Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

Immunology and Infection

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Summary

Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l'intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.

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De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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Abstract

Les plaques de Peyer (PP) font partie intégrante des tissus lymphoïdes associées à l'intestin (GALT) et jouent un rôle central dans l'homéostasie intestinale et immunosurveillance. Antigènes particulaires et des microbes dans la lumière intestinale sont continuellement échantillonné par les cellules M PP dans l'épithélium folliculaire associée (EAF) et transportés vers un réseau sous-jacent des cellules dendritiques (CD), les macrophages et les lymphocytes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles dans lesquels PP murins sont (i) dissociée en suspensions de cellules isolées et soumises à la cytométrie en flux et (ii) préparé pour découpe au cryostat et immunomarquage. Pour la cytométrie en flux, PPs sont dissociées mécaniquement et ensuite filtré à travers 70 pm à générer des membranes suspensions monocellulaires libres des cellules épithéliales et les gros débris. Démarrage avec 20-25 PP (à partir de quatre souris), cette méthode rapide et reproductible donne une population de> 2,5 x 10 6 cellules avec> 90% de viabilité cellulaire. Pour découpe au cryostat, fraisPP ly isolés sont immergés dans la température de coupe optimale (PTOM) moyen, composant logiciel enfichable congelés dans l'azote liquide, puis sectionnée à l'aide d'un cryomicrotome. Les coupes de tissus (5-12 um) sont séchés à l'air, fixées à l'acétone ou le méthanol, puis soumis à immunomarquage.

Introduction

Les plaques de Peyer (PP) sont des agrégats macroscopiques organisés follicules lymphoïdes présents tout au long de l'intestin grêle de l'homme et la souris (figure 1) et constituent les principaux sites à laquelle des réponses immunitaires muqueuses sont engagées contre des antigènes alimentaires, les bactéries commensales, les agents pathogènes microbiens et les vaccins oraux 1-4. Contrairement à d'autres tissus lymphoïdes périphériques tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, PP manquent vaisseaux lymphatiques afférents. En tant que tels, des réponses immunitaires adaptatives en PP sont entraînés en réponse à des antigènes provenant de la lumière intestinale. L'échantillonnage des antigènes luminal est accomplie par l'épithélium du follicule-associé (EAF), qui se compose de deux entérocytes et l'antigène d'échantillonnage cellules appelées cellules M. Sous l'EAF, dans le dôme sous-épithélial (SED) région, se trouve un réseau de cellules dendritiques (CD) entremêlés avec les macrophages, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 + 5-9. Au cœur de chaque follicl PP lymphoïdee sont des cellules dendritiques folliculaires (FDC) et un B riche en cellules germinales centre central, flanqué de zones T interfolliculaires cellules riches. D'échantillonnage de l'antigène par les résultats PP dans le développement de plasmablastes + IgA cellules B et cellules CD4 + mémoires et effectrices que les semences de la lamina propria environnante et offrir une immunité à un large éventail d'envahisseurs muqueuses.

Disséquer les événements immunologiques complexes associées à l'échantillonnage antigène, le traitement et la présentation de PP est une tâche ardue, étant donné que les cellules PP ne constituent qu'une infime partie de la totalité des cellules lymphoïdes dans la muqueuse intestinale. Pour aider à la caractérisation in vitro de cellules dans ce contexte, nous proposons un protocole de préparation total des cellules de souris PP pour la cytométrie en flux et fonctionnelles, ainsi que d'un protocole de préparation PP cryosections pour la microscopie d'immunofluorescence et immunohistochimie. Notre protocole pour l'isolement, la caractérisation et immunomarquage des protocoles d'ententee cellules PP n'est pas nouvelle en soi, comme en témoigne le fait qu'il ya de nombreuses références datant de plus de 25 ans qui citent ces techniques 5,6,9-11. Au contraire, notre protocole prévoit une procédure simplifiée (et visuel) méthode de collecte des enquêteurs PP pour la première fois. Les techniques que nous décrivons sont faciles à maîtriser et facile à produire un grand nombre de cellules avec> 90% de viabilité cellulaire. Le protocole de découpe au cryostat donne hautement reproductibles coupes sériées parfaitement adaptés pour immunofluorescence et la microscopie confocale. En outre, notre protocole complète deux autres articles Jove dernières années. La première, par Fukuda et ses collègues, décrit l'utilisation de tests anse iléale ligaturée à évaluer l'absorption de bactéries pathogènes par les cellules M PP 12. L'autre, par Geem et ses collègues, décrit l'isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de la muqueuse intestinale de la souris, mais exclut explicitement les PP à partir de leur analyse 13.

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Protocol

Les animaux ont été logés dans des classiques, spécifiques exemptes d'agents pathogènes conditions et ont été traitées en parfaite conformité avec les soins du Centre Wadsworth animaux institutionnel et l'utilisation des comités (IACUC) des lignes directrices.

1. Gavage oral

  1. (Facultatif) souche de souris Gavage de choix avec un antigène ou microbes d'intérêt en utilisant un G 22 x1.5-in. aiguille d'alimentation en extrémité franche (Popper scientifique, New Hyde Park, New York). Les volumes de livraison ne doit pas dépasser 400 pi par souris.

2. Isolement de cellules PP pour cytométrie en flux

  1. Euthanasier les souris par le CO 2 asphyxie, selon des soins aux animaux et utilisation comité (IACUC) des lignes directrices.
  2. Nettoyer l'abdomen avec de l'éthanol à 70% ou Bétadine avant la chirurgie. Réaliser une laparotomie standard qui implique un seul (1 cm) incision à l'aide de ciseaux chirurgicaux de qualité le long de la ligne médiane début d'environ 1,5 cm de la base de la cage thoracique. Exposez le parcavité itoneal et identifier le caecum. Snip l'intestin petit terminal à la jonction iléale-caecal et retirez délicatement l'intestin dans son intégralité. Veillez à ne pas hyperextension du tissu intestinal car il est retiré de la cavité péritonéale.
  3. Posez l'intestin grêle sur un lit de serviettes en papier humides ou Kimwipes. Mouiller doucement l'intestin grêle avec une solution saline pour prévenir la déshydratation des tissus. Identifier visuellement PP individuelles situées du côté anti-mésentérique de l'intestin (figure 1). En règle générale, une seule souris de 5 à 10 PP visibles qui sont uniformément réparties dans le duodénum (proximale) à l'iléon (distale). En moyenne, quatre souris va rendement de 23 PP.
  4. Utilisation courbes ciseaux chirurgicaux, doucement d'accise PP individuels et les placer dans une solution froide saline équilibrée de Hank (HBSS). Remarque, les ciseaux doivent être placés courbe vers le haut juste au-dessus du PP et puis doucement appliquée au tissu. D'accise que le PP (pas surrounding tissus) et transfert à l'HBSS froid.
    Remarque: Toutes les incubations et les étapes de centrifugation de ce point de l'article 2 doit être effectuée à 4 ° C afin de préserver la viabilité des cellules.
  5. Transfert PP en 5 ml Spleen dissociation moyen et incuber pendant 15-20 min à 37 ° C tout en agitant vigoureusement à 250 rpm. Le temps d'incubation plus longue affectera négativement la viabilité cellulaire.
  6. À générer une suspension de cellules individuelles, sur un lieu PP stérile (autoclave) 70 um tamis en nylon maille et de force broyer le tissu dans la maille à l'aide de la base d'un plongeur d'une seringue de 1 cc. Alternativement, PP sandwich entre deux givrés stériles lames de microscope (autoclavés dans des enveloppes) et doucement broyer les tissus avec un mouvement de va-et-vient. Utiliser une pipette de transfert stérile pour transférer la suspension de cellules dans un tube de 5 ml Falcon.
  7. Ajouter de l'EDTA à une concentration finale de 1 mM à la suspension cellulaire. Incuber sur un agitateur pour5 min à température ambiante.
  8. Suspension cellulaire décanter à travers un second filtre 70 cellules um pour éliminer les agrégats cellulaires ou autres débris tissulaires. Prélever des cellules dans un tube de 15 ml ou 50 conique.
  9. Cellules soumises à une centrifugation douce (5 min à 500 xg). Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de flux, ce qui est un tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de sérum de veau foetal (FCS).
  10. Pour déterminer le nombre et la viabilité cellulaire, diluer les cellules 1:10 dans du bleu trypan et inspecter visuellement les cellules en utilisant un microscope optique et d'un hémocytomètre. Alternativement, un compteur de cellules comtesse (Invitrogen) ou un instrument similaire peut être utilisée pour énumérer automatiquement le nombre de cellules et leur viabilité.
    Démarrage avec 20-25 PP, ce protocole devrait donner> 2,5 x 10 6 cellules totales. Cela équivaut à ~ 0.8 à 1,2 x 10 6 cellules par souris.

Marquage de l'anticorps de cellules de cytométrie en flux

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  • Distribuer des cellules (10 5 par puits) dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond rond.
  • Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg), et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque.
  • Remettre en suspension les cellules dans un tampon de bloc Fc et incuber sur de la glace pendant 15 min. Bien qu'il existe un certain nombre de blocs de buffers disponibles dans le commerce Fc (par exemple chez le rat anti-souris CD16/CD32, BD Biosciences), nous utilisons simplement milieu usé d'un rat de cellules d'hybridome B (ATCC 2.4.G2) qui sécrète un anticorps monoclonal murin IgG 1 contre Fcy récepteurs pour cette étape.
  • Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg) comme ci-dessus, et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque.
  • Ajouter fluorophore anticorps conjugués directement à des suspensions cellulaires lors de la dilution désirée, et incuber sur de la glace pendant 30 min avec balancement continu.
  • Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg), et décantersurnageant en retournant doucement la plaque.
  • Laver les cellules avec 100 pi de tampon de flux.
  • Centrifuger la plaque à 1.000 xg pendant 5 min, et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque.
  • Resuspendre les cellules tampon 400 ul de fixation, qui se compose de 300 pi de tampon de flux et 100 pi de 1% de paraformaldéhyde dans des MEHP tampon (60 mM PIPES, HEPES 25 mM, 10 mM EGTA, 4 mM de MgCl2 à pH 6).
  • Cellules soumises à la cytométrie de flux en utilisant un FACSCalibur ou équivalent. Analyser les résultats à l'aide du logiciel Cell Quest Pro version 5.2.
  • 3. Préparation de cryosections PP

    1. En prévision de la collecte de tissus, ajoutez une température optimale de coupe (PTOM) composé de 7x7x5 mm moules à base de plastique. Préparer également une piscine de l'azote liquide (> 750 ml) dans un seau dewar ou la glace.
    2. Euthanasier souris et effectuer un laparotamy, comme décrit ci-dessus. Enlever l'intestin et les placer sur du papier absorbant humide.
    3. ÀPP pour isoler cyrosectioning, couper 0,5 cm segments transversaux de l'intestin grêle contenant un seul PP et les tissus transfert à une boîte de Pétri contenant du PBS. Rincer délicatement la lumière de ces segments avec du PBS pour éliminer les débris indésirables fécale.
    4. Placez les segments de tissus intestinaux verticalement à l'intérieur des moules de base contenant octobre Plongez les moules dans de l'azote liquide et permettre au tissu de geler complètement (1-2 min). La couleur de l'OPO va changer du clair au blanc lorsque le tissu est complètement gelé. . Pour un refroidissement plus progressive (par exemple, pour réduire la fissuration des PTOM), les moisissures immerger dans un bain d'isopentane refroidi avec de vapeurs d'azote liquide Remarque: Porter des lunettes de sécurité appropriées lorsque vous travaillez avec de l'azote liquide.
    5. Retirer les moules de base congelée de l'azote liquide en utilisant une pince et de permettre le moule à réchauffer à la température ambiante juste assez longtemps (~ 10-15 secondes) pour permettre aux bords du bloc octobre à ramollir. Pour retirez le bloc congelé de l'OCT dele moule, retourner le moule et appuyez doucement sur le dos pour éjecter le bloc sur un chiffon propre 4 pièces x 4 cm de papier d'aluminium. Immédiatement envelopper le tissu de la feuille et les placer dans un sac spécimen étiqueté stockés dans de l'azote liquide ou de la neige carbonique. Sinon, le transfert de tissus dans un congélateur (<-20 ° C). Utilisez le tissu à l'intérieur d'une semaine, sinon les blocs deviennent fragiles avec l'âge.

    Découpe au cryostat

    1. Coupe à congélation du tissu en utilisant un Leica CM3050S cryomicrotome ou équivalent. La température de la chambre sur le cryostat doit être réglé à -21 ° C.
    2. Efforcez-vous de sections qui sont 12-14 um d'épaisseur.
    3. Recueillir des sections sur Fisher SuperFrost Plus (ou équivalent) des lames de microscope en verre et d'inspecter visuellement à l'aide d'un microscope à faible niveau de lumière électrique. Si plusieurs sections sont recueillies sur une lame, assurez-vous qu'ils sont regroupés pour des applications en aval de coloration.
    4. Magasin de til glisse à température ambiante dans une boîte à lames et, idéalement, de les utiliser dans quelques jours.

    Étiquetage des anticorps cryosections et analyse par microscopie confocale

    1. Immerger les lames dans de l'acétone (ou méthanol) en cuve de coloration des tissus ou supports pendant 2 min. Une incubation prolongée peut causer des tissus à se détacher de la lame.
    2. Transfert de diapositives à cuve de coloration nouvelle et laver 3 fois avec du PBS-T (PBS 1X avec 0,05% de Tween-20) pendant 3 minutes chacun.
    3. Encercler les sections avec un stylo hydrophobe ImmEdge. Cela permettra d'assurer que les réactifs et les anticorps restera confiné à cette région pendant les incubations.
    4. Incuber les lames dans un tampon de bloc (sérum de chèvre 2% dans du PBS) pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée à l'abri de la lumière.
    5. Incuber les lames avec un tampon de bloc Fc (voir ci-dessus) pendant 10 min à 37 ° C.
    6. Tremper dans du PBS-T et sec autour de sections à l'aide Kimwipes ou d'autres tissus absorbant.Prenez soin de ne pas toucher les coupes de tissus réels.
    7. Coupes de tissus de recouvrement avec une solution d'anticorps primaire et incuber pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Anticorps primaire est généralement dilué dans un tampon de bloc à une concentration finale de 20 pg / ml. L'utilisation d'anticorps directement marqués primaires est souhaitable, car pas moins de trois anticorps peuvent être combinés directement à cette étape. Anticorps directement marqués également d'éliminer la nécessité de mesures supplémentaires d'incubation d'anticorps.
    8. Laver les lames 3 fois (5 min chacun) par immersion dans du PBS.
    9. Si nécessaire, des diapositives incuber avec les anticorps secondaires pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humide.
    10. Laver les lames 3 fois (5 min chacun) par immersion dans du PBS.
    11. Incuber les lames pendant 4 min dans du paraformaldéhyde à 1% dans un tampon de MEHP, comme décrit ci-dessus.
    12. Rincer les lames dans du PBS pendant 1 min.
    13. Zone sèche autour des sections à l'aide Kimwipes ou d'autres absorbentent des tissus. Prenez soin de ne pas toucher les coupes de tissus réels. Avec une pipette ou compte-gouttes, placer délicatement une goutte de prolonger à moyen Or montage direct sur la section. Recouvrir d'une lamelle de verre sur le support de montage en prenant soin d'éviter les bulles. Utilisez du papier buvard pour absorber l'excès n'importe quel support de montage.
    14. Joint à lamelles lames de microscope avec vernis à ongles commerciale et laisser sécher à l'air.
    15. Afficher les diapositives avec un Leica TCS SP5 ou équivalent microscope confocal.

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    Representative Results

    L'analyse par cytométrie en flux des suspensions monodisperses de cellules PP totaux révèle une nette distinction entre les préparations de cellules bons et les mauvais. Dans les préparations cellulaires de bonnes relations avec plus de 80% de viabilité, la grande majorité des cellules démontrent une forte diffusion vers l'avant (FSC), un indicateur de volume cellulaire élevée et à faible dispersion latérale (SSC), un indicateur de granularité cellulaire faible (figure 2A). Dans cette expérience, nous avons également volontairement préparé une «préparation cellulaire pauvres» en incubant les cellules PP pendant les étapes d'isolement à la température ambiante (au lieu de sur la glace) et, dans la dernière étape, l'incubation des cellules avec du PBS + 1% de SVF (au lieu de MEHP mémoire tampon). Dans ces préparations cellulaires pauvres, la majorité des cellules présentent une faible FSC et SSC élevé et sont en dehors de la porte indiquée R1 (figure 2B). Ces cellules sont susceptibles apoptose et / ou la nécrose.

    La figure 3 illustre l'utilisation d'un cocktail de jusqu'à quatre différents fluorophore anticorps monoclonaux conjugués à une discrimination entre une variété de types de cellules dans des suspensions cellulaires simples PP. Le marquage avec cluster de différenciation (CD) des marqueurs CD19 et révèlent que les cellules B B220 constituent environ 60% de la population PP cellule fermée (figure 3A). Spécifiques des sous-ensembles de lymphocytes T peuvent être facilement énumérés par double marquage avec des anticorps contre CD3 et CD4 (figure 3B) ou CD3 et CD8 (Figure 3C). CD4 + et CD8 + T constituent ~ 23% et ~ 9%, respectivement, des cellules PP total. DC CD11c + sous-ensembles marqués (figure 3D) et CD103 + (non représenté) peut également être énumérés par cette méthode. CD CD11c + contribuent à environ 8% de la population totale fermée, ce qui équivaut approximativement à 10.000 contrôleurs de domaine par PP. Cette s'accorde exactement avec le nombre de PED observés par autrui 14.

    Parmi la population de CD11c + +. Des résultats similaires sont obtenus lorsque les cellules sont collectées à partir PP C57B / 6 souris (figure 3E).

    Préparations cellulaires «mauvais» peut conduire à des résultats très trompeurs, en grande partie parce que les cellules mortes ou mourantes ont tendance à lier les anticorps non spécifique. Comme le montre la figure 4, la population de cellules qui se colorent positif à la fois pour le marqueur des cellules B (B220) et les marqueurs de cellules T (CD3, partie A, CD4, panneau B) peut varier de plus de 3 fois entre un bon et préparation cellulaire mauvais. La figure 4 montre une surreprésentation des B220 + et CD3 + double-cellules positives (Groupe A), ainsi que B220 + cellules B et cellules T CD4 + double-positives cellules (partie B) dans les préparations cellulaires pauvres. Comme mentionné ci-dessus, la disparité B relative et le nombre de cellules T dans le bien et le pauvre est probablement dû à la liaison non spécifique des anticorps cellules mourantes.

    Notre protocole démontre également que la souris cryosections PP se prêtent à l'analyse histopathologique, ainsi que immunomarquage. Figure 5 compare coloration H & E de la souris PP paraffine (panneaux A, B) et des coupes congelées (partie C). Bien que les sections de paraffine fournir plus de résolution au niveau cellulaire lorsqu'elles sont colorées par H & E, les zones claires et sombres de PP centres germinatifs sont plus facilement délimitées dans les sections cryosection (figures 5A-C). Cryosections H & E teinté sont utiles pour side-by-side de comparaison avec cryosections immunomarquées. Un cryosection typique PP coloré avec anticorps anti-CD3 pour marquer les cellules T, anti-CD11c pour mettre en évidence des anticorps anti-DC et B220 pour mettre en évidence les anticorps des cellules B est illustré à la figure 6.

    Figure 1
    Figure 1. Souris Peyer patches. l'image d'un intestin de souris fraîchement excisée petit compartiment à trois PP visibles (flèches blanches). Les PP apparaissent comme des structures de type blister (5 x 5 mm) sur le côté anti-mésentérique de l'intestin séreuse.

    Figure 2
    Figure 2. Total des cellules PP analysés par cytométrie en flux. Une suspension monodisperse de cellules PP total a été soumis à la cytométrie en flux en utilisant un FACSCallibur BD. (A) Exemple d'une bonne préparation cellulaire. La grande majorité des cellules démontrent une forte diffusion vers l'avant (FSC), un indicateur de volume cellulaire élevée et à faible dispersion latérale (SSC), un indicateur de granularité cellulaire faible. Ces cellules sont encadrés dans R1. Les cellules ayant un faible FSC et SSC haute, située à l'extérieur de la porte R1, sont considérés comme morts ou mourants cellules. (B) Exemple d'une préparation pauvre cellule, dans laquelle la majorité des cellules sont en dehors de la porteR1 raison de la faible FSC et SSC élevé.

    Figure 3
    Figure 3. L'analyse par cytométrie de flux représentant des lymphocytes PP. Monodisperses suspensions de cellules incubées avec PP totaux fluorophore conjugué anticorps primaires, puis soumis à la cytométrie en flux. (A) et B220 étiquetage CD19 des cellules B PP. (BC) double marquage des populations de cellules totales avec CD3 et CD4 (B) ou CD8 (C) des sous-ensembles spécifiques de dénombrer des cellules T. (D) double marquage des populations de cellules totales pour B220 (marqueur des cellules B) et CD11c (marqueur DC). (E) Comparaison B220, CD3 , CD4 et la coloration des cellules CD11c PP de souris BALB / c et les souris C57B / 6.

    Figure 4
    Figure 4. Trompeuses données de cytométrie en flux à la suite de mauvaises préparations de cellules PP. Good (à gauche) et pauvres (panneaux de droite) préparations cellulaires PP ont été colorées avec (A) anticorps B220 et CD3 pour différencier les populations de cellules B et T ou (B) anticorps à B220 et CD4 pour différencier les cellules B à partir d'un sous-ensemble de cellules T. Il ya généralement très peu de cellules de cellules qui se colorent positifs pour CD4 et CD3 ou B220, comme indiqué dans les panneaux de gauche. En revanche, dans des préparations de cellules double-positives pauvres cellules constituent près de 20% du nombre total de cellules. Voir le texte pour plus de détails sur ce qui constitue une préparation "mauvaise" cellule.

    Figure 5
    Figure 5. Représentant H & E coupes colorées PP. Inclus en paraffine sections (A, B) ou cryosections (C) de l'iléon PPs ont été colorées avec H & E et visualisés par microscopie optique. Notez que les zones claires et sombres des follicules lymphoïdes sont facilement délimitées dans les cryosections, en comparaison avec les coupes en paraffine. Abréviations: V, villeux; FAE, follicule associée à l'épithélium; SED, sous-épithéliale dôme; LF, follicules lymphoïdes.

    Figure 6
    Figure 6. Marquage immunofluorescent de cryosections PP murins. Fraîchement coupé coupes de tissus de souris à un seul PP ont été séchés à l'air, fixé à l'acétone, et colorées avec (A) conjugués au FITC anticorps anti-CD3 pour marquer les cellules T dans les régions inter-folliculaires et lamina propria; (B) PE-conjugués d'anticorps anti-CD11c pour mettre en surbrillance le CD dans SED, et (C) APC-conjugués d'anticorps anti-B220 de mettre en évidence les cellules B (D) o Un composite.f images dans des panneaux AC générées à l'aide du logiciel Fidji. La barre d'échelle est de ~ 100 um.

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    Discussion

    Dans cet article, nous avons fourni des protocoles parallèles pour la préparation PP préparations de cellules uniques pour l'analyse par cytométrie en flux et fonctionnelle et cryosections pour immunomarquage. Les deux méthodes sont hautement reproductibles et facilement accessible, à condition d'un cytomètre en flux et cryostat sont disponibles. Pour les enquêteurs première fois, il convient de souligner que, par rapport à la rate, les rendements cellulaires totaux provenant PP sont relativement maigres. Néanmoins, le protocole, nous présentons généralement des rendements compris entre 0,8 à 1,2 x 10 6 cellules totales PP d'une souris. Mise à l'échelle est possible, bien que nous ne tiennent généralement pas plus de 20-25 piscine PP, parce que, dans notre expérience, l'agrégation se produit et les rendements cellulaires (et viabilité) baisse fortement. D'autre part, nous ne recommandons pas d'utiliser moins de 15 PP pour ce protocole, une masse critique est nécessaire pour mener à bien les cellules à travers la procédure d'isolement complet. Si la viabilité cellulaire maximale est une priorité pour aval fonctionnelletests, nous recommandons qu'un petit échantillon de cellules isolées être soumis à une coloration iodure de propidium pour permettre de déclenchement plus précis de la piscine viable de cellules de la population PP total de cellules. Enfin, il convient de noter que notre méthode se prête à des applications de tri cellulaire si un sous-ensemble de cellules spécifique est souhaitée pour le transfert adoptif ou l'analyse in vitro, par exemple.

    La collection des PP pour découpe au cryostat est relativement simple, même si le découpage réel de tissus PP peut être difficile. Il est impératif, par exemple, que les tissus PP sont correctement orientées dans des moules (ie perpendiculaire à la base du moule) pour s'assurer que les sections transversales sont de véritables obtenu. Nous proposons composant logiciel enfichable congélation des tissus en PP et en soumettant ensuite les cryosections à précipiter fixateurs tels que l'acétone ou le méthanol afin de préserver la réactivité des anticorps («antigénicité"), même si la précipitation résultat fixateurs une diminution de la résol cellulaire et sub-cellulaire globaleution. Si la préservation de l'antigénicité n'est pas un problème particulier, nous vous recommandons l'utilisation de réticulation fixateurs tels que le paraformaldéhyde (PFA), qui se traduisent par une meilleure préservation des structures cellulaires et sous-cellulaires. En effet, l'IFP peut être utilisé pour fixer les tissus avant découpe au cryostat. Il suffit de plonger fraîchement excisées PP et abondamment à l'PFA à 4% pour> 2 heures, laver le tissu avec du PBS pour éliminer l'excès de fixateur, équilibrer les tissus en saccharose (15%) si vous le souhaitez, puis incorporer dans un PTOM, tel que décrit ci-dessus. Le tissu peut ensuite être cryosectioned, mais doit être bloqué avec une solution de glycine (0,1 M dans du PBS pendant 15 min) pour étancher réactive résiduelle PFA avant l 'immunomarquage.

    Enfin, alors que nous avons décrit les protocoles de marquage par immunofluorescence de cryosections PP, ces mêmes sections se prêtent à l'immunohistochimie (IHC) en utilisant des kits disponibles dans le commerce IHC (Vector Labs par exemple, Burlingame, CA). Pour IHC, il est indispensable de prévoir une peroxydase de blocage ou QuEnching étape dans le protocole, que les peroxydases endogènes sont très répandues dans la muqueuse intestinale. D'autres ont fait remarquer que pour l'IHC, la perfusion cardiaque des souris avec du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS améliore la préservation des tissus.

    En résumé, nous avons fourni des protocoles parallèles et complémentaires pour l'analyse quantitative et fonctionnelle des cellules murines PP, y compris les lymphocytes et les PED. La préparation des suspensions cellulaires simples permet quantitative et fonctionnelle dans l'analyse in vitro des principaux types de cellules dans les PP, tandis que immunomarquage de coupes congelées fournit des informations concernant la localisation de types cellulaires spécifiques, ainsi que des interactions cellule-cellule qui existent sur ​​place. La principale limite de ces deux approches est que ni représente «temps réel» la visualisation de PP interactions cellule-cellule. Pour le moment du moins, PP ont prouvé imperméable à intravitale imagerie, une technique qui a révolutionné la compréhension des lymphocytes dynamiquementcs dans les ganglions lymphatiques périphériques. Jusqu'à ce que les barrières techniques limitant l'imagerie intravitale de PP sont surmontés, les protocoles décrits dans cet article pour la préparation PP préparations de cellules uniques pour l'analyse par cytométrie en flux et fonctionnelle et cryosections PP immunomarquage restera le principal moyen d'enquêter et de comprendre les fonctions immunologiques de certains sous -populations de cellules en SPA, les sites principaux inducteurs de l'intestin tissus lymphoïdes associés.

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    Disclosures

    Aucun conflit d'intérêt déclaré.

    Acknowledgements

    Nous remercions chanson Renjie (Wadsworth Center de base de cytométrie en flux) de l'aide pour l'analyse cellulaire et Helen Johnson (Wadsworth Center animale Histopathologie de base) pour la préparation de coupes en paraffine. Nous remercions le Dr Richard A. Cole (Wadsworth Center de base Light Microscopy) de l'aide pour la microscopie confocale et collection d'images. Nous tenons à remercier Andy Bentley (Wadsworth Center Photo et illustration) à l'aide d'animations.

    MDJ est soutenu par la Fondation Life Sciences Research, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA est soutenu par un Wadsworth Center-Health Research Inc bourse de recherche postdoctorale intra-muros. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH HD061916 et GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

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    References

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