Isolere og farging Lymfocytter og dendrittiske celler fra Murine Peyer er Patches

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Det er en økende interesse for å forstå de immunologiske funksjoner til spesifikke subpopulasjoner av celler i Peyer er patcher (PPS), den primære induktive områder av gut-tilknyttede lymfevev. Her skisserer vi parallelle protokoller for å forberede PP encellete forberedelsene til flowcytometrisk analyse og PP cryosections for farging.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Peyer er patcher (PPS) er integrerte komponenter av gut-tilknyttede lymfevev (GALT) og spille en sentral rolle i intestinal immunosurveillance og homeostase. Partikulære antigener og mikrober i intestinal lumen er kontinuerlig samplet av PP M celler i hårsekken-assosiert epitel (FAE) og transportert til et underliggende nettverk av dendrittiske celler (DCS), makrofager og lymfocytter. I denne artikkelen beskriver vi protokoller hvor murine PPs er (i) dissosiert til enkle cellesuspensjoner og underkastet flowcytometri og (ii) fremstilt for cryosectioning og farging. Ved flowcytometri, PPS er mekanisk dissosiert og deretter filtrert gjennom 70 mikrometer membraner å generere enkle cellesuspensjoner fri av epitelceller og stort rusk. Starter med 20-25 PPs (fra fire mus), gir denne raske og reproduserbar metode en befolkning på> 2,5 x 10 6 celler med> 90% celleviabilitet. For cryosectioning, friskly isolerte PPs er nedsenket i Optimal Cutting Temperatur (OCT) medium, snap-frossen i flytende nitrogen, og deretter delt med en cryomicrotome. Vevssnitt (5-12 mikrometer) er luft-tørket, fast med aceton eller metanol, og deretter underkastet immunolabeling.

Introduction

Peyer er patcher (PPS) er makroskopiske aggregater av organiserte lymfoide follikler stede gjennom hele tynntarmen hos mennesker og mus (figur 1) og utgjør den primære områder hvor mucosal immunreaksjoner er initiert mot kosttilskudd antigener, commensal bakterier, mikrobielle patogener, og muntlig vaksiner 1-4. I motsetning til andre perifere lymfoide vev som mesenteric lymfeknuter, PPs mangler afferente lymfekar. Som sådan, adaptive immunresponser i PPS drives i respons til antigener avledet fra intestinal lumen. Prøvetaking av luminal antigener oppnås den ved follicle-assosiert epitel (FAE), som består av både enterocytter og antigen-sampling celler kjent som M celler. Under FAE, i sub-epiteliale kuppel (SED) region, ligger et nettverk av dendrittiske celler (DCS) blandet med makrofager, B-celler, og CD4 + T celler 5-9. I kjernen av hver PP lymfoid follicle er follikulære dendrittiske celler (FDCs) og en B-celle-rik sentrale germinal sentrum, flankert av T celle-rik interfollicular soner. Antigen prøvetaking av PP resultater i utviklingen av IgA + B-celle plasmablasts og CD4 + effektor og minne celler som frø rundt lamina propria og gi immunitet til et bredt spekter til mucosal inntrengere.

Dissekere de komplekse immunologiske hendelser assosiert med antigen prøvetaking, behandling og presentasjon i PPs er en vanskelig oppgave, med tanke på at PP-celler utgjør bare en liten brøkdel av de totale lymfoide celler i tarmslimhinnen. For å hjelpe i in vitro karakterisering av celler i dette miljøet, gir vi en protokoll for fremstilling totale mus PP celler for flowcytometrisk og funksjonell analyse, så vel som en protokoll for fremstilling PP cryosections for immunfluorescens mikroskopi og immunohistology. Vår protokoll for isolering, karakterisering og farging av mouse PP-celler er ikke romanen per se, noe som gjenspeiles av det faktum at det er mange referanser dateres tilbake mer enn 25 år som siterer disse teknikkene 5,6,9-11. Snarere gir vår protokoll en strømlinjeformet (og visuelle) metode for etterforskerne samle PPs for første gang. Teknikkene vi beskriver er lett mestret og lett gi et stort antall celler med> 90% celleviabilitet. Den cryosectioning protokollen gir svært reproduserbare seriesnitt ideell for immunfluorescens flekker og confocal imaging. Videre utfyller vår protokoll to andre nyere Jove artikler. Den første, etter Fukuda og kolleger, beskriver bruken av ligert ileal sløyfe analyser å vurdere opptaket av patogene bakterier av PP M celler 12. Den andre, etter Geem og kolleger beskriver isolering og karakterisering av DCS og makrofager fra musen tarmslimhinnen, men eksplisitt utelukker PPs fra deres analyse 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrene ble plassert under konvensjonelle, spesifikke patogen-frie forhold og ble behandlet i full overensstemmelse med Wadsworth Center Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) retningslinjer.

1. Oral sonde

  1. (Valgfritt) gavage mus stamme av valg med antigen eller mikrober interessepunkt ved hjelp av en 22 G x1.5-in. butt-end fôring nål (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Leveransevolum bør ikke overstige 400 pl per mus.

2. Isolering av PP celler for flowcytometri

  1. Avlive mus ved CO 2 kvelning, ifølge institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (IACUC) retningslinjer.
  2. Rens magen med 70% etanol eller Betadine før operasjonen. Utføre en standard laparotomi som involverer en enkelt (1 cm) snitt med kirurgisk karakter saks langs midtlinjen begynnelsen ca 1,5 cm fra bunnen av brystkassen. Utsett peritoneal hulrom og identifisere cecum. Klipp terminalen tynntarmen ved ileal-cecal krysset og ta forsiktig tarmen i sin helhet. Pass på å ikke hyperextend tarmvevet som det blir fjernet fra bukhulen.
  3. Lå tynntarmen på en seng av fuktige papirhåndklær eller Kimwipes. Fukt tynntarmen forsiktig med saltvann for å forhindre vev dehydrering. Visuelt identifisere individuelle PPs ligger på anti-mesenteriske side av tarmen (Figur 1). Vanligvis har en enkelt mus 5-10 synlige PPs som er jevnt fordelt fra duodenum (proksimale) til ileum (distale). I gjennomsnitt vil fire mus gi 23 PPs.
  4. Bruke buede kirurgisk saks, forsiktig avgifter individuelle PPS og plassere dem i kaldt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Merk bør saks plasseres kurve-side opp like over PP og deretter forsiktig brukt til vevet. Avgiftsdirektoratet bare PP (ikke omgivelsene tilng vev) og overføring til kalde HBSS.
    Merk: Alle inkubasjoner og sentrifugering skritt fra dette punktet fremover i § 2 bør gjøres ved 4 ° C for å bevare celleviabilitet.
  5. Overfør PPs inn 5 ml Spleen Dissosiasjon Medium og inkuber i 15-20 min ved 37 ° C under kraftig risting på 250 rpm. Lengre inkubasjonstid vil negativt påvirke celle levedyktighet.
  6. Å generere en enkelt cellesuspensjon, place PPs på et sterilt (autoklavert) 70 um nylonmesh celle sil og tvang slipe vevet inn i mesh ved hjelp av basen av en plunger fra en 1 ml sprøyte. Alternativt, sandwich PPs mellom to frostet sterile glass objektglass (autoklaveres i konvolutter) og forsiktig slipe vev med en frem og tilbake bevegelse. Bruke steril overføringspipetten å overføre cellesuspensjonen i et 5 ml Falcon-rør.
  7. Legg EDTA til en endelig konsentrasjon på 1 mM til cellesuspensjonen. Inkuber på en rocker for5 minutter ved romtemperatur.
  8. Decant cellesuspensjon gjennom en andre 70 mikrometer celle sil for å fjerne eventuelle gjenværende mobilnettet tilslag eller vev rusk. Samle celler i en 15 eller 50 ml konisk rør.
  9. Underlagt celler til milde sentrifugering (5 min ved 500 xg). Dekanter supernatanten og resuspender cellene i flyt buffer, som er fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1% føtalt kalveserum (FCS).
  10. Å bestemme celle nummer og levedyktighet, fortynne celler 01:10 til trypan blå og visuelt inspisere cellene ved hjelp av et lysmikroskop og hemocytometer. Alternativt kan et grevinne celleteller (Invitrogen) eller lignende instrument brukes til automatisk telle celleantall og levedyktighet.
    Starter med 20-25 PP, bør denne protokollen gi> 2,5 x 10 6 totalt celler. Dette tilsvarer ~ 0,8 til 1,2 x 10 6 celler per mus.

Antistoff Merking av celler for flowcytometri

<ol start = "11">
  • Dispense celler (10 5 per brønn) i brønner i en 96-brønns rundbunnet plate.
  • Underlagt plate til milde sentrifugering (5 min ved 1000 xg), og dekanter supernatanten med forsiktig invertere plate.
  • Resuspender celler i Fc blokk buffer og inkuberes på is i 15 min. Mens det er en rekke kommersielt tilgjengelige Fc blokk buffere (f.eks rotte CD16/CD32 anti-mus, BD Biosciences), vi bare bruke brukt medium fra en rotte B celle hybridom (ATCC 2.4.G2) som utskiller et monoklonalt IgG 1 mot muse Fcγ reseptorer for dette trinnet.
  • Underlagt plate til milde sentrifugering (5 min ved 1000 xg) som ovenfor, og dekanter supernatanten med forsiktig invertere plate.
  • Legg fluorofor-konjugerte antistoffer direkte til cellesuspensjoner ved ønsket fortynning, og inkuber på is i 30 min med kontinuerlig gynge.
  • Underlagt plate til milde sentrifugering (5 min ved 1000 xg), og dekantersupernatanten med forsiktig invertere plate.
  • Vask cellene med 100 ul av flyt buffer.
  • Sentrifuger plate på 1,000 xg i 5 min, og dekanter supernatanten med forsiktig invertere plate.
  • Resuspender celler 400 pl fiksering buffer, som består av 300 pl av flyt buffer og 100 ul av 1% paraformaldehyd i PHEM buffer (60 mm rør, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2 ved pH 6).
  • Emne celler til strømningscytometri bruker FACSCalibur eller tilsvarende. Analysere resultatene ved hjelp Cell quest Pro-programvare versjon 5.2.
  • 3. Utarbeidelse av PP Cryosections

    1. I forkant av vev samling, legge Optimal Cutting Temperatur (OCT) forbindelsen til 7x7x5 mm plast base muggsopp. Også forberede en pool av flytende nitrogen (> 750 ml) i en Dewar eller isen bøtte.
    2. Avlive mus og utføre en laparotamy, som beskrevet ovenfor. Fjern tarmen og legg på våte papirhåndklær.
    3. Tilisolere PP for cyrosectioning, kuttet 0,5 cm tverrgående segmenter av tynntarmen som inneholder en enkelt PP og overføring vevet til en petriskål som inneholder PBS. Forsiktig skylle lumen av disse segmentene med PBS å fjerne uønsket fekal avfall.
    4. Plasser intestinal vev segmenter vertikalt inne basen muggsopp inneholder oktober Fordyp formene i flytende nitrogen og la vevet å fryse helt (1-2 min). Fargen på oktober endres fra klar til hvit når vevet er fullstendig frosset. . For en mer gradvis avkjøling (f.eks for å redusere oppsprekking av OCT), fordype mold i et badekar med isopentan kjøles med flytende nitrogen damp Merk: Bruk egnede vernebriller når du arbeider med flytende nitrogen.
    5. Fjern frosne uedle muggsopp fra flytende nitrogen ved hjelp av pinsett og tillate formen å varmes opp ved romtemperatur akkurat lenge nok (~ 10-15 sek) for å tillate at kantene av oktober blokken å mykne. For deretter fjerne den frosne blokk av OCT fraformen, snu formen og trykk forsiktig på baksiden for å løse blokken på en ren 4 x 4 cm stykke aluminiumsfolie. Umiddelbart vikle vevet i folien, og plasser i en merket prøven pose lagret i flytende nitrogen eller på tørris. Alternativt overføre vev i en fryser (<-20 ° C). Bruk vevet innen en uke, ellers blokkene vil bli sprø med alderen.

    Cryosectioning

    1. Cryosection vevet ved hjelp av en Leica CM3050S cryomicrotome eller tilsvarende. Kammeret temperatur på kryostaten bør settes til -21 ° C.
    2. Strebe etter seksjoner som er 12-14 mikrometer i tykkelse.
    3. Samle deler bort på Fisher SuperFrost Plus (eller tilsvarende) glass objektglass og inspisere visuelt ved hjelp av en standard low power lysmikroskop. Hvis flere seksjoner blir samlet på et lysbilde, sørge for at de er gruppert sammen for nedstrøms flekker applikasjoner.
    4. Butikken tHan glir ved romtemperatur i et lysbilde boks og helst bruke dem i løpet av få dager.

    Antistoff Merking av Cryosections og konfokalmikroskopi Analyse

    1. Immerse lysbilder i aceton (eller metanol) i vevet farging krukke eller stativer for 2 min. Forlenget inkubasjon kan forårsake vev til å løsne fra lysbildet.
    2. Overføre lysbilder til ny farging krukke og vask 3 ganger med PBS-T (1X PBS med 0,05% Tween-20) i 3 min hver.
    3. Omringe delene med en ImmEdge hydrofobe penn. Dette vil sikre at reagenser og antistoffer vil forbli begrenset til dette området i løpet inkubasjoner.
    4. Inkuber lysbilder i blokk-buffer (2% geit serum i PBS) i 30 minutter ved 37 ° C i en fuktet kammer, beskyttet mot lys.
    5. Inkuber objektglassene med Fc blokk buffer (se ovenfor) i 10 min ved 37 ° C.
    6. Dyppglass i PBS-T og tørt område rundt på deler ved hjelp Kimwipes eller annet absorberende vev.Pass på å ikke berøre de faktiske vev seksjoner.
    7. Overleggsplan vevssnitt med primær antistoff løsning og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i en fuktet kammer. Primære antistoff er vanligvis fortynnet i blokk-buffer til en endelig konsentrasjon på 20 pg / ml. Bruken av direkte-merkede primære antistoffer er ønskelig, fordi så mange som tre antistoffer kan kombineres direkte på dette trinnet. Direkte-merkede antistoffer også eliminere behovet for ytterligere antistoff inkubasjon trinn.
    8. Vask glir tre ganger (5 minutter), ved nedsenkning i PBS.
    9. Om nødvendig, inkuber lysbilder med relevante sekundære antistoffer for 30 min ved 37 ° C i en fukt kammer.
    10. Vask glir tre ganger (5 minutter), ved nedsenkning i PBS.
    11. Inkuber lysbilder etter 4 min i 1% paraformaldehyd i PHEM buffer, som beskrevet ovenfor.
    12. Skyll lysbilder med PBS i 1 min.
    13. Tørt område rundt snitt under Kimwipes eller andre absorbereent vev. Pass på å ikke berøre de faktiske vev seksjoner. Ved hjelp av en pipette eller dropper, forsiktig plasserer en dråpe Forleng Gold monteringsmedium direkte på seksjonen. Påfør et dekkglass på monteringsmedium ta vare å unngå bobler. Bruk trekkpapir til å absorbere overflødig montering medium.
    14. Seal dekkglass til objektglass med kommersiell neglelakk og la det lufttørke.
    15. Vise lysbilder med en Leica TCS SP5 eller tilsvarende confocal mikroskop.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Flowcytometrisk analyse av monodisperse suspensjoner av totalt PP-celler avslører et klart skille mellom gode og dårlige cellepreparater. I gode cellepreparater med over 80% levedyktighet, det store flertallet av celler demonstrere høy fremover scatter (FSC), en indikator på høy celle volum, og lav side scatter (SSC), en indikator på lav celle detaljnivå (figur 2A). I dette eksperimentet, vi også forsettlig forberedt en "dårlig celleforberedelsen" ved inkubering PP celler under isolasjonscellene trinnene ved romtemperatur (i stedet for på is), og i det siste trinnet, inkubering celler med PBS pluss 1% FCS (istedenfor PHEM buffer). I disse fattige cellepreparater, flertallet av cellene oppviser lav FSC og høy SSC og ligger utenfor angitte gate R1 (figur 2B). Disse cellene blir sannsynlig gjennomgår apoptose og / eller nekrose.

    Figur 3 viser bruken av en cocktail av opptil fire different fluoroforen-konjugerte monoklonale antistoffer til å diskriminere mellom ulike celletyper i PP encellete suspensjoner. Merking med klynge av differensiering (CD) markører CD19 og B220 avslører at B-celler utgjør ~ 60% av gated PP cellepopulasjon (figur 3A). Spesifikke T celle undergrupper kan lett nummerert av dobbel merking med antistoffer mot CD3 og CD4 (figur 3B) eller CD3 og CD8 (Figur 3C). CD4 + og CD8 + T-celler utgjør ~ 23% og ~ 9%, henholdsvis av de totale PP celler. DCS delmengder merket CD11c + (figur 3D) og CD103 + (ikke vist) kan også være nummerert med denne metoden. CD11c + DCs bidra til om lag 8% av den totale gated befolkningen, som tilsvarer omtrent 10 000 DCs per PP. Dette stemmer nøyaktig med antall utviklingsland observert av andre 14.

    Blant befolkningen i CD11c + +. Lignende resultater oppnås når PP celler hentet fra C57B / 6 mus (figur 3E).

    "Dårlig" cellepreparater kan føre til svært misvisende resultater, hovedsakelig fordi døde eller døende celler har en tendens til å binde antistoffer ikke-spesifikt. Som vist i figur 4, den populasjon av celler som flekken positivt for både B-celle markør (B220) og T-celle markører (CD3, panel A, CD4, panel B) kan variere med mer enn tre ganger mellom en god og dårlig celleforberedelsen. Fig. 4 viser en over representasjon av B220 + og CD3 + dobbel-positive celler (panel A), så vel som B220 + B-celler og CD4 + T celler dobbel-positive celler (panel B) i fattige cellepreparater. Som nevnt ovenfor, den forskjellen i relativ B og T celle tall i god versus dårlig er sannsynlig på grunn av ikke-spesifikk binding av antistoffer døende celler.

    Vår protokollen demonstrerer også at mus PP cryosections er mottagelig for histopatologiske analyser, samt immunolabeling. Figur 5 sammenligner H & E farging av mus PPs parafin (panelene A, B) og frosne seksjoner (panel C). Mens parafinsnitt gi mer oppløsning på cellenivå når farget av H & E, lyse og mørke soner av PP germinal sentre er lettere avgrensa i cryosection seksjoner (figur 5A-C). H & E-farget cryosections er nyttige for side-by-side-sammenligning med immunolabeled cryosections. En typisk PP cryosection farget med anti-CD3 antistoffer å merke de T-celler, anti-CD11c antistoffer å markere DCS og anti-B220 antistoffer å utheve B-celler er vist i figur 6.

    Figur 1
    Figur 1. Mus Peyer er patches. Bilde av en fersk excised mus tynntarmen med tre synlige PPs (hvite piler). PPS vises som blister-lignende strukturer (5 x 5 mm) på anti-mesenteriske side av intestinal serosa.

    Figur 2
    Figur 2. Sum PP celler analysert ved strømningscytometri. En monodispers suspensjon av totale PP celler ble underkastet flowcytometri hjelp en BD FACSCallibur. (A) Eksempel på en god celle forberedelse. De aller fleste av celler demonstrere høy fremover scatter (FSC), en indikator på høy celle volum, og lav side scatter (SSC), en indikator på lav celle granularitet. Disse cellene er innrammet i R1. Celler med lav FSC og høy SSC, lokalisert utenfor R1 gate, er ansett døde eller døende celler. (B) Eksempel på en dårlig celleforberedelsen, hvor flertallet av cellene er utenfor portenR1 grunnet lav FSC og høy SSC.

    Figur 3
    Figur 3. Representativt flowcytometrisk analyse av PP lymfocytter. Monodisperse suspensjoner av totale PP celler inkubert med fluorofor-konjugerte primære antistoffer og deretter underkastet strømningscytometri. (A) CD19 og B220 merking av PP B-celler. (BC) Dobbel-merking av totale cellepopulasjoner med CD3 og CD4 (B) eller CD8 (C) til å nummerere spesifikke T celle undergrupper. (D) Double-merking av totalt cellepopulasjoner for B220 (B-celle markør) og CD11c (DC markør). (E) Sammenligning B220, CD3 , CD4, og CD11c flekker på PP celler fra BALB / c og C57B / 6 mus.

    Figur 4
    Figur 4. Villedende flowcytometri data som følge av dårlige PP cellepreparater. Gode (paneler venstre) og dårlige (høyre panel) PP celle preparater ble farget med (A) antistoffer mot B220 og CD3 å skille B og T celle populasjoner eller (B) antistoffer til B220 og CD4 å differensiere B-celler fra en undergruppe av T-celler. Det er generelt svært få celler av celler som flekken positivt for B220 og CD3 eller CD4, som vist i venstre paneler. I kontrast, i dårlig cellepreparater dobbel-positive celler utgjør nesten 20% av de totale celler. Se teksten for flere detaljer om hva som utgjør en "dårlig" celleforberedelsen.

    Figur 5
    Figur 5. Representant H & E-farget PP seksjoner. Parafin-innebygde seksjoner (A, B) eller cryosections (C) av ileal PPs ble farget med H & E og synliggjort ved lysmikroskopi. Merk at de lyse og mørke soner av lymfoide follikler er lett avgrenset i cryosections, sammenlignet med parafinsnitt. Forkortelser: V, villous, FAE, follicle-tilknyttede epitel, SED, sub-epitelial dome, LF, lymfoid hårsekken.

    Figur 6
    Figur 6. Immunofluorescerende merking av murine PP cryosections. Nyklipt vevssnitt av en enkelt mus PP var lufttørret, aceton-fast, og farget med (A) FITC-konjugert anti-CD3 antistoffer å merke de T-celler i de inter-follikulære regioner og lamina propria, (B) PE-konjugert anti-CD11c antistoffer til å markere DCs i SED, og (C) APC-konjugerte anti-B220 antistoffer å utheve B celler (D) En kompositt o.f bilder i paneler AC generert ved hjelp Fiji programvare. Målestokk er ~ 100 mikrometer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I denne artikkelen har vi gitt parallelle protokoller for å forberede PP encellete forberedelsene til flowcytometrisk og funksjonell analyse og cryosections for farging. Begge metodene er meget reproduserbare og lett tilgjengelig, forutsatt et flowcytometer og kryostat er tilgjengelig. For første gang undersøkere det skal påpekes at i forhold til milt, totale celleutbytter fra PPs er relativt dårlig. Likevel, protokollen vi skissere generelt gir mellom 0,8 til 1,2 x 10 6 totalt PP celler fra en enkelt mus. Oppskalering er mulig, selv om vi vanligvis ikke bassenget mer enn 20-25 PP, fordi vår erfaring, oppstår aggregering og celleutbytter (og levedyktighet) nedgang sterkt. På den annen side, anbefaler vi ikke å bruke færre enn 15 PPs for denne protokollen, som en kritisk masse er nødvendig for å kunne gjennomføre cellene gjennom hele isolasjon prosedyren. Hvis maksimal celleviabilitet er en prioritet for nedstrøms funksjonellanalyser, anbefaler vi at en liten prøve av isolerte celler utsettes for propidium iodide flekker å tillate mer nøyaktig gating den levedyktig pool av celler fra den totale PP cellepopulasjon. Til slutt bør det bemerkes at vår metode er mottagelig til celle sortering programmer hvis en bestemt celle delsett er ønskelig for adoptiv overføring eller in vitro analyse, for eksempel.

    Samlingen av PPs for cryosectioning er relativt grei, selv om den faktiske seksjonering av PP vev kan være utfordrende. Det er viktig, for eksempel at PP vev er riktig orientert i former (dvs. vinkelrett på bunnen av formen) for å sikre at ekte tverrgående seksjoner oppnås. Vi foreslår snap-frysepunktet PP vev og deretter utsette cryosections å utfelling fiksativer som aceton eller metanol for å bevare antistoff reaktivitet ("antigenisitet"), selv om utløsende fiksativer resulterer i en reduksjon i total cellulær og sub-cellulære resolution. Hvis bevare antigenisitet er ikke en spesiell bekymring, så vi anbefaler bruk av kryssbinding fiksativ som paraformaldehyd (PFA), som resulterer i bedre bevaring av mobilnettet og sub-mobilnettet strukturer. Faktisk kan PFA brukes til å fikse vev før cryosectioning. Bare leve ferskt utskårende PPs i rikelige mengder av 4% PFA for> 2 hr, vask vev med PBS for å fjerne overskudd fiksativ, equilibrate vev i sukrose (15%) om ønsket, og deretter legge i OCT, som beskrevet ovenfor. Vevet kan deretter cryosectioned, men må bli blokkert med glycin-løsning (0,1 M i PBS i 15 min) for å slukke gjenværende reaktive PFA før farging.

    Til slutt, mens vi har beskrevet protokoller for immunofluorescent merking av PP cryosections, de samme delene er mottagelig for immunhistokjemi (IHC) med kommersielt tilgjengelige IHC kits (f.eks Vector Labs, Burlingame, CA). For IHC, er det viktig å ta med en peroksidase blokkerer eller quenching trinn i protokollen, som endogene peroxidases er svært utbredt i tarmslimhinnen. Andre har bemerket at for IHC, forbedrer hjerte perfusjon av musene med 4% paraformaldehyd i PBS vev bevaring.

    Oppsummert har vi gitt parallelle og komplementære protokoller for kvantitative og funksjonell analyse av murine PP celler, inkludert lymfocytter og DCS. Fremstillingen av enkle cellesuspensjoner muliggjør kvantitativ og funksjonelle in vitro analyse av de store celletyper i PPS, mens immunolabeling av cryosections gir informasjon vedrørende lokalisering av spesifikke celletyper, samt celle-celle interaksjoner som eksisterer i situ. Den primære begrensning av begge disse tilnærmingene er at verken representerer "real time" visualisering av PP celle-celle interaksjoner. For øyeblikket minst, har PPs vist ugjennomtrengelig for intravital bildebehandling, en teknikk som har revolusjonert forståelsen av lymfocytt dynamics i perifere lymfeknuter. Inntil de tekniske barrierene som begrenser intravital avbildning av PP er overvunnet, protokollene er beskrevet i denne artikkelen for å forberede PP encellete forberedelsene til flowcytometrisk og funksjonell analyse og PP cryosections for farging vil forbli den viktigste måten å utforske og forstå de immunologiske funksjoner til spesifikke sub -populasjoner av celler i PPs, primærnæringene induktive områder av gut-tilknyttede lymfevev.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklært.

    Acknowledgements

    Vi takker Renjie Song (Wadsworth senter flowcytometri Core) for å få hjelp i celle analyse og Helen Johnson (Wadsworth senter Animal Histopatologi Core) for utarbeidelse av parafinsnitt. Vi takker Dr. Richard A. Cole (Wadsworth senter Light Mikroskopi Core) for å få hjelp med konfokalmikroskopi og bildesamling. Vi ønsker å erkjenne Andy Bentley (Wadsworth Center Bilde og illustrasjon) for å få hjelp med animasjoner.

    MDJ støttes av Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA er støttet av en Wadsworth Center-Helse Research Inc. egenutført postdoktorstipend. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd HD061916 og GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics