Isolering og immunfarvning Lymfocytter og dendritiske celler fra murine Peyerske plaks

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Der er en stigende interesse for at forstå de immunologiske funktioner af specifikke subpopulationer af celler i Peyerske plaques (PP), de primære induktive steder af tarm-associerede lymfoide væv. Her skitserer vi parallelle protokoller til fremstilling PP encellede forberedelserne til flowcytometrisk analyse og PP kryosektioner for immunfarvning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Peyerske plaques (PP) er uadskillelige dele af tarmen-associerede lymfoide væv (GALT) og spiller en central rolle i intestinal immunosurveillance og homeostase. Partikelformige antigener og mikrober i det intestinale lumen kontinuerligt samplet af PP M-celler i follicle-associerede epitel (FAE) og transporteres til et underliggende netværk af dendritiske celler (DC'er), makrofager og lymfocytter. I denne artikel beskriver vi protokoller, i hvilke murine PPs er (i) dissocieret til enkeltcelle-suspensioner og underkastet strømningscytometri og (ii) forberedt til cryosectioning og immunfarvning. Til flowcytometri, er PP dissocieret mekanisk og derefter filtreret gennem 70 um membraner til at generere enkeltcelle-suspensioner fri for epitelceller og stort affald. Startende med 20-25 PPs (fra fire mus), den hurtige og reproducerbar metode giver en population af> 2,5 x 10 6 celler med> 90% cellelevedygtighed. For cryosectioning, friskely isolerede PP'er nedsænkes i Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, lynfrosset i flydende nitrogen og derefter gennemskåret med et cryomicrotome. Vævssnit (5 til 12 um) er lufttørret, fikseret med acetone eller methanol, og derefter underkastet immunolabeling.

Introduction

Peyerske plaques (PP) er makroskopiske aggregater af organiserede lymfoide follikler stede i hele tyndtarmen hos mennesker og mus (figur 1) og udgør de primære steder, hvor mucosale immunresponser der indledes over diæt antigener, kommensale bakterier, mikrobielle patogener samt orale vacciner 1-4. I modsætning til andre perifere lymfoide væv såsom mesenteriallymfeknuder, mangler PPs afferente lymfekar. Som sådan, adaptive immunrespons hos PP drives som reaktion på antigener afledt fra det intestinale lumen. Udtagning af prøver af luminale antigener opnås det ved follikel-associerede epitel (FAE), som består af både enterocytter og antigen-sampling celler kendt som M-celler. Under FAE, i sub-epithelial kuppel (SED) region ligger et netværk af dendritiske celler (DC'er) blandet sammen med makrofager, B-celler og CD4 + T-celler 5-9. Kernen i hvert PP lymfoide follicle er follikulære dendritceller (FDC'er) og en B-celle-rige centrale germinal center, flankeret af T-celle-rige interfollicular zoner. Antigen prøveudtagning af PP resulterer i udviklingen af IgA + B-celle plasmablasts og CD4 +-effektor-og memory-celler, at frø den omgivende lamina propria og giver immunitet over for en lang række til mucosale angribere.

Dissekere de komplekse immunologiske hændelser, der er forbundet med antigen prøvetagning, behandling og præsentation i PP er en skræmmende opgave, i betragtning af at PP-celler udgør kun en lille brøkdel af de samlede lymfoide celler i tarmslimhinden. Til hjælp i in vitro karakterisering af celler i dette miljø, vi leverer en protokol til fremstilling af total muse PP-celler til flowcytometrisk og funktionel analyse, samt en protokol for at forberede PP kryosektioner for immunfluorescensmikroskopi og immunhistologi. Vores protokol til isolering, karakterisering og immunfarvning af aftalememorandae PP-celler er ikke ny i sig selv, som det fremgår af den kendsgerning, at der er talrige referencer helt tilbage mere end 25 år, der citerer disse teknikker 5,6,9-11. Snarere vores protokol giver en strømlinet (og visuelt) metode for efterforskerne indsamler PPs for første gang. De teknikker, vi beskriver, er let styr og let danner et stort antal celler med> 90% cellelevedygtighed. Den cryosectioning protokol giver meget reproducerbare seriesnit ideelt egnede til immunfluorescensfarvning og konfokal billeddannelse. Desuden er vores protokol supplerer to andre nylige Jupiter artikler. Den første, som Fukuda og kolleger, beskriver anvendelsen af ligerede ileal løkke-assays for at vurdere optagelsen af patogene bakterier ved PP M celler 12. Dels ved Geem og kolleger, beskriver isoleringen og karakteriseringen af DC'er og makrofager fra mus tarmslimhinden, men udelukker udtrykkeligt PPs fra deres analyse 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrene blev opstaldet under konventionelle, specifikke patogenfrie betingelser og blev behandlet i fuld overensstemmelse med Wadsworth Centers Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC) retningslinjer.

1. Oral gavage

  1. (Valgfrit) gavage musestamme af valg med antigen eller mikrober af interesse ved hjælp af en 22 G x1.5-in. stump-ende fodring nål (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Levering mængder bør ikke overstige 400 pi per mus.

2. Isolering af PP celler til flowcytometri

  1. Aflive mus ved CO 2 kvælning, efter institutionel dyrepleje og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer.
  2. Rens maven med 70% ethanol eller Betadine forud for operationen. Udfør en standard laparotomi, der involverer en enkelt (1 cm) indsnit ved hjælp af kirurgiske kvalitet saks langs midterlinjen start omkring 1,5 cm fra bunden af ​​brystkassen. Udsætte pritoneal hulrum og identificere coecum. Røverkøb terminalen tyndtarmen på ileal-cecal vejkryds og fjern forsigtigt tarmen i sin helhed. Sørge for ikke at hyperextend tarmvævet som det bliver fjernet fra det peritoneale hulrum.
  3. Lå tyndtarmen på en seng af fugtige papirhåndklæder eller Kimwipes. Fugt tyndtarmen forsigtigt med saltvand for at forhindre væv dehydrering. Visuelt identificere individuelle PPs beliggende på anti-mesenterisk side af tarmen (fig. 1). Typisk en enkelt mus har 5 til 10 synlige PPs der er jævnt fordelt fra duodenum (proximale) til ileum (distal). I gennemsnit vil fire mus giver 23 PPs.
  4. Brug buede kirurgiske sakse, blidt punktafgifter individuelle PPS og placere dem i koldt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Bemærk bør saks placeres kurve opad lige over PP og derefter forsigtigt på væv. Excise kun PP (ikke surrounding væv) og overføres til kolde HBSS.
    Bemærk: Alle inkubationer og centrifugeringstrin fra dette punkt og fremad i afsnit 2 bør ske ved 4 ° C for at bevare cellelevedygtighed.
  5. Overfør PP i 5 ml Spleen Dissociation Medium og inkuberes i 15-20 min ved 37 ° C under kraftig omrystning ved 250 rpm. Længere inkubationstid vil indvirke negativt på cellernes levedygtighed.
  6. At frembringe en enkelt cellesuspension, place PPs på et sterilt (autoklaveret) 70 um nylon mesh cell strainer og med magt male vævet i masken med bunden af ​​et stempel fra en 1 ml sprøjte. Alternativt sandwich PPs mellem to matterede sterile mikroskopobjektglas (autoklaveret i kuverter) og forsigtigt male væv med en frem og tilbage bevægelse. Anvende en steril transfer pipette til at overføre cellesuspensionen i en 5 ml Falcon-rør.
  7. Tilføj EDTA til en slutkoncentration på 1 mM til cellesuspensionen. Inkuber på en rocker for5 min ved stuetemperatur.
  8. Dekanteres cellesuspension gennem en anden 70 pm cell strainer at fjerne eventuelle resterende cellulære aggregater eller vævsrester. Indsamle celler i en 15 eller 50 ml konisk rør.
  9. Nævnte celler til forsigtig centrifugering (5 min ved 500 x g). Fradekanteres supernatanten og resuspender celler i flow-puffer, som er phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% føtalt kalveserum (FCS).
  10. At bestemme celletal og levedygtighed, fortyndes cellerne 1:10 i trypanblåt og visuelt inspicere celler under anvendelse af et lysmikroskop og et hæmocytometer. Alternativt kan en Grevinde celletæller (Invitrogen) eller lignende instrument anvendes til automatisk optælle celleantal og levedygtighed.
    Startende med 20-25 PPs bør denne protokol opnåelse> 2,5 x 10 6 totale celler. Dette svarer til ~ 0,8-1,2 x 10 6 celler pr mus.

Antistof mærkning af celler for Flowcytometri

<ol start = "11">
  • Dispensere celler (10 5 per brønd) i brønde i en 96 brønds rundbundet plade.
  • Om plade til forsigtig centrifugering (5 min ved 1.000 x g), og dekanter supernatanten ved forsigtigt at vende pladen.
  • Resuspender cellerne i Fc-blok-puffer og inkuberes på is i 15 minutter. Mens der er en række kommercielt tilgængelige Fc blok puffere (f.eks rotte antimus CD16/CD32, BD Biosciences), vi blot bruge brugt medium fra et rotte B-celle-hybridoma (ATCC 2.4.G2), der secernerer et monoklonalt IgG 1 mod murin Fcy receptorer for dette trin.
  • Om plade til forsigtig centrifugering (5 min ved 1.000 x g) som ovenfor, og dekanter supernatanten ved forsigtigt at vende pladen.
  • Tilføj fluorofor-konjugerede antistoffer direkte til cellesuspensioner ved ønskede fortynding og inkuberes på is i 30 min under kontinuert rystning.
  • Om plade til forsigtig centrifugering (5 min ved 1.000 x g), og der dekanteresSupernatanten ved forsigtigt at vende pladen.
  • Vask cellerne med 100 ul strøm-puffer.
  • Centrifuger plader ved 1000 x g i 5 minutter, og dekanter supernatanten ved forsigtigt at vende pladen.
  • Resuspender cellerne 400 pi fiksering buffer, som består af 300 pi flow puffer og 100 pi af 1% paraformaldehyd i PHEM-puffer (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl2 ved pH 6).
  • Nævnte celler til flowcytometri under anvendelse af et FACSCalibur eller tilsvarende. Analyser resultater ved hjælp af Cell Quest Pro software version 5,2.
  • 3. Fremstillinq af PP kryosektioner

    1. Forud for væv indsamling, tilføje Optimal Cutting Temperatur (OLT) forbindelse til 7x7x5 mm plast base forme. Også forberede en pulje af flydende nitrogen (> 750 ml) i en Dewar eller ice bucket.
    2. Aflive mus og udføre en laparotamy, som beskrevet ovenfor. Fjern tarmen og sted på våd papirhåndklæder.
    3. Tilisolere PPs for cyrosectioning, skåret 0,5 cm tværgående segmenter af tyndtarmen, som indeholder en enkelt PP og overføre vævet til en petriskål indeholdende PBS. Blidt skylles hulrummet i disse segmenter med PBS for at fjerne uønsket fækalt affald.
    4. Anbring intestinale vævssegmenter lodret inde uædle forme indeholdende oktober Fordyb formene i flydende nitrogen og tillade vævet at fryse helt (1-2 minutter). Farven af ​​OLT skifter fra klar til hvid, når vævet er fuldt frosset. For en mere gradvis afkøling (fx at reducere revnedannelse i OLT), Note nedsænke skimmel i et bad af isopentan afkølet med flydende nitrogen dampe:. Bær passende sikkerhedsbriller når der arbejdes med flydende nitrogen.
    5. Fjern frosne basis forme fra den flydende nitrogen under anvendelse af en pincet og lade formen til at varme op ved stuetemperatur lige lang nok (~ 10-15 sec) for at tillade kanterne af oktober blokken at blødgøre. Sådan derefter fjerne den frosne blok af OCT fraformen vendes formen og trykke forsigtigt på bagsiden for at skubbe blokken på en ren 4 x 4 cm stykke aluminiumfolie. Umiddelbart wrap vævet i folie og anbringes i et mærket prøve pose opbevares i flydende nitrogen eller tøris. Som alternativ kan vævet i en fryser (<-20 ° C). Brug væv inden for en uge, ellers blokkene vil blive skøre med alderen.

    Cryosectioning

    1. Kryosektion vævet under anvendelse af en Leica CM3050S cryomicrotome eller tilsvarende. Kammertemperaturen på kryostaten skal indstilles på -21 ° C.
    2. Stræb efter sektioner, der er 12-14 um i tykkelse.
    3. Saml sektioner over på Fisher SuperFrost Plus (eller tilsvarende) mikroskopobjektglas og inspicere visuelt ved hjælp af en standard laveffekt lysmikroskop. Hvis flere sektioner bliver indsamlet på et dias, skal du sikre, at de er samlet i en klynge for downstream farvning applikationer.
    4. Store than glider ved stuetemperatur i et dias kasse og helst bruge dem inden for et par dage.

    Antistofmærkning af kryosektioner og konfokal mikroskopi Analyse

    1. Nedsænkes objektglassene i acetone (eller methanol) i vævsfarvning krukke eller stativer i 2 min. Langvarig inkubation kan forårsage væv at løsne sig fra diaset.
    2. Overførsel objektglassene nye farvning krukke og vask 3 gange med PBS-T (1X PBS med 0,05% Tween-20) i 3 min hver.
    3. Omringe afsnittene med et ImmEdge hydrofob pen. Dette sikrer, at reagenser og antistoffer vil forblive begrænset til det pågældende område i inkubationer.
    4. Inkubér objektglas i blok puffer (2% gedeserum i PBS) i 30 minutter ved 37 ° C i et fugtigt kammer, beskyttet mod lys.
    5. Inkuber objektglassene med Fc-blok-puffer (se ovenfor) i 10 minutter ved 37 ° C.
    6. Dip dias i PBS-T og tørt område omkring sektioner ved hjælp af Kimwipes eller andet absorberende væv.Pas på ikke at røre ved de faktiske vævssnit.
    7. Overlay vævssnit med primær antistofopløsning og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Primært antistof typisk fortyndet i blok buffer til en slutkoncentration på 20 ug / ml. Anvendelsen af ​​direkte-mærkede primære antistoffer er ønskelig, fordi så mange som tre antistoffer kan kombineres direkte på dette trin. Direkte-mærkede antistoffer også eliminere behovet for yderligere antistof inkubationstrin.
    8. Wash glider 3 gange (5 minutter hver) ved neddypning i PBS.
    9. Om nødvendigt, inkuberes objektglassene med relevante sekundære antistoffer i 30 minutter ved 37 ° C i en fugt kammer.
    10. Wash glider 3 gange (5 minutter hver) ved neddypning i PBS.
    11. Inkubere objektglassene i 4 minutter i 1% paraformaldehyd i PHEM puffer, som beskrevet ovenfor.
    12. Skyl objektglassene med PBS i 1 min.
    13. Tør området omkring sektioner ved hjælp af Kimwipes eller anden absorbereent væv. Pas på ikke at røre ved de faktiske vævssnit. Ved hjælp af en pipette eller dropper, blidt placere en dråbe af Forlæng Guld monteringsmedium direkte på afsnittet. Påfør et dækglas på holderen medium sørger for at undgå bobler. Brug trækpapir til at absorbere overskydende montage medium.
    14. Seal dækglas til objektglas med kommerciel neglelak og lad dem lufttørre.
    15. Se dias med et Leica TCS SP5 eller tilsvarende konfokal mikroskop.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Flowcytometrisk analyse af monodisperse suspensioner af den samlede PP-celler afslører en klar skelnen mellem gode og dårlige cellepræparater. I gode cellepræparater med over 80% levedygtighed, viser det store flertal af celler med høj forward scatter (FSC), en indikator for høj cellevolumen, og lav sidespredning (SSC), en indikator for lav celle granulering (figur 2A). I dette eksperiment har vi også bevidst fremstillet en "dårlig cellepræparat" ved inkubering PP-celler under isoleringstrin ved stuetemperatur (i stedet for på is), og i det sidste trin, inkubere cellerne med PBS plus 1% FCS (i stedet for PHEM buffer). I disse dårlige cellepræparater, udviser størstedelen af cellerne lav FSC og høj SSC og er uden den angivne port R1 (figur 2B). Disse celler sandsynligvis undergår apoptose og / eller nekrose.

    Figur 3 viser anvendelse af en cocktail af op til fire different fluorofor-konjugerede monoklonale antistoffer til at skelne mellem forskellige celletyper i PP enkeltcelle-suspensioner. Mærkning med klynge af differentiering (CD) markører CD19 og B220 viser, at B-celler udgør ~ 60% af de gatede PP cellepopulation (figur 3A). Specifikke T-celledelmængder let kan optælles ved dobbelt mærkning med antistoffer mod CD3 og CD4 (figur 3B) eller CD3 og CD8 (figur 3C). CD4 + og CD8 + T-celler udgør ~ 23% og ~ 9% af de totale PP-celler. DC'er delgrupper mærket CD11c + (figur 3D) og CD103 + (ikke vist) kan også tælles ved denne fremgangsmåde. CD11c + udviklingslandene bidrager til omkring 8% af den samlede gated befolkning, hvilket stort set svarer til 10.000 udviklingslandene pr PP. Dette stemmer nøjagtigt med antallet af DC'er observeret af andre 14.

    Blandt befolkningen i CD11c + +. Lignende resultater opnås, når PP-celler opsamles fra C57B / 6 mus (figur 3E).

    "Dårlig" cellepræparater kan føre til stærkt misvisende resultater, hovedsagelig fordi døde eller døende celler har tendens til at binde antistoffer non-specifikt. Som vist i figur 4, populationen af celler, der farves positive for både B-celle-markør (B220) og T-celle-markører (CD3, panel A, CD4, panel B) kan variere mere end 3 gange mellem en god og dårlig cellepræparat. Figur 4 viser en overrepræsentation af B220 + og CD3 + dobbelt-positive celler (felt A), såvel som B220 + B-celler og CD4 + T-celler dobbelt-positive celler (panel B) i fattige cellepræparater. Som nævnt ovenfor er forskellen i relative B-og T-celleantal i god versus dårlig skyldes sandsynligvis uspecifik binding af antistoffer døende celler.

    Vores protokol viser også, at mus PP kryosektioner kan underkastes histopatologisk analyse, samt immunolabeling. Figur 5 sammenligner H & E-farvning af muse-PP paraffin (paneler A, B) og frosne snit (panel C). Mens paraffinsnit giver mere opløsning på celleniveau, når farvet med H & E, de lyse og mørke zoner af PP kimcentre er lettere afgrænset i kryosektion sektioner (fig. 5A-C). H & E-farvede kryosektioner er nyttige til side-om-side sammenligning med immunolabeled kryosektioner. En typisk PP kryosektion farvet med anti-CD3-antistoffer til at mærke de T-celler, anti-CD11c antistoffer for at fremhæve DC'er og anti-B220-antistoffer for at fremhæve B-celler er vist i figur 6..

    Figur 1
    Figur 1. Muse Peyerske PATChes. Billede af en frisk udskåret mus tyndtarmen med tre synlige PPs (hvide pile). PPS vises som blister-lignende strukturer (5 x 5 mm) på anti-mesenterisk side af intestinal serosa.

    Figur 2
    Figur 2. Totale PP-celler blev analyseret ved flowcytometri. En monodisperse suspension af totale PP-celler blev underkastet strømningscytometri under anvendelse af en BD FACSCallibur. (A) Eksempel på en god cellepræparat. Langt størstedelen af ​​celler viser høje forward scatter (FSC), en indikator for høj cellevolumen, og lav sidespredning (SSC), en indikator for lav celle nøjagtighed. Disse celler er indrammet i R1. Celler med lav FSC og høj SSC, placeret uden for R1 gate, betragtes som døde eller døende celler. (B) Eksempel på en dårlig cellepræparat, hvor størstedelen af cellerne er uden for gatenR1 grund af lav FSC og høj SSC.

    Figur 3
    Figur 3. Repræsentative flowcytometrisk analyse PP lymfocytter. Monodisperse suspensioner af totale PP-celler inkuberet med fluorofor-konjugerede primære antistoffer og derefter underkastet strømningscytometri. (A) CD19 og B220 mærkning af PP B-celler. (BC) Dobbelt-mærkning af de samlede cellepopulationer med CD3 og CD4 (B) eller CD8 (C) at opregne bestemte T-celledelmængder. (D) Dobbelt-mærkning af de samlede cellepopulationer for B220 (B-cellemarkør) og CD11c (DC markør). (E) Sammenligning B220, CD3 , CD4 og CD11 c farvning på PP-celler fra BALB / c og C57B / 6 mus.

    Figur 4
    Figur 4. Vildledende flowcytometri data som følge af dårlige PP cellepræparater. God (venstre paneler) og ringe (højre paneler) PP cellepræparater blev farvet med (a) antistoffer mod B220 og CD3 at differentiere B-og T-cellepopulationer eller (B) antistoffer til B220-og CD4 at differentiere B celler fra et undersæt af T-celler. Der er generelt meget få celler af celler, der farves positive for B220 og CD3-eller CD4, som vist i de venstre paneler. I modsætning hertil dobbelt positive celler i fattige cellepræparater udgør næsten 20% af de totale celler. Se tekst for flere detaljer om, hvad der udgør en "dårlig" cellepræparat.

    Figur 5
    Figur 5. Repræsenterer H & E-farvede PP sektionerne. Paraffinindlejret sektioner (A, B) eller kryosektioner (C), i ileal PPs blev farvet med H & E og visualiseret ved lysmikroskopi. Bemærk, at de lyse og mørke områder af de lymfoide follikler let er afgrænset i kryosektioner, sammenlignet med paraffinsnit. Forkortelser: V, villøs, FAE, follikel-associerede epitel, SED, sub-epithelial dome, LF, lymfoid follicle.

    Figur 6
    Figur 6. Immunofluorescent mærkning af murine PP kryosektioner. Nyfældet vævssnit af en enkelt mus PP var lufttørret, acetone-fikserede og farvet med (A) FITC-konjugerede anti-CD3-antistoffer til at mærke de T-celler i de inter-follikulære regioner og lamina propria, (B) PE-konjugerede anti-CD11c-antistoffer for at fremhæve DC'er i SED og (C) APC-konjugeret anti-B220-antistoffer for at fremhæve B-celler (D) Et sammensat o.f billeder i paneler AC genereret ved hjælp af Fiji-software. Scale bar er ~ 100 um.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I denne artikel har vi givet parallelle protokoller til fremstilling PP encellede forberedelserne til flowcytometrisk og funktionel analyse og kryosektioner for immunfarvning. Begge metoder er meget reproducerbar og let tilgængelig, tilvejebragt et flow-cytometer og kryostat er tilgængelige. For første gang efterforskere skal det påpeges, at i forhold til milten, alt celleudbytter fra PPs er forholdsvis beskedne. Alligevel protokollen vi skitsere generelt udbytter mellem 0,8-1,2 x 10 6 totale PP celler fra en enkelt mus. Opskalering er mulig, selv om vi typisk ikke pool mere end 20-25 PPs, fordi der i vores erfaring, aggregering forekommer og celleudbytter (og levedygtighed) tilbagegang meget. På den anden side, kan vi ikke anbefale at bruge mindre end 15 PPs til denne protokol, som en kritisk masse er nødvendig for at føre cellerne gennem hele isolation procedure. Hvis maksimal cellelevedygtighed er en prioritet for downstream funktionelassays, anbefaler vi, at en lille prøve af isolerede celler udsættes for propidiumiodid farvning at give mulighed for mere præcis gating den levedygtige pulje af celler fra den samlede PP cellepopulation. Endelig skal det bemærkes, at vores metode er modtagelig for cellesortering applikationer, hvis en specifik celleundergruppe ønskes til adoptiv overførsel eller in vitro-analyse, f.eks.

    Indsamlingen af ​​PPs for cryosectioning er forholdsvis ligetil, selvom den faktiske inddeling af PP væv kan være udfordrende. Det er bydende nødvendigt, for eksempel, at PP væv er rigtigt orienteret i forme (dvs. vinkelret på bunden af ​​støbeformen) at sikre, at sande tværgående sektioner opnås. Vi foreslår snap-frysning PP væv og derefter udsætte de kryosektioner til udfældning fikseringsmidler såsom acetone eller methanol for at bevare antistofreaktivitet ("antigenicitet"), selv om udfældning fiksativer i et fald i den samlede cellulære og subcellulære resolution. Hvis bevare antigenicitet ikke er en særlig bekymring, så anbefaler vi brug af tværbinding fiksativer som paraformaldehyd (PFA), hvilket resulterer i en bedre bevarelse af cellulære og subcellulære strukturer. Faktisk kan PFA bruges til at fastsætte væv før cryosectioning. Simpelthen nedsænkes frisk udtaget PP med rigelige mængder af 4% PFA for> 2 timer, vaskes vævet med PBS for at fjerne overskydende fiksermiddel, ækvilibrere væv i saccharose (15%) om ønsket, og derefter integreres i OCT, som beskrevet ovenfor. Vævet kan derefter cryosectioned, men skal blokeres med glycin-opløsning (0,1 M i PBS i 15 min) for at kvæle tilbageværende reaktive PFA før immunfarvning.

    Endelig, mens vi har beskrevet protokoller for immunofluorescent mærkning af PP kryosektioner, de samme dele er modtagelige for immunhistokemi (IHC) anvendelse af kommercielt tilgængelige IHC kits (f.eks Vector Labs, Burlingame, CA). For IHC, er det nødvendigt, at en peroxidase blokering eller quenching trin i protokollen, som endogene peroxidaser er meget udbredt i tarmslimhinden. Andre har bemærket, at for IHC, hjerte-perfusion af musene med 4% paraformaldehyd i PBS forbedrer vævskonservering.

    Sammenfattende har vi givet parallelle og supplerende protokoller for kvantitativ og funktionel analyse af murine PP celler, herunder lymfocytter og DCS. Fremstillingen af enkelte cellesuspensioner muliggør kvantitativ og funktionelle in vitro-analyse af de større celletyper i PP, medens immunolabeling af kryosektioner tilvejebringer information om lokaliseringen af specifikke celletyper, og celle-celle-interaktioner, der findes på stedet. Den primære begrænsning af begge disse fremgangsmåder er, at hverken repræsenterer "real time" visualisering af PP celle-celle interaktioner. For det mindste i øjeblikket, har PPs vist uigennemtrængelig for intravital billeddannelse, en teknik, der har revolutioneret forståelsen af ​​lymfocyt dycs i perifere lymfeknuder. Indtil de tekniske barrierer begrænser intravital billeddannelse af PPs er overvundet, protokollerne der er skitseret i denne artikel for at forberede PP encellede forberedelserne til flowcytometrisk og funktionel analyse og PP kryosektioner for immunfarvning vil fortsat være det primære middel til at undersøge og forstå de immunologiske funktioner af specifikke sub -populationer af celler i KKS, de primære induktive lokaliteter af gut-associerede lymfoide væv.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklæret.

    Acknowledgements

    Vi takker Renjie Song (Wadsworth center Flowcytometri Core) for at få hjælp i celle analyse og Helen Johnson (Wadsworth center Animal Histopatologi Core) til fremstilling af paraffinsnit. Vi takker Dr. Richard A. Cole (Wadsworth center lysmikroskopi Core) for at få hjælp med konfokal mikroskopi og billedsamling. Vi vil gerne anerkende Andy Bentley (Wadsworth Center-billede og Illustration) for at få hjælp med animationer.

    MDJ er støttet af Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA er understøttet af en Wadsworth Center-Health Research Inc. murene postdoc-stipendium. Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud HD061916 og GM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics