Isolera och immunofärgning Lymfocyter och dendritiska celler från murina Peyers plack

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Det finns ett ökande intresse för att förstå de immunologiska funktioner specifika subpopulationer av celler i Peyers plack (PP), de primära induktiva platser av tarmar-associerade lymfoida vävnader. Här redogör vi för parallella protokoll för beredning PP encelliga förberedelserna för flödescytometrisk analys och PP kryosnitt för immunfärgning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Peyers plack (PP) är integrerade delar av tarmen-associerade lymfoida vävnader (GALT) och spelar en central roll i tarmen immunosurveillance och homeostas. Partikelformiga antigener och mikrober i tarmlumen kontinuerligt samplas av PP M-celler i follikel-associerade epitel (FAE) och transporteras till ett underliggande nätverk av dendritiska celler (DC), makrofager och lymfocyter. I den här artikeln beskriver vi protokoll där murina köpkraftsstandarder (i) dissocieras till enkelcellsuspensioner och utsattes för flödescytometri och (ii) beredd på cryosectioning och immunfärgning. För flödescytometri, PP är dissocierades mekaniskt och filtrerades sedan genom 70 um membran för att generera enkelcellsuspensioner fria från epitelceller och stora skräp. Starta med 20-25 PP (från fyra möss), ger detta snabb och reproducerbar metod en population av> 2,5 x 10 6 celler med> 90% cellviabilitet. För cryosectioning, färskaly isolerade PP är nedsänkta i Optimal Cutting Temperature (oktober) medium snabbfrystes i flytande kväve och sedan sektioneras med en cryomicrotome. Vävnadssnitt (5-12 pm) är luft-torkades, fixerades med aceton eller metanol, och utsattes sedan för immunomärkning.

Introduction

Peyers plack (PP) är makroskopiska aggregat av organiserade lymfoida folliklar som finns i hela tunntarmen hos människor och möss (Figur 1) och utgör de primära platser där slemhinnan immunsvar inleds mot kosten antigener, bakteriefloran, mikrobiella patogener och orala vacciner 1-4. Till skillnad från andra perifera lymfoida vävnader såsom kröslymfknutor PP saknar afferenta lymfkärlen. Som sådana, adaptiva immunsvar i PP drivs som svar på antigener härledda från tarmlumen. Provtagningen av luminala antigener åstadkommes den genom follikelstimulerande associerade epitel (FAE), vilket består av både enterocyter och antigen-provtagning celler kända som M-celler. Under FAE, i sub-epiteliala kupol (SED) regionen, ligger ett nätverk av dendritiska celler (DC) blandade med makrofager, B-celler och CD4 + T-celler 5-9. Kärnan i varje PP lymfoid follicle är follikulära dendritiska celler (FDC) och en B-cell-rika centrala germinal center, flankerad av T-cell-rika interfollikulära zoner. Antigen provtagning av PPS resulterar i utvecklingen av IgA + B-celler plasmablasts och CD4 + effektor och minnesceller att utsäde omgivande lamina propria och ge immunitet mot en rad till slemhinnor inkräktare.

Dissekera de komplexa immunologiska händelser som är associerade med antigen provtagning, behandling och presentation i PPS är en svår uppgift med tanke på att PP celler utgör bara en liten del av de totala lymfoida celler i tarmslemhinnan. För att underlätta in vitro karaktärisering av celler i denna miljö ger vi ett protokoll för beredning totala mus PP celler för flödescytometrisk och funktionell analys, samt ett protokoll för att förbereda PP kryosnitt för immunofluorescensmikroskopi och immunhistologi. Vår protokoll för isolering, karakterisering och immunfärgning av samförståndsavtale PP celler är inte ny i sig, vilket framgår av det faktum att det finns många referenser som går tillbaka mer än 25 år som citerar dessa tekniker 5,6,9-11. Snarare ger vår protokollet en strömlinjeformad (och visuell) metod för utredarna samlar PP för första gången. Teknikerna vi beskriver lätt bemästras och lätt ge stora antal celler med> 90% cellviabilitet. Den cryosectioning Protokollet ger mycket reproducerbara seriella sektioner idealiskt lämpade för immunofluorescensfärgning och konfokal avbildning. Dessutom kompletterar vårt protokoll två andra nya Jove artiklar. Den första av Fukuda och kollegor, beskriver användningen av ligerade ileal loop analyser för att bedöma upptag av patogena bakterier genom PP M-celler 12. Den andra, som Geem och kollegor, beskriver isolering och karaktärisering av DCS och makrofager från mus tarmslemhinnan, men uttryckligen utesluter PP från deras analys 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djuren hölls under konventionella, specifika patogenfria förhållanden och behandlades i full överensstämmelse med Wadsworth Center Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer.

1. Oral sondmatning

  1. (Valfritt) sondmatning musstam val med antigen eller mikrober av intresse med en 22 G x1.5 in. trubbig ände utfodring nål (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Leveransvolymerna bör inte överstiga 400 ul per mus.

2. Isolering av PP celler för flödescytometri

  1. Avliva möss av CO 2 kvävning, enligt den institutionella djuromsorg och använda kommitté (IACUC) riktlinjer.
  2. Rengör buken med 70% etanol eller betadin före operation. Utför en vanlig laparotomi som omfattar en enda (1 cm) med användning av snitt kirurgisk kvalitet sax längs mittlinjen början ca 1,5 cm från botten av bröstkorgen. Exponera peritoneal hålrum och identifiera blindtarmen. Klippa terminalen tunntarmen vid ileala-cecal korsningen och ta försiktigt bort tarmen i sin helhet. Se till att inte översträcka tarmvävnaden när den tas bort från bukhålan.
  3. Lägg tunntarmen på en bädd av fuktiga pappershanddukar eller Kimwipes. Blöt tunntarmen försiktigt med saltlösning för att förhindra uttorkning vävnad. Visuellt identifiera enskilda PP belägna på anti-mesenteriska sidan av tarmen (figur 1). Typiskt har en enda mus 5 till 10 synliga PP som är jämnt fördelade från duodenum (proximala) till ileum (distala). I genomsnitt kommer fyra möss ger 23 PP.
  4. Använda böjda kirurgiska saxar, försiktigt punktskatter enskilda PPS och placera dem i kallt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Observera bör sax placeras kurva uppåt strax ovanför PP och sedan försiktigt appliceras på vävnaden. Excise endast PP (inte surrounding vävnad) och transfer till kall HBSS.
    Obs: Alla inkubationer och steg centrifugering från denna punkt framåt i avsnitt 2 ska göras vid 4 ° C för att bevara cellviabilitet.
  5. Överför PP i 5 ml Spleen Dissociation Medium och inkubera under 15-20 minuter vid 37 ° C under kraftig skakning vid 250 varv per minut. Längre inkubationstid kommer att negativt påverka cellviabiliteten.
  6. Att generera en enda cellsuspension, placera PP på en steril (autoklaverad) 70 xm nylonnät cellfilter och med kraft mala vävnaden i nätet med basen av en kolv från en 1 cc spruta. Alternativt smörgås PP mellan två frostade sterila bilder glas mikroskop (autoklaveras i kuvert) och försiktigt slipa vävnader med en fram och tillbakagående rörelse. Använd en steril överföringspipett att överföra cellsuspensionen i ett 5 ml Falcon-rör.
  7. Lägg EDTA till en slutlig koncentration av 1 mM till cellsuspensionen. Inkubera på en rocker för5 min vid rumstemperatur.
  8. Dekantera cellsuspension genom en andra 70 im cellfilter för att avlägsna eventuella kvarvarande cellulära aggregat eller vävnadsrester. Samla cellerna i en 15 eller 50 ml koniska rör.
  9. Ämne celler till försiktig centrifugering (5 min vid 500 xg). Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i flödet buffert, som är fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% fetalt kalvserum (FCS).
  10. För att bestämma cellantalet och viabilitet, späd celler 1:10 till trypanblått och visuellt inspektera celler med användning av ljusmikroskop och en hemocytometer. Alternativt, kan en grevinna cellräknare (Invitrogen) eller liknande instrument användas för att automatiskt räkna cellantal och livsduglighet.
    Från och med 20-25 PPS, bör detta protokoll ger> 2,5 x 10 6 totalt celler. Detta motsvarar ~ 0,8-1,2 x 10 6 celler per mus.

Antikropp märkning av celler för flödescytometri

<ol start = "11">
  • Dispensera celler (10 5 per brunn) i brunnar på en 96-brunnars rundbottnad platta.
  • Ämne platta till försiktig centrifugering (5 minuter vid 1.000 xg), och dekantera supernatanten genom att försiktigt vända plattan.
  • Resuspendera celler i Fc-blockbuffert och inkubera på is under 15 minuter. Även om det finns ett antal kommersiellt tillgängliga Fc blockera buffertar (t.ex. råtta anti-mus CD16/CD32, BD Biosciences), använder vi bara använt medium från en råtta B-cell hybridom (ATCC 2.4.G2) som utsöndrar en monoklonal IgG 1 mot murina Fcy receptorer för detta steg.
  • Ämne platta till försiktig centrifugering (5 minuter vid 1.000 xg) såsom ovan, och dekantera supernatanten genom att försiktigt vända plattan.
  • Lägg fluorofor-konjugerade antikroppar direkt till cellsuspensioner vid önskad utspädning, och inkubera på is under 30 minuter med kontinuerlig skakning.
  • Ämne platta till försiktig centrifugering (5 minuter vid 1.000 xg), och dekanterasupernatanten genom att försiktigt vända plattan.
  • Tvätta cellerna med 100 | il av flödet buffert.
  • Centrifugera platta vid 1.000 x g under 5 minuter, och dekantera supernatanten genom att försiktigt vända plattan.
  • Återsuspendera cellerna 400 pl fixering buffert, som består av 300 pl av flödet buffert och 100 pl 1% paraformaldehyd i PHEM-buffert (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgClj 2 vid pH 6).
  • Ämne celler att flödescytometri med en FACSCalibur eller motsvarande. Analysera resultat med hjälp av Cell Quest Pro version 5,2.
  • 3. Framställning av PP kryosnitt

    1. Inför vävnad samling, lägga Optimal Cutting Temperature (oktober) förening till 7x7x5 mm plastbas formar. Också utarbeta en pool av flytande kväve (> 750 ml) i en dewar eller ishink.
    2. Euthanize mus och utföra en laparotamy, såsom beskrivits ovan. Ta tarm och plats på våta pappershanddukar.
    3. Tillisolera PP för cyrosectioning, skär 0,5 cm tvärgående segment av tunntarmen som innehåller en enda PP och överföra vävnad till en petriskål innehållande PBS. Försiktigt skölja lumen av dessa segment med PBS för att avlägsna oönskade fekal skräp.
    4. Placera tarmvävnad segment vertikalt inuti bas formar som innehåller oktober Sänk formarna i flytande kväve och tillåta vävnad att frysa fullständigt (1-2 minuter). Färgen på oktober kommer att ändras från klar till vit när vävnaden är helt frusen. . För en mer gradvis kylning (t.ex. för att minska sprickbildning i oktober), sänk mögel i ett bad med isopentan kyld med flytande kväve ångor Obs: Använd lämpliga skyddsglasögon vid arbete med flytande kväve.
    5. Avlägsna frysta bas formar från det flytande kvävet med pincett och låta formen att värmas vid rumstemperatur precis tillräckligt länge (~ 10-15 sek) för att tillåta kanter ULT blocket att mjukna. För att sedan ta bort det frusna block av oktober frånformen, vänd formen och tryck försiktigt på baksidan för att mata blocket på ett rent 4 x 4 cm bit aluminiumfolie. Omedelbart linda vävnaden i folie och placera det i en märkt påse prov lagrades i flytande kväve eller torris. Alternativt, överför vävnaden i en frys (<-20 ° C). Använd vävnaden inom en vecka, annars blocken blir spröda med åldern.

    Cryosectioning

    1. Kryosnittet vävnaden med hjälp av en Leica CM3050S cryomicrotome eller motsvarande. Kammaren temperatur på kryostaten sättas till -21 ° C.
    2. Sträva efter sektioner som är 12-14 nm i tjocklek.
    3. Samla delar till Fisher SuperFrost Plus (eller motsvarande) glas objektglas och inspektera visuellt med hjälp av en vanlig låg mikroskop strömindikator. Om flera sektioner samlas på en bild, se till att de är grupperade tillsammans för nedströms färgning applikationer.
    4. Förvara tHan glider vid rumstemperatur i en bild låda och helst använda dem inom några dagar.

    Antikroppsmärkning av kryosnitt och konfokalmikroskopi analys

    1. Doppa objektglasen i aceton (eller metanol) i vävnadsfärgning burk eller rack för 2 minuter. Förlängd inkubation kan orsaka vävnad att lossna från objektglaset.
    2. Överför objektglasen till nya färgning burk och tvätta 3 gånger med PBS-T (1X PBS med 0,05% Tween-20) under 3 min vardera.
    3. Omringa avsnitten med ImmEdge hydrofob penna. Detta kommer att säkerställa att reagens och antikroppar kommer att förbli begränsad till detta område under inkubationer.
    4. Inkubera objektglasen i blockbuffert (2% getserum i PBS) under 30 minuter vid 37 ° C i en befuktad kammare, skyddas från ljus.
    5. Inkubera objektglasen med Fc-blockbuffert (se ovan) under 10 min vid 37 ° C.
    6. Doppa objektglasen i PBS-T och torrt runt sektioner med Kimwipes eller annat absorberande vävnad.Se till att inte röra själva vävnadssnitt.
    7. Overlay vävnadssnitt med primär antikropp lösning och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C i en fuktad kammare. Primär antikropp typiskt utspädd i blockeringsbuffert till en slutlig koncentration av 20 pg / ml. Användningen av direkt-märkta primära antikroppar är önskvärd, eftersom så många som tre antikroppar kan kombineras direkt vid detta steg. Direkt-märkta antikroppar eliminerar också behovet av ytterligare steg antikroppar inkubation.
    8. Tvätta objektglasen 3 ggr (5 min vardera) genom nedsänkning i PBS.
    9. Vid behov, inkubera objektglasen med relevanta sekundära antikroppar under 30 min vid 37 ° C i en fuktkammare.
    10. Tvätta objektglasen 3 ggr (5 min vardera) genom nedsänkning i PBS.
    11. Inkubera objektglasen i 4 min i 1% paraformaldehyd i PHEM-buffert, såsom beskrivits ovan.
    12. Skölj objektglasen med PBS under 1 min.
    13. Torr området runt sektioner med Kimwipes eller andra absorberarent vävnad. Se till att inte röra själva vävnadssnitt. Med hjälp av en pipett eller pipett, försiktigt placera en droppe Förläng guld monteringsmedium direkt på sektionen. Applicera ett täckglas på monteringsmedium noga med att undvika bubblor. Använd läskpapper för att absorbera överflödig monteringsmedium.
    14. Seal täckglas till objektglas med kommersiell nagellack och låt lufttorka.
    15. Visa bilder med en Leica TCS SP5 eller motsvarande konfokalmikroskop.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Flödescytometrisk analys av monodispersa suspensioner av totalt PP celler avslöjar en klar skillnad mellan bra och dåliga cellpreparat. I goda cellpreparat med över 80% livsduglighet, det stora flertalet av celler visar hög framåtspridning (FSC), en indikator av hög cellvolym, och låg sidospridning (SSC), en indikator på låg cell granularitet (figur 2A). I detta experiment, vi avsiktligt utarbetat en "dålig cellberedning" genom inkubering PP celler under isolering stegen i rumstemperatur (i stället för på is) och i det sista steget, inkubera celler med PBS plus 1% FCS (i stället för PHEM buffert). I dessa dåliga cellberedningar, majoriteten av cellerna uppvisar låg FSC och hög SSC och är utanför de angivna grinden R1 (figur 2B). Dessa celler är sannolikt genomgår apoptos och / eller nekros.

    Figur 3 visar användningen av en cocktail av upp till fyra different fluorofor-konjugerade monoklonala antikroppar för att diskriminera mellan olika celltyper i PP enkelcellsuspensioner. Märkning med kluster av differentiering (CD) markörer CD19 och B220 visar att B-celler utgör ~ 60% av den grindade PP cellpopulationen (figur 3A). Specifika T-cell undergrupper kan lätt räknas genom dubbel märkning med antikroppar mot CD3 och CD4 (figur 3B) eller CD3 och CD8 (figur 3C). CD4 + och CD8 + T-celler utgör ~ 23% och ~ 9%, av de totala cellerna PP. DC delmängder märkt CD11c + (Figur 3D) och CD103 + (ej visad) kan också räknas med denna metod. CD11c + DC bidrar till ungefär 8% av den totala gated befolkningen, vilket motsvarar ungefär 10.000 utvecklingsländerna per PP. Detta håller exakt med antalet DC observerats av andra 14.

    Bland befolkningen i CD11c + +. Liknande resultat erhålles när PP celler samlas in från C57B / 6 möss (figur 3E).

    "Dålig" cellpreparat kan leda till mycket missvisande resultat, till stor del beroende döda eller döende celler tenderar att binda antikroppar ospecifikt. Såsom visas i figur 4, den population av celler som färgar positivt för både B-cellmarkör (B220) och T-cell-markörer (CD3, panel A, CD4, panel B) kan variera med mer än 3-faldigt mellan en bra och dålig cellberedningen. Figur 4 visar en överrepresentation av B220 + och CD3 + dubbel-positiva celler (panel A), samt B220 + B-celler och CD4 + T-celler dubbel-positiva celler (panel B) i fattiga cellpreparat. Såsom nämnts ovan, skillnaden i relativ B och T-cellantal i god kontra dålig beror sannolikt på icke-specifik bindning av antikroppar döende celler.

    Vår protokoll visar också att mus PP kryosnitt är mottagliga för histopatologisk analys, liksom immunomärkning. Figur 5 jämför H & E-färgning av mus PP paraffin (paneler A, B) och frusna sektioner (panel C). Medan paraffinsnitt ger mer upplösning på cellnivå när färgas av H & E, ljusa och mörka områden av PP germinalcentra är lättare avgränsade i kryosnittet sektioner (figur 5A-C). H & E-färgade kryosnitt är användbara för sida-vid-sida jämförelse med immunolabeled kryosnitt. En typisk PP kryosnittet färgades med anti-CD3-antikroppar för att märka de T-celler, anti-CD11c antikroppar att belysa DC och anti-B220-antikroppar för att markera B-celler visas i figur 6.

    Figur 1
    Figur 1. Mus Peyers patches. Bild av en nyligen utskuren mus tunntarmen med tre synliga PPS (vita pilar). PPS visas som blister-liknande strukturer (5 x 5 mm) på anti-mesenteriska sidan av den intestinala slemhinnorna.

    Figur 2
    Figur 2. Totalt PP celler analyserade genom flödescytometri. En monodispers suspension av totala PP-celler utsattes för flödescytometri med användning av en BD FACSCallibur. (A) Exempel på en god cellberedning. Den stora majoriteten av celler visar hög framåtspridning (FSC), en indikator av hög cellvolym, och låg sidospridning (SSC), en indikator på låg cell granularitet. Dessa celler är inramade i R1. Celler med låg FSC och SSC hög, ligger utanför R1 grind, anses döda eller döende celler. (B) Exempel på en dålig cellpreparation, i vilken majoriteten av cellerna är utanför portenR1 på grund av låg FSC och hög SSC.

    Figur 3
    Figur 3. Representativ flödescytometrisk analys av PP lymfocyter. Monodispersa suspensioner av totala PP-celler inkuberades med fluorofor-konjugerade primära antikroppar och utsattes sedan för flödescytometri. (A) CD19 och B220 märkning av PP B-celler. (BC) Dubbel-märkning av totala cellpopulationer med CD3 och CD4 (B) eller CD8 (C) för att räkna specifika T cell subsets. (D) Dubbel-märkning av totala cellpopulationer för B220 (B-cellmarkör) och CD11c (DC-markör). (E) Jämförelse B220, CD3 , CD4 och CD11c färgning på PP celler från BALB / c och C57B / 6 möss.

    Figur 4
    Figur 4. Vilseledande flödescytometriska data som en följd av dåliga PP cellpreparationer. Good (vänster paneler) och dålig (högra panelerna) PP cellpreparat färgades med (A) antikroppar mot B220 och CD3 att skilja B-och T-celler populationer eller (b) antikroppar till B220 och CD4 att differentiera B-celler från en undergrupp av T-celler. Det är i allmänhet mycket få celler av celler som färgar positivt för B220 och CD3 eller CD4, såsom visas i de vänstra panelerna. I motsats, vid dåliga cellberedningar dubbel-positiva celler utgör nästan 20% av de totala cellerna. Se text för mer information om vad som utgör en "dålig" cellberedning.

    Figur 5
    Figur 5. Representant H & E-färgade sektioner PP. Paraffininbäddade sektioner (A, B) eller kryosnitt (C) av ileum PPs färgades med H & E och visualiserades genom Ijusmikroskopi. Observera att ljusa och mörka zonerna av de lymfoida folliklar lätt avgränsas i kryosnitten, jämfört med paraffinsnitt. Förkortningar: V, villösa, FAE, follikel-associerat epitel, SED, sub-epitelial kupol, LF, lymfoid follikel.

    Figur 6
    Figur 6. Immunofluorescerande märkning av murina PP kryosektioner. Skära Nyligen vävnadssnitt av en enda mus PP lufttorkades, aceton-fasta, och färgades med (A) FITC-konjugerade anti-CD3-antikroppar för att märka de T-celler i de inter-follikulära regioner och lamina propria, (B) PE-konjugerade anti-CD11c antikroppar att belysa DC i SED, och (C) APC-konjugerade anti-B220-antikroppar för att markera B-celler (D) En komposit o..f bilder i paneler AC genereras med hjälp Fiji programvara. Skala bar är ~ 100 nm.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I den här artikeln har vi tillhandahållit parallella protokoll för beredning PP encelliga förberedelser för flödescytometrisk och funktionell analys och kryosnitt för immunfärgning. Båda metoderna är mycket reproducerbara och lätt åtkomliga, tillhandahålls en flödescytometer och kryostat finns tillgängliga. För första gången utredare bör påpekas att jämfört med mjälte, totalt cellutbyten från PP är relativt magert. Trots protokollet vi beskriva allmänhet ger mellan 0,8-1,2 x 10 6 totalt PP celler från en enda mus. Skala upp är möjligt, även om vi vanligtvis inte poolen mer än 20-25 PPS, eftersom det i vår erfarenhet sker aggregering och ger cell (och livskraft) nedgång kraftigt. Å andra sidan, rekommenderar vi inte använder färre än 15 PP för detta protokoll, som en kritisk massa är nödvändig för att framgångsrikt genomföra de celler genom hela isoleringsförfarandet. Om maximal cellviabilitet är en prioritet för nedströms funktionellaanalyser, rekommenderar vi att ett litet urval av isolerade celler utsättas för propidiumjodidfärgning att möjliggöra mer exakt gating den livskraftiga pool av celler från den totala PP cellpopulationen. Slutligen bör det noteras att vår metod är mottaglig för cellsortering ansökningar om en specifik cell delmängd önskas för adoptiv överföring eller in vitro-analys, till exempel.

    Insamlingen av PP för cryosectioning är relativt enkelt, även om den faktiska sektionering av PP vävnader kan vara en utmaning. Det är absolut nödvändigt, till exempel, att PP vävnad är korrekt orienterade i formar (dvs. vinkelrätt mot basen av formen) för att säkerställa att sanna tvärgående sektioner erhålles. Vi föreslår snabbfrysning PP vävnader och därefter utsätta kryosnitten att utfällning fixativ som aceton eller metanol för att bevara antikroppsreaktivitet ("antigenicitet"), även om utfällning fixativ resulterar i en minskning i det totala cellulära och sub-cellulära resolmepannor. Om bevara antigenicitet inte är ett särskilt problem, rekommenderar vi användning av tvärbindande fixativ som paraformaldehyd (PFA), vilket resulterar i bättre bevarande av cellulära och sub-cellulära strukturer. I själva verket kan PFA kan användas för att fixera vävnaderna innan cryosectioning. Bara Doppa nyexciderade PP i kopiösa mängder av 4% PFA för> 2 timmar, tvätta vävnad med PBS för att avlägsna överskott av fixativ, jämvikt vävnad i sackaros (15%) om så önskas, och sedan bädda i OCT, såsom beskrivits ovan. Vävnaden kan sedan cryosectioned, men måste blockeras med glycin-lösning (0,1 M i PBS under 15 minuter) för att släcka återstående reaktiva PFA före immunfärgning.

    Slutligen, medan vi har beskrivit protokoll för immunofluorescerande märkning av PP kryosnitt, samma delar är mottagliga för immunohistokemi (IHC) med kommersiellt tillgängliga IHC kit (t.ex. Vector Labs, Burlingame, CA). För IHC, är det viktigt att inkludera ett peroxidas blockering eller quenching steg i protokollet, eftersom endogena peroxidaser är mycket vanligt förekommande i tarmslemhinnan. Andra har noterat att för IHC, förbättrar hjärt perfusion av mössen med 4% paraformaldehyd i PBS vävnad bevarande.

    Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit parallella och kompletterande protokoll för kvantitativ och funktionell analys av murina PP celler, inklusive lymfocyter och DCS. Framställningen av enkelcellsuspensioner möjliggör kvantitativ och funktionell in vitro-analys av de viktigaste celltyperna i PPS, medan immunomärkning av kryosnitt ger information om lokaliseringen av specifika celltyper, såväl som cell-cell-interaktioner som finns på plats. Den primära begränsningen av båda dessa tillvägagångssätt är att varken representerar "realtid" visualisering av PP-cell-cell-interaktioner. För tillfället åtminstone, har PP visat ogenomtränglig för intravital avbildning, en teknik som har revolutionerat förståelsen av lymfocyter dynamisktcs i perifera lymfkörtlar. Tills de tekniska hindren begränsar intravital avbildning av PPS övervinns, protokollen beskrivs i den här artikeln för att förbereda PP encelliga förberedelser för flödescytometrisk och funktionell analys och PP kryosnitt för immunfärgning förblir det primära sättet att undersöka och förstå de immunologiska funktioner specifika sub -populationer av celler i PP, de primära induktiva platser av gut-associerade lymfoida vävnader.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgements

    Vi tackar Renjie Song (Wadsworth Center flödescytometri Core) för att få hjälp i cell analys och Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopathology Core) för beredning av paraffinsektioner. Vi tackar Dr Richard A. Cole (Wadsworth Center Ljus Mikroskopi Core) för hjälp med konfokalmikroskopi och bildsamling. Vi vill tacka för Andy Bentley (Wadsworth Center-bild och illustration) för att få hjälp med animationer.

    MDJ stöds av Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA stöds av en Wadsworth Center-Health Research Inc. Intramural postdoktorsstipendium. Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag HD061916 och GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics