia и промышленности. На EMBL в Гренобле, транснациональных программах доступа были введены в действие Европейской комиссии обеспечить подготовку специалистов в MultiBac платформы для ученых, которые хотели бы использовать эту систему производства для продвижения своих исследований. Структура и функции многих белковых комплексов, которые были до сих пор не доступны было выяснено использованием образцов, полученных с MultiBac. 4 В дальнейшем основные этапы производства MultiBac сведены в протоколы, как в эксплуатацию в MultiBac объекта в EMBL Гренобле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Тандем Recombineering (TR) для создания конструкций Multigene Выражение

  1. Планирование совместной экспрессии стратегии. Проектный подход для вставки вашего интерес генов в доноры и акцепторы. Потенциальные физиологические подмодулей вашего комплекса должны быть сгруппированы по конкретным акцепторы и доноры. Используйте Умножение модуль, состоящий из самонаведения эндонуклеазы (HE) - BstXI Объедините пары кассет экспрессии на индивидуальных доноров и акцепторов плазмид 7,8 Создать всех соответствующих конструкций в кремнии и утвердить стратегию тщательно, прежде чем приступить к экспериментальной работе.. Например, представляющих интерес генов должен быть проверен, чтобы не содержать ОН или других сайтов рестрикции и наличие правильных открытые рамки считывания (ОРС), должны быть проверены. Рассмотрим заказе синтетические гены насекомого оптимизирован для использования кодонов мРНК клетки и вторичные структуры в целях повышения уровня белка, а также удаление любых Exiжало высокопроизводительных станций от генов интерес. Рассмотреть вопрос о размещении очистки тегов, основанных на литературных данных о гибком или подвергается N-или С-концы ваших белков выбора. Рассмотрим применение полипротеине стратегии, которые направлены на производство нескольких субъединиц белка в Вашей сложной, если относительные количества отдельных белков необходимо контролировать из-за стехиометрии вопросы в комплексе. 4 подготовить подробные "как-бы" документ (электронная книга лаборатории рекомендуется), содержащий все прогнозируемые экспериментальных этапов проекта, ведущих к полной конструкции мультигенное (ов). Создать электронные файлы CRE-LoxP плавленого плазмид например, путем использования CRE-ACEMBLER программное обеспечение, которое можно скачать на домашней странице группы Бергер ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler ).
  2. Вставьте интерес генов в отдельных доноров иАкцепторы с помощью ферментов рестрикции и лигазы, или, наоборот, с помощью независимых методов перевязки после опубликованных протоколов. 5,6,14 Если у вас есть доступ к наливных рабочей станции и если вы планируете большое количество конструкций, которые будут созданы ( например, для комбинаторной подходы) рассмотреть возможность использования робототехники скрипты разрабатываются и осуществляются Бергер группы (рис. 2). 14,15 Если наливных рабочая станция не доступна, ручное управление использованием микропланшет позволяет гену вставки в HT, как мода.
  3. Ограничений, связанных с необходимостью контроля стехиометрии выразил субъединиц может материализоваться. В случае стехиометрически несбалансированные уровни экспрессии отдельных субъединиц белка комплекса, рассмотреть вопрос о применении полипротеина стратегии соединить несколько субъединиц ваш сложной и специфической протеазы (например вируса гравировки табака NIA протеаза) в один большой ORF, разнесенных на секpecific протеолитических сайтов. 4,8 Рассмотрим коэкспрессирующей одного или нескольких полипротеины с одной кассеты экспрессии если у вас есть очень большой комплекс со многими подразделениями и широко диапазоне молекулярных масс отдельных субъединиц. Рассмотрим совместной экспрессии нескольких генов, кодирующих тот же белок в полипротеина или несколько одинаковых экспрессионные кассеты, если это белок характеризуется низким выходом продукции. 4,13
  4. Проверить все донора и акцептора конструкции клонировали ограничение отображения (необязательно в высокой пропускной способности) и последовательности. Перейдите на предохранитель донор-акцепторного комбинаций пу-LoxP рекомбинации для генерации мультигенные выражения конструкции выбора. Подтвердить очищенной акцепторного доноры плазмид слияния ограничением отображения, используйте электронные последовательности создан CRE-ACEMBLER или аналогичных программ в качестве эталона.
  5. Хранить очищенные и утверждены Доноры, акцепторы и доноры-акцепторных слияния при -20 ° С или -80 ° С. Архив PLasmids и их последовательности (Microsoft Excel, Filemaker и др.) тщательно для дальнейшего использования.

2. Композитный Multigene Бакуловируса генерации, усиления и хранения

  1. Интеграция векторов мультигенные передачи MultiBac бакуловирусные генома, превращаясь в DH10 клетки, несущие вирусного генома и функциональности необходимой для Tn7 транспозиции. Следует отметить, что Multibac бакуловирусного генома могут быть предварительно загружены с особым интерес генов (YFP маркер, сопровождающих и т.д.) в своем месте LoxP (инженерии в геном дистальнее Tn7 места прикрепления) путем Cre в естественных условиях реакции предшествующих Tn7 интеграции. После 13 Tn7 транспозиции, клетки с композитными бакуловирусе содержащие гены интерес выбираются синий / белый скрининг (успешном Tn7 транспозиции приводит к потере α-комплементацией β-галактозидазы, поэтому колонии с правильными Tn7 транспозиции остаются белыми на селективныегр чашках, содержащих X-гал) и геном получают путем щелочного лизиса и этанол / изопропанол осадков. 5,6
  2. Трансфекции и начальное производство вируса. Место 6-и культуре ткани пластины в стерильную капотом. Из лог-фазе Sf21 культуры клеток насекомых, семена из аликвоты клеток в лунках и трансфекции добавлением очищенной бакуловирусного генома и реагента для трансфекции смешаны в культуральную среду, как описано. 6 урожая начальный вирус после 48-60 часов, удаляя среды ( высокое качество, низкий титр вируса V 0, обычно 3 мл на лунку). Дополнение свежей среды, и испытание для продукции белка (и, при YFP маркер присутствует, по флуоресценции) после дополнительных 2-3 дней. 6,7
  3. Усиление вируса, низкий МВД режима. Используйте V 0 вирусом заразить 25-50 мл клеток в логарифмической фазе (плотность клеток <1x10 6 клеток на мл) в небольшом (100-250 мл) колбы Эрленмейера шейкере взволнованнымОрбитальные шейкеры на платформе (рис. 3). Граф клеток и разделить каждые 24 часа, пока клетки остановить удвоением (пролиферация ареста). Последующие низкой MOI (множественностью заражения т.е. количество вирусных частиц на клетку) схеме: Клетки должны удвоить (по крайней мере) один раз (MOI <1), в противном случае повторить эксперимент с меньшим объемом V 0 добавлены. Обычно 3 мл V 0 используются для инфицирования 25 мл Sf21 клетках насекомых с плотностью 0.5x10 6 клеток / мл. Это необходимо для предотвращения вредного чрезмерного усиления и автоматического удаления вирусов, которые могут привести к потере гетерологичных генов, представляющих интерес. Урожай V 1 вирус (25-50 мл) после 48-60 часов по гранулированию клетки и удаления носителя, содержащего вирус. Дополнение свежей средой и тест на YFP и белка, удалив 1x10 6 клеток каждые 12 или 24 часа, гранулирование и проверки производства белка и маркерного белка (YFP) сигнала. 6, Amplify вируса (вV 2) далее, если большие объемы выражения направлены на, заражая до 400 мл клетки в 2 л шейкер колбы с V 1 вирус уважении выше низкого МВД режима (клетки должны удвоиться по крайней мере раз после заражения V 1). Строго Производственное испытание белка и сигнал маркерного белка в процессе амплификации, чтобы избежать накопления дефектных вирусов больше не содержащий ваши гены интереса. 5-7 Использование клеточных осадков накапливается на каждом шагу уже амплификации для создания протоколов для очистки белкового комплекса выразили интерес.
  4. ВПс хранения продукции вируса. Мы рекомендуем, чтобы хранить V 2 вирус как производство вируса с помощью ВПс (B aculovirus-я nfected я nsect с локтя), способ для предотвращения модификации (например, потеря интересующего гена) рекомбинантного вируса и сохранить высокий уровень экспрессии уровеньS 16 пеллетах инфицированных клеток через 24 часа после ареста распространения наблюдается -. на данном этапе клетки содержат полных вирусных частиц как раз перед они будут освобождены (почкованием) в средствах массовой информации. Удалить информации и замораживание аликвоты клеточного осадка в жидком азоте и хранить до бесконечности. 7,16

3. Производство белков и последующей обработки

  1. Заражение большой (R) культур и мониторинга YFP. Используйте V 1, V 2 или замороженные ВПс аликвотам заразить большее клеточных культур для производственного цикла (обычно 400 мл в 2 колбы L). Придерживайтесь режима низкого МВД (отрегулировать громкость вирус используется для инфекции, такой, что инфицированные культуры по меньшей мере вдвое раз). Увеличить объемы инфицированной культуре при необходимости путем умножения количества колб. Если YFP маркерного белка присутствует, снять через определенные промежутки времени 1x10 6 клеток, гранул и лизируют клетки и контролировать эволюцию YFP сигнала, пока не будет достигнуто плато INDicating максимальной рекомбинантного белка. YFP уровни могут быть измерены в стандартных 96-луночных планшет-ридере способна записывать сигналы флуоресценции (например Tecan SPECTRAFluor). Урожай клетки на этой стадии. Магазин клеточные осадки при температуре -20 ° С (кратковременно) или -80 ° C (долгосрочные).
  2. Лизис клеток и фракционирования. Клетки лизируют вашим любимым методом выбора, с учетом требований вашего белка (замораживание-оттаивание, обработка ультразвуком, французская пресса, др.). 5-7 фракционирования цитозоле и ядрах и тест на наличие вашего белков, представляющих интерес. Разработка очистки протоколов на основе результатов для упрощения очистки белков. Рассмотрим применение процедуры замачивания для извлечения белка из ядерной фракции при высокой KCl условий, если ваш белки находятся в ядре. 7,18
  3. Белки очистки (микро-масштабе, крупномасштабное). Следует отметить, что часто небольших объемов (10 или 25 мл) клеточной культуры суfficient для получения осадка клеток для очистки значительное количество ваших белков, представляющих интерес в связи с обычно высокий или очень высокий уровень производства чужеродных протеинов в бакуловирус / клетка насекомого систем (часто 10-100 мг белка на литр культуры и более). В сочетании с микро-очистки (луночные планшеты, микроострийных методов, GE Healthcare ÄKTAmicro системы, другие) можно получить биохимических и данные о деятельности и часто также достаточным количеством желаемого белка и комплексы Nanoliter масштабе высокой пропускной кристаллизации (НТХ ). Рассмотрим с использованием металлических аффинной очистки (Clonetech Takara TALON, Qiagen NiNTA хелатирующий металл смолы) и олиго-гистидин (6-10 остатков) тег на открытых субъединиц ваш белковый комплекс для облегчения очистки, в сочетании с ионным обменом и эксклюзионной хроматографии в небольших Объемы используя, например, ÄKTAmicro или аналогичную машину очистки небольших объемов (рис. 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сильные совместной экспрессии гетерологичных белков достигается MultiBac система показана на рисунке 1d (зонды принято 48 часа после заражения суспензионной культуре клетки). Сверхэкспрессированную белковых полос явно видны во всем клеточном экстракте (SNP) и очищенного лизата (SN). Качество и количество белка материала, полученного часто достаточно, чтобы позволить определение структуры белковых комплексов, таких как митотическую КПП комплекс MCC показано на рисунке 1e 17.

Рисунок 2 отображает рабочий процесс из эксперимента сборки гена роботизированной тандеме recombineering (TR). Надежные протоколы сборки ДНК сценарию рутинными робототехники для параллельные сборки конструкций мультигенные выражения. Индивидуальные роботов шаги показаны на оснастку выстрелов (рис. 2, в, I - IV). ДНК компонентов для сборки генерируются с помощью ПЦР и качество контролируетсяэлектронной гели (рис. 2d, слева), собранный конструкции мультигенное являются также подтверждено ПЦР с использованием специально разработанных набора праймеров (рис. 2d, справа) 14,15.

Рекомбинантный поколения бакуловирусе и усиления следует стандартных операционных процедур (схематически изображена в рисунке 3а). Моментальные снимки клеток, культивированных в монослое показаны (рис. 3б, И. & II.) После инфицирования вирусом MultiBac.

Переработка обработки рекомбинантных белковых комплексов может быть уменьшен при использовании мульти-луночного планшета или микроострийных основе хроматографии на аффинной очистки последующей гель-фильтрации (SEC) комплексов путем интеграции в рабочий поток мелких систем, таких как ÄKTAmicro (рис. 4а). Профиль представителя SEC в ~ 700 кДа комплекса человека фактора транскрипции показано. Образец очищали с помощьюÄKTAmicro в небольших, как правило, достаточно для характеризации на биохимические и биофизические средств, включая электронную микроскопию (рис. 4б).

Рисунок 1
Рисунок 1. MultiBac технологическую платформу для мультибелковых производственного комплекса. (А) интерес генов интегрированы в Multibac бакуловирусные генома с помощью Tn7 транспозиции в сочетании с голубой / белый скрининга. LoxP сайта на вирус основа позволяет добавление дополнительных функций, таких как флуоресцентный белок маркером для мониторинга производительности вирусов и гетерологичного белка. (Б) бакуловирус принимает вытянутую форму палочки и характеризуется гибкую оболочку, может увеличить для размещения Большая (> 130 Kb) циклической двухцепочечной ДНК генома. Большой гетерологичными вставки генов в геноме B переноситсяу удлинения конверта. (с) Стандартный колб Эрленмейера на орбитальном шейкере платформы могут быть использованы для выращивания культур насекомых больших масштабах ячейки для производства белка heterologues. (г) MultiBac система эффективно производит рекомбинантных белков, которые часто хорошо видны уже в цельной клеточный экстракт (SNP). (E) структуры комплекса контрольно-пропускного пункта митотического было выяснено дифракции рентгеновских лучей из кристаллов, выращенных из образца, полученного с системой MultiBac. 17 Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. (Автоматизированные) Тандем Recombineering (TR). (А) Тандем recombineering использует малые массивы синтетические молекулы плазмиды ДНК, называемых доноров и акцепторов для сборки Несколькоконструкций igene выражение, необязательно в роботизированной режиме с использованием жидкой обработки рабочей станции (справа). (б) процесса TR показано. SLIC выступает за последовательность и перевязки независимое клонирование, Cre выступает за CRE-LoxP слияния объединения доноров и акцепторов, в которую интерес гены были вставлены по SLIC. Multigene экспрессирующих конструкций, порожденная этим recombineering процедуры с использованием Cre SLIC и в тандеме затем интегрируются в геном MultiBac бакуловирусе и используется для мелких и крупных насекомых выражение в культурах клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом. (C) снимки роботизированной TR Процесс показаны включая обеспечение ДНК-матрицы и праймеры (I), подготовка ПЦР-реакций в луночные планшеты (II), ПЦР-амплификации ДНК (III) и подготовка мультигенное конструкции, выращивают в бактериальной культуры путем щелочного лизиса в мульти-луночных планшетах ( IV). (г) ПЦР-продукты, используемые для TR визуализируются намипередача по электронной гель системы (слева). Завершено конструкций мультигенные обоснованы аналитические реакции ПЦР загружаются на адрес электронной геля (справа). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. MultiBac вируса генерации, усиления, хранение. (А) стандартная процедура (СОП) от MultiBac платформу в EMBL Гренобль показана в схематическом виде. Рекомбинантный вирус MultiBac идентифицируется сине-бело скрининга и подготовлена ​​из бактериальных культур. Начальное трансфекции происходит на 6-луночные планшеты высевали с монослои клеток насекомых (Sf21, Sf9, Hi5, др.). Вирус усиливается и белка-мишени производятся в шейкеры Эрленмейера. Вирус сохраняется при замораживании аликвоты инфицированных клетках насекомых (ВПс). Florescence записывается в качестве аналитического инструмента, еслиYFP (или другого флуоресцентного белка) была включена в качестве маркерного белка, например, в LoxP настоящего сайта на MultiBac бакуловирусного генома. (Б) Снимки клетки насекомых, инфицированных MultiBac бакуловирус показаны. Клетки прекращают пролиферирующих, увеличиваться в размерах (I.). Сотовые слитых наблюдаются (II). Вирус расцветший от инфицированных клеток в среду собирают и используют для заражения больших клеточных культур для производства белкового комплекса (III, IV). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4
Рисунок 4. Белковый комплекс производства и вниз по течению обработки. Белкового комплекса образец может быть уже удобно очищается от мелких начальных клеточных культур с использованием миниатюрных методов очистки, таких как многослойные или микронаконечник-на основе очистки, необязательно в сочетании с малым объемом хроматографии системы (слева). Часто выход уже этих "аналитических" очистки трасс (средние) является достаточным для анализа структуры и функции очищенного комплекса с помощью различных средств, включая электронную микроскопию (справа). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Видео оснастку выстрелов на Фиг.2 и 3 иллюстрируют весь процесс от роботизированной поколения из кДНК мультигенное экспрессирующие конструкции, вплоть до заражения насекомыми культур клеток для продукции белка. Новые реагенты (плазмиды и вирусы) и надежные протоколы были разработаны, чтобы позволить трубопровод опираясь на СОП. Весь трубопровод был реализован в качестве технологической платформы на EMBL в Гренобле. Платформа MultiBac обращались многие ученые из академических и промышленных, которые занимаются мультибелковых исследований. Обучение доступа поддерживается специальными программами доступа финансируется Европейской комиссией (P-CUBE, BioSTRUCT-X).

Наличие СОП для проведения белкового комплекса выражение с помощью системы MultiBac оказала эта технология легко поддается также неспециалисту пользователей. Робот-ассистированная операции мультибелковых ускоряет производственный комплекс в частулар, когда достаточно большое количество комплексов, например, варианты и мутанты образца интерес, должны быть получены параллельно. Однако ручная работа при низкой и средней пропускной также в значительной степени выгоды от наличия СОП. По нашему опыту, процессы, которые могут быть успешно сценария в робототехнике процедуры необходимо быть уточнены первый со значительным усилием, пока достаточно надежной протоколы не были получены, совместимых с помощью робота. Такие протоколы составляют основу нашего СОП. 5,6,14,15 Действительно, реализация этих надежные протоколы для робота привести к очень значительным повышение эффективности также ручных операций в нашей лаборатории.

Многие белки и белковые комплексы были и производятся с помощью MultiBac системы, которую мы разработали, и близко к 500 лабораторий всем мире получили реагентов. MultiBac стало катализатором исследований не только в структурной биологии, но и во многих др.ER области наук о жизни, что расследование или эксплуатировать взаимодействия белков, в больших собраниях. MultiBac была также использована для производства белковых мишеней значительной фармакологической интерес, включая вирус-подобных частиц, которые могут стать полезными вакцин-кандидатов. 4 Совсем недавно MultiBac также используется для доставки генов в клетки млекопитающих и клеточных культур, или даже целых организмов генной терапии. 4 Мы ожидаем, что такие подходы, как на иллюстрациях данного вклада окажется полезной во многих областях исследований с участием мультибелковых узлов и сложного взаимодействия биологических макромолекул, которые составляют основу клеточных процессов в норме и патологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IB является изобретателем на патенты и патентные заявки подробно части описанных здесь технологий.

Acknowledgements

Мы благодарим Кристоф Bieniossek, Саймон Trowitzsch, Даниэль Фицджеральд, Yuichiro Такаги, Кристиан Schaffitzel, Ивонн Хунцикера, Тимоти Ричмонд и всех прошлых и настоящих членов лаборатории Бергер за помощью и советом. MultiBac платформы и ее развития были и при щедрой поддержке финансирования учреждений, включая Швейцарского национального научного фонда (SNSF), Национального агентства по исследованиям (ANR) и Национального центра Научных Исследований (CNRS) и Европейская комиссия (ЕК) В рамочной программы (FP) 6 и 7. Поддержка транснационального доступа обеспечивается проектов ЕС FP7 P-CUBE ( www.p-cube.eu ) и BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Французское министерство науки, в частности, признал за поддержку MultiBac платформы на EMBL через Investissement d'Avenir Frisbi проекта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bluo-Gal Invitrogen 15519-028 (1 g)
Tetracycline Euromedex UT2965-B (25 g) 1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine Euromedex EU0420 (25 g) 1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine SIGMA G3632 (5 g) 1,000X at 10 mg/ml
IPTG Euromedex EU0008-B (5 g) 1,000X at 1M
Cre-recombinase New England BioLabs M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent Roche 06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect Thermo Scientific SH 30913.02
6-well plate Falcon Dominique Dutscher 353046
2 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357507
5 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357543
10 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357551
25 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357535
50 ml pipette Falcon Dominique Dutscher 357550
50 ml tube Falcon Dominique Dutscher 352070
15 ml tube Falcon Dominique Dutscher 352096
1.8 ml cryotube Nunc Dominique Dutscher 55005
100 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211917
250 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211918
500 ml shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211919
2 L shaker flasks Pyrex Dominique Dutscher 211921
Certomat Orbital Shaker + plateau Sartorius 4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L Fisher Scientific M76801
Biological Safety Cabinet Faster Sodipro FASV20000606
Optical Microscope Zeiss 451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells Invitrogen B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus TECAN
10 μl conductive tips (black), TECAN 10 612 516
200 μl conductive tips (black) TECAN 10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml TECAN 10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted Eppendorf 0030 128.648
96 well V bottom, non sterile BD falcon 353263
96 deepwell plate color natural, PP) Fisher M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom Greiner 655101
96 deepwell plate Thermo scientific AB-0932
24 well blocks RB Qiagen 19583
DpnI restriction enzyme NEB R0176L 20 U/uL
NEBuffer 4 10X NEB B7004S
2X phusion mastermix HF Finnzyme ref F-531L
2X phusion mastermix GC Finnzyme ref F-532L
DGLB 1.5X homemade 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel Life Technologies 10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel Life Technologies 10068-013
E-gel 48 1% agarose GP Life Technologies G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit Macherey Nagel 740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract Macherey Nagel 740 707.2
Gotaq green master mix Promega M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified Novagen 70099-3
DTT 100 mM homemade
Urea 2 M homemade
EDTA 500 mM pH 8.0 Homemade
LB broth (Miller) 500 g Athena ES 103

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10, (8), 558-572 (2009).
  2. Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450, (7172), 973-982 (2007).
  3. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, (5), 567-575 (2005).
  4. Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37, (2), 49-57 (2012).
  5. Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3, (12), 1021-1032 (2006).
  6. Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
  7. Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172, (1), 45-54 (2010).
  8. Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175, (2), 198-208 (2011).
  9. Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41, (3), 105-178 (2006).
  10. Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37, (5), 189-198 (2012).
  11. Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, (6), 560-567 (2012).
  12. Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288, (5466), 640-649 (2000).
  13. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22, (12), 1583-1587 (2004).
  14. Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6, (6), 447-450 (2009).
  15. Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. (2009).
  16. Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65, (2), 122-132 (2009).
  17. Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484, (7393), 208-213 (2012).
  18. Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472, (7344), 448-453 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics