マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Immunology and Infection

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Summary

パイエル板の細胞の特定の亜集団(PPS)、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

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De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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Abstract

パイエル板(PPS)は腸管関連リンパ組織(GALT)の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング(FAE)と樹状細胞(DC)、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、(i)単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、(ii)の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS(4匹から)以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、> 90%の細胞生存率> 2.5×10 6細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度(OCT)培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片(5-12μm)は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

Introduction

パイエル板(PPS)は、ヒトおよびマウスの小腸( 図1)を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮(FAE)によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム(SED)の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 + T細胞は5月9日と混ざり樹状細胞(DC)のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞(FDCS)とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 +エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。

PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部を構成することを考えると、大変な作業です。この環境における細胞 in vitro の特性評価支援するために、我々は、フローサイトメトリーおよび機能解析だけでなく、免疫蛍光顕微鏡および免疫組織学のための凍結切片を調製するためのPPのプロトコルのために全マウスのPP細胞を調製するためのプロトコルを提供する。覚書の分離、特性評価、および免疫染色のために、我々のプロトコル電子PPの細胞は、これらの技術を5,6,9-11を引用 、25年以上さかのぼる多くの参照があるという事実によって証明されるように、 それ自体は小説ではありません。むしろ、我々のプロトコルは、初めてPPを集める研究者のための合理化された(とビジュアル)メソッドを提供します。私たちが説明する技術を容易に習得し、容易に> 90%の細胞の生存率を持つ細胞を大量に産出されています。凍結セクショニングプロトコルは、理想的には、免疫蛍光染色し、共焦点イメージングに適した再現性の高い連続切片が得られます。さらに、我々のプロトコルは、2つの他の最近のJoveの記事補完します。最初は、福田らは、12のPP M細胞による病原細菌の取り込みを評価するためにライゲート回腸ループアッセイの使用について説明します。もう一つは、Geemらによる、マウスの腸粘膜からの樹状細胞やマクロファージの単離および特性を説明していますが、明示的に分析13からPPを除外。

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Protocol

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会(動物実験委員会)のガイドラインに完全に準拠して処理した。

1。経口胃管栄養法

  1. 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択(任意)強制経口マウス系統。平滑末端給餌針(Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州)。配達ボリュームはマウス当たり400μlを超えないようにしてください。

2。フローサイトメトリー用のPP細胞の単離

  1. 制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)のガイドラインによると、CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。
  2. 70%エタノールまたは手術前ベタジンで腹部を清める。胸郭の底から1.5cm約正中線に沿って始まり外科グレードのはさみを使用して、単一の(1cm)に切開を伴う標準的な開腹手術を行います。当たりを公開itoneal空洞と盲腸を識別します。回腸、盲腸の接合部に端子小腸を切り取ると優しくその全体が腸を削除します。それは腹膜腔から除去されるように腸組織を過度に伸ばすないように注意してください。
  3. 湿ったペーパータオルやキムワイプのベッドの上で小腸を築く。組織の脱水を防ぐために、生理食塩水で軽く小腸を濡らす。視覚的に腸の抗腸間膜側( 図1)の、其々のPPを識別します。一般的に、単一のマウスは均等に回腸(遠位)に十二指腸(近位)から配布される5から10目に見えるPPを持っています。平均して、4匹は23 PPをもたらすでしょう。
  4. 湾曲した手術用のハサミ、優しく物品個々のPPを使用していて、冷たいハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中に置いてください。 、はさみだけでPPの上にカーブ側を上に配置する必要があり、その後穏やかに組織に適用される。消費税​​PPのみ(ないsurroundingの組織)と冷HBSSに転送されます。
    注:前方に第2節では、この点から全てのインキュベーション及び遠心操作は°Cの細胞の生存を維持するために4で行われる必要があります。
  5. 37℃で15〜20分間、5 mlの脾臓解離ミディアムとインキュベートにPPを転送℃で精力的に250rpmで振とうしながら。長いインキュベーション時間がマイナスに細胞の生存に影響を与えます。
  6. 滅菌(オートクレーブ)を70μmナイロンメッシュセルストレーナー上の単一の細胞懸濁液を、場所のPPを生成して、強制的に1ccの注射器からプランジャーのベースを使用してメッシュに組織を粉砕する。あるいは、サンドイッチ2すりガラス滅菌ガラス顕微鏡スライドの間にPPS(封筒でオートクレーブ)、穏やかに前後に運動と組織を挽く。 5ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を転送するために滅菌ピペットを使用しています。
  7. 細胞懸濁液に最終濃度1mMとなるようにEDTAを追加します。用ロッカーでインキュベート室温で5分間。
  8. 残りの細胞凝集塊または組織片を除去するための第270μmのセルストレーナーを通してデカント細胞懸濁液。 15または50 mlコニカルチューブに細胞を回収する。
  9. 穏やかに遠心(500×gで5分)の対象セル。 1%ウシ胎児血清(FCS)を含む生理食塩水(PBS)、リン酸緩衝化されているフロー·バッファ内の上清をデカントして細胞を懸濁。
  10. 細胞数と生存率を決定するために、トリパンブルーに1時10細胞を希釈し、視覚的に光学顕微鏡と血球計数器を用いて細胞を検査します。代わりに、伯爵セルカウンター(Invitrogen社)または類似の測定器を自動的に細胞数と生存率を列挙するために使用することができます。
    PPは20から25で始まる、このプロトコルは> 2.5×10 6総細胞が得られるはずです。これは、マウスあたり約0.8から1.2×10 6個の細胞に相当します。

フローサイトメトリー用の細胞の抗体ラベリング

<オールスタート= "11">
  • 96ウェル丸底プレートのウェルに細胞(ウェル当たり10 5)を分注します。
  • 穏やかな遠心分離(1,000×gで5分)、ゆっくりと反転板で上清をデカントの対象とプレート。
  • のFcブロックバッファーに細胞を再懸濁し、氷上で15分間インキュベートする。市販のFcブロックバッファの数( 例えばラット抗マウスCD16/CD32、BD Biosciences社)がありますが、我々は、単にマウスに対するモノクローナルIgG 1を分泌ラットB細胞ハイブリドーマ(ATCC 2.4.G2)から使用済み培地を使用このステップのためのFcγ受容体。
  • 静かに転倒板で上記のように穏やかに遠心(1,000×gで5分間)、上清をデカントの対象とプレート。
  • 所望の希釈で細胞懸濁液に直接蛍光色素標識抗体を追加して、連続的な揺らしながら氷上で30分間インキュベートする。
  • 件名穏やかに遠心(1,000×gで5分間)にプレートし、デカント静かに転倒板による上澄み。
  • フローバッファー100μlで細胞を洗浄します。
  • 静かに転倒プレートで5分、そして上清をデカントし、1,000×gでプレートを遠心分離する。
  • フローバッファー300μlとPHEM緩衝液中の1%パラホルムアルデヒド(60mMのPIPES、25mMのHEPES、10mMのEGTA、pH6で4mMのMgCl 2)を100μlから成り再懸濁し、細胞を400μl固定バッファ、。
  • FACSキャリバーまたは同等品を使用したフローサイトメトリーの対象となる細胞。セルクエストプロソフトウェアバージョン5.2を使用して結果を分析します。
  • 3。 PPの凍結切片の作製

    1. 組織採取に先立ち、7x7x5ミリメートルプラスチック基金型に最適切断温度(OCT)の化合物を追加します。また、デュワーや氷のバケット内の液体窒素(> 750ミリリットル)のプールを用意しております。
    2. マウスを安楽死させると上記のように、laparotamyを実行します。湿ったペーパータオルの上で腸と場所を削除します。
    3. へcyrosectioning用のPPを分離し、PBSを含むペトリ皿に単一PPと伝達組織を含む小腸の0.5センチメートル横セグメントをカットします。優しく不要な糞破片を除去するためにPBSでこれらのセグメントの内腔を洗浄してください。
    4. 垂直に10月を含むベース金型内腸組織セグメントを配置します。液体窒素中で金型を浸し、組織を完全に止めることができるように(1〜2分)。組織が完全に凍結しているときに10月の色は透明から白色に変わります。 。より緩やかな冷却( 例えば 10月の割れ低減する)ために、液体窒素で冷却したイソペンタンの蒸気槽に浸す型注意:液体窒素を扱うときに、適切な安全ゴーグルを着用する。
    5. ピンセットを用いて液体窒素から凍結ベース金型を外し、金型は10月ブロックのエッジが柔らかくできるようにするために必要な時間だけ、室温(約10から15秒)で温めることができます。その時から10月の冷凍ブロックを削除するには金型は、金型を反転させ、アルミ箔のきれいな4×4cmの部分にブロックを取り出すときに背中を軽く押してください。直ちに液体窒素やドライアイス上に格納されているラベルの付いた標本袋に箔と場所にティッシュを包む。あるいは、(<-20℃)の冷凍庫に組織を移す。週間以内に、組織を使用、それ以外のブロックは、年齢とともにもろく​​なります。

    凍結セクショニング

    1. 凍結切片ライカCM3050S cryomicrotomeまたは同等品を使用して組織を。クライオスタット上のチャンバー温度-21に設定する必要があり℃に
    2. 厚さが12から14ミクロンであるセクションに努めています。
    3. フィッシャーSuperFrostプラス(または同等品)ガラス顕微鏡スライド上のセクションを収集し、標準的な低消費電力の光顕微鏡を用いて視覚的に検査する。複数のセクションをスライド上に収集されている場合は、それらが下流染色アプリケーションのために一緒にクラスタ化されていることを確認してください。
    4. ストアトン彼は理想的には、スライドボックスに室温でスライドして、数日以内にそれらを使用しています。

    凍結切片および共焦点顕微鏡分析の抗体標識

    1. 2分間組織染色jarまたはラック内のアセトンに浸しスライド(またはメタノール)。長時間のインキュベーションは、スライドからデタッチする組織を引き起こす可能性があります。
    2. 新しい染色瓶にスライドを移し、3分間ずつ、PBS-T(0.05%Tween-20を含む1×PBS)で3回洗浄する。
    3. ImmEdge疎水性ペンでセクションを取り囲んでいます。これは、試薬および抗体はインキュベーションの間にその区域に限定されたままであることが保証されます。
    4. 光から保護加湿チャンバー内で37℃で30分間ブロックバッファのスライド(PBS中2%ヤギ血清)をインキュベートする。
    5. 37℃で10分に対するFcブロックバッファ(上記参照)を使用してスライドをインキュベート
    6. PBS-Tとキムワイプまたは他の吸収性組織を使用してセクションの周りの乾燥した場所にスライドを浸します。実際の組織切片を触れないように注意してください。
    7. 37℃で30分間加湿チャンバー内のCのための一次抗体溶液とインキュベートするオーバーレイ組織切片。一次抗体は、典型的には、20μg/ mlの最終濃度になるようにブロックバッファー中に希釈されています。最大3つの抗体は、この段階で直接結合することができるため、直接標識一次抗体の使用は、望ましいです。直接標識された抗体はまた、追加の抗体インキュベーション工程の必要性を排除します。
    8. 洗浄はPBS中に浸漬することにより3回(各5分間)をスライドします。
    9. もし水分チャンバー内で37℃で30分間、関連する二次抗体を用いて、必要に応じて、インキュベートスライド。
    10. 洗浄はPBS中に浸漬することにより3回(各5分間)をスライドします。
    11. 上記のようにPHEMの緩衝液中の1%パラホルムアルデヒド中で4分間スライドをインキュベートする。
    12. 1分間PBSでスライドを洗浄します。
    13. キムワイプまたは吸収する他のを使用してセクションの周りにドライエリア耳鼻咽喉科組織。実際の組織切片を触れないように注意してください。ピペットやスポイトを使って、優しくセクションに直接メディアをマウント延長ゴールドのドロップを置きます。気泡がないように注意しながら取り付け媒体上にカバーガラスを適用します。余分な封入剤を吸収するあぶらとり紙を使用しています。
    14. 商業マニキュアと顕微鏡スライドにカバースリップを密封し、空気乾燥することができます。
    15. ライカTCS SP5または同等の共焦点顕微鏡を用いてスライドを表示します。

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    Representative Results

    合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80%以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱(FSC)、高細胞容積の指標、および低側方散乱(SSC)が、低い細胞粒度( 図2A)のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に(代わりPHEMのPBSプラス1%FCSを含む細胞をインキュベートする、最後のステップで、室温(代わりに氷の上での)での分離工程中にPP細胞をインキュベートするとによって "貧しい細胞調製"を作成バッファ)。これらの貧しい細胞調製では、細胞の大部分は低FSCと高いSSCを発揮し、指示されたゲートR1( 図2B)の外にあります。これらの細胞は、おそらくアポトーシスおよび/または壊死を受けています。

    図3は、4ジまでのカクテルの使用方法を示していPPの単一細胞懸濁液に種々の細胞型の間で区別するfferentフルオロフォア標識モノクローナル抗体。 B細胞が構成していることを分化(CD)マーカーCD19およびB220リビールのクラスタで標識〜ゲーテッドPPの細胞集団の60%( 図3A)。特異的なT細胞サブセットは、簡単にCD3およびCD4( 図3B)またはCD3およびCD8( 図3C)に対する抗体を用いた二重標識によって列挙することができます。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、総PP細胞のそれぞれ約23%〜9%を構成する。 DCは、標識されたサブセットのCD11c +( 図3D)およびCD103 +(図示せず)も、この方法で列挙することができます。 CD11c +樹状は、PPあたり10,000 DCにほぼ相当する合計ゲーテッド人口の約8%に貢献しています。これはまさに他人14で観測されたDCの数と一致している。

    のCD11cの人口のうち、+ +のダブル陽性であった。 PP細胞がC57B / 6マウス( 図3E)から収集された場合にも、同様の結果が得られる。

    "悪い"細胞調製物は、死んでいるか死にかけている細胞は非特異的に抗体を結合する傾向が主な理由は、非常に誤解を招くような結果につながることができます。 図4に示すように、B細胞マーカー(B220)とT細胞マーカー(CD3、パネル、CD4、パネルB)の両方に陽性染色細胞の集団には良い面との間に3倍以上に変動する可能性があります悪い細胞調製図4は、貧しい細胞調製物中の細胞(パネルB)以上B220 +およびCD3 +ダブルポジティブ細胞(パネル)の表現と同様、B220 + B細胞とCD4 + T細胞の二重陽性を示しています。前述したように、善対貧しいにおける相対BおよびT細胞数の格差は、おそらく細胞を死に抗体の非特異的結合によるものである。

    我々のプロトコルでもPPの凍結切片を病理組織学的解析、ならびに免疫標識に従順であることを、マウスを示し、 図5は、マウスのPPSパラフィン(パネルA、B)、凍結切片(パネルC)のH&E染色を比較します。パラフィン切片のH&Eで染色し、細胞レベルでより高い解像度を提供していますが、PPの胚中心の明るい部分と暗いゾーンがより簡単に凍結切片切片( 図5A-C)に区分されます。 H&E染色凍結切片は凍結切片を免疫標識とside-by-sideの比較のために有用である。 B細胞を強調するためにDCと抗B220抗体を強調するために、T細胞、抗CD11c抗体を標識するために抗CD3抗体で染色された典型的なPPの凍結切片を図6に示します。

    図1
    図1。マウスのパイエル板PATCHES。3つの可視PPS(白矢印)と新たに摘出マウス小腸のイメージ。 PPは、腸の漿膜の抗腸間膜側に水泡状の構造物(5×5 mm)と表示されます。

    図2
    図2。合計PP細胞は、フローサイトメトリーによって分析した。合計PP細胞の単分散懸濁液は、BD FACSCalliburを用いたフローサイトメトリーに供した。良い細胞調製物()例。細胞の大半は、高前方散乱(FSC)、高細胞容積の指標、および低側方散乱(SSC)が、低い細胞粒度の指標を示しています。これらの細胞は、R1の箱入りです。 R1ゲートの外側に位置する低FSCとSSCとの高い細胞は、死んだと見なさまたは細胞を死に瀕している。貧しい細胞調製物(B)の例、細胞の大部分は門の外にされているR1は低いFSCとSSC高に起因する。

    図3
    図3。合計PP細胞のPPのリンパ球の代表的フローサイトメトリー分析。単分散懸濁液は、フルオロフォア標識1次抗体とインキュベートし、次いで、フローサイトメトリーに供したPPのB細胞の(A)は CD19およびB220ラベリング。(BC)の全細胞集団の二重標識CD3およびCD4(B)またはCD8と(C)の特異的なT細胞サブセットを列挙します(D)は B220(B細胞マーカー)の総細胞集団の二重標識およびCD11c(直流マーカー)(E)の比較B220、CD3 、CD4、およびBALB / cおよびC57B / 6マウスからPP細胞にCD11cの染色。

    図4
    図4。誤解を招くようなフローサイトメトリーグッド(左パネル)と貧しい貧しいPPの細胞調製の結果としてのデータ。(右パネル)、PP細胞調製物はBおよびT細胞集団を区別するためにB220とCD3に、(A)抗体で染色した、または(B)抗体B220とT細胞サブセットからB細胞を区別するCD4に。左側のパネルに示されているようにB220およびCD3またはCD4に陽性染色細胞の非常に少数の細胞は、一般的にあります。これとは対照的に、貧しい細胞製剤で二重陽性細胞は全細胞のほぼ20%を占めている。 "貧しい"細胞調製物を構成するものに関する詳細については本文を参照してください。

    図5
    図5。回腸PPの代表的なH&E染色PPのセクションを参照してください。パラフィン包埋切片(A、B)または凍結切片(C)sがH&Eで染色し、光学顕微鏡により可視化した。パラフィン切片に比べて、リンパ濾胞の明るい部分と暗いゾーンが容易に、凍結切片に区分されていることに注意してください 。略語:V、絨毛、FAE、濾胞関連上皮、SED、サブ上皮ドーム、LF、リンパ濾胞。

    図6
    図6。ネズミPP凍結切片の免疫蛍光標識は、。たてPPは間濾胞領域でT細胞を標識するためにアセトン固定し、(A)は 、FITC結合抗CD3抗体で染色し、空気乾燥させた単一のマウスの組織切片を切り出し、粘膜固有層、(B)PE結合抗CD11c抗体は、sedでのDCを強調表示すると、(C)APC標識抗B220抗体は、B細胞を強調する(D)の複合O。ACはフィジーソフトウェアを使用して生成されたパネルのfのイメージ。スケールバーは100μm程度である。

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    Discussion

    この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱であることが指摘されるべきである。それにもかかわらず、プロトコルは、我々は一般的に単一のマウス0.8から1.2×10 6合計PP細胞間の利回りを概説しています。我々は一般的に20から25プールPPSよりもうやりませんが、スケールアップが可能であり、なぜなら、私たちの経験では、凝集が大幅に(と生存率)の低下を発生し、細胞収量。臨界質量が正常に全体の単離操作を介して細胞を運ぶために必要であるように一方、我々は、このプロトコルのために15名未満のPPを使用することは推奨できません。最大の細胞生存率は下流に機能の優先事項である場合アッセイは、我々は、単離された細胞の小さな試料がより正確なゲー合計PPの細胞集団からの細胞の生存可能なプールを可能にするためにヨウ化プロピジウム染色に供されることを勧めます。最後に、特定の細胞サブセットは、例えば、養子移入または in vitro解析のために望まれているなら、我々の手法は、細胞選別アプリケーションに従順であることに留意すべきである。

    PPの組織の実際の切片が挑戦することができますが、凍結セクショニングのためのPPのコレクションは、比較的簡単です。それはPPの組織は、その真の横断切片が得られることを確認するために金型(金型のベースに、すなわち垂直)で適切に配向していること、例えば、不可欠です。私たちは、全体的な携帯とサブ携帯レゾールの減少固定剤の結果を沈殿さにもかかわらず、抗体反応性を( "抗原性")を保持するアセトンまたはメタノールのような固定液を沈殿にスナップ凍結PPの組織を提案し、その後、凍結切片を施すution。抗原性の保全が特に懸念されていない場合は、次に我々はの使用をお勧めし架橋ホルムアルデヒド(PFA)、細胞および細胞内構造をより良く保全の結果のような固定剤を。確かに、PFAは事前凍結セクショニングに組織を固定するために使用することができます。単に> 2時間4%PFAのおびただしい量でたて摘出PPを浸す、前述したように、過剰な固定液を除去し、必要に応じて、ショ糖(15%)で組織を平衡化した後、10月に埋め込むPBSで組織を洗う。組織は、その後凍結切片ことができますが、免疫染色の前に残留反応PFAをクエンチするためにグリシン溶液(15分間PBS中の0.1 M)でブロックされなければならない。

    我々はPPの凍結切片の免疫蛍光標識するためのプロトコルを説明してきたが最後に、これらの同じセクションでは、市販のIHCキット( 例えばベクトルLabsは、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を用いて免疫組織化学(IHC)に適している。 IHCの場合は、ペルオキシダーゼのブロッキングまたはquencを含めることが不可欠である内因性ペルオキシダーゼは、腸粘膜で非常に流行しているようなプロトコルで興はステップ。その他は、IHCのために、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いたマウスの心臓の灌流が組織保存を向上させることを指摘している。

    要約すると、我々はリンパ球や樹状細胞を含むマウスのPP細胞の定量的および機能解析のための並列および相補プロトコルを提供してきました。凍結切片の免疫標識は、特定の種類の細胞だけでなく、 その場に存在する細胞間相互作用の局在に関する情報を提供しながら、単一の細胞懸濁液の調製は、PPSの主要な種類の細胞のin vitroでの解析定量的かつ機能的なことができます。両方のこれらのアプローチの主な制約はどちらも、PP細胞間相互作用の "リアルタイム"見える化を表していることである。少なくとも現時点では、PPは、生体内イメージング、リンパ球dynamiの理解に革命をもたらした技術に不浸透性が証明されている末梢リンパ節のcs。 PPの生体内イメージングを制限する技術的な障壁が克服されるまでは、免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析やPP凍結切片のための単一細胞調製物を、PP製造するためにこの資料に記載されているプロトコルは、特定のサブの免疫機能を調査し、理解するための主要な手段のままになりますPPの中の細胞の集団、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位。

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    Disclosures

    特別な利害関係は宣言されません。

    Acknowledgements

    我々は、パラフィン切片を調製するための細胞分析とヘレン·ジョンソン(ワズワースセンター動物組織病理コア)を支援するためのRenjie·ソング(ウォッズワースセンターのフローサイトメトリーコア)に感謝。我々は、共焦点顕微鏡と画像収集の支援については博士リチャードA·コール(ウォッズワースセンター光顕微鏡コア)に感謝。我々は、アニメーションの支援についてはアンディベントレー(ウォッズワースセンターの写真とイラスト)承認したいと思います。

    MDJは、ライフサイエンス研究財団、ハワードヒューズ医学研究所(HHMI)フェローシップでサポートされています。 SAはワズワースセンター·ヘルスリサーチ株式会社学内ポスドクでサポートされています。この作品は、NIHの助成HD061916とGM082978によって部分的にサポートされていました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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