Real-time analyser av Retinol Transport av membranen Receptor av Plasma Retinol Binding Protein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en optimalisert teknikk for å produsere høy kvalitet vitamin A / RBP kompleks og to sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere vitamin A transport av STRA6, den RBP reseptoren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vitamin A er essensielt for visjonen og vekst / differensiering av nesten alle menneskelige organer. Plasma retinol bindende protein (RBP) er prinsippet og bestemt transportør av vitamin A i blodet. Her beskriver vi en optimalisert teknikk for å produsere og rense holo-RBP og to sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere transport av vitamin A ved høy affinitet RBP reseptor STRA6. Den første teknikken gjør det mulig å produsere en stor mengde av høykvalitets holo-RBP (100%-lastet med retinol) for vitamin A transport-analyser. Høy kvalitet RBP er avgjørende for funksjonelle analyser fordi misfolded RBP utgivelser vitamin A lett og bakteriell forurensning i RBP forberedelse kan forårsake artefakter. Sanntidsovervåking teknikker som elektrofysiologi har gjort kritiske bidrag til studier av membran transport. Den RBP reseptor-mediert retinol transport har ikke blitt analysert i sanntid inntil nylig. Den andre teknikken beskrevet her er real-time analyse av STRA6-katalysert retinol utgivelse eller lasting. Den tredje teknikk er real-time analyse av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til mobilnettet retinol bindende protein I (CRBP-I). Disse teknikkene gir høy følsomhet og oppløsning i avslørende RBP reseptor er vitamin A opptak mekanisme.

Introduction

Vitamin A er en organisk molekyl som er avgjørende for menneskers overlevelse og riktig funksjon av nesten alle menneskelige organer. Vitamin A derivater (retinoider) deltar i ulike biokjemiske og cellulære hendelser inkludert sensing av lys for syn 1,2 og regulering av genuttrykk og protein oversettelse under embryonal utvikling og hos voksne vev 3-6. Selv retinol har evnen til å diffundere systemisk, kom evolusjon opp med plasma retinol bindende protein, en spesifikk bærerprotein for vitamin A transport i blodet for å oppnå høy effektivitet og spesifisitet og unngå toksisitet forbundet med tilfeldig diffusjon 7-10. En høy affinitet reseptor som binder seg til RBP og tar opp vitamin A ble antatt i 1970 11-13. Tross for bevis akkumulert i tre tiår på eksistensen av RBP reseptor 14-31, ble reseptoren hypotesen debattert i mange år på grunn av den existence av feil definisjon av holo-RBP. Den korrekte definisjonen av holo-RBP er at det er den høye affinitet 01:01 kompleks mellom retinol og RBP. Gjentatt ekstraksjon av holo-RBP av organisk oppløsningsmiddel er nødvendig for å produsere apo-RBP. Denne definisjonen brukes av nesten alle laboratorier studerer RBP 7,9,32-35 eller RBP reseptoren 14-31,36-42. Den ukorrekte definisjonen av holo-RBP som ble brukt til å avkrefte eksistensen av RBP reseptoren er den akutte blanding av fri retinol med apo-RBP. Siden funksjonen til RBP reseptor i vitamin A opptak fra holo-RBP er å frigjøre retinol fra holo-RBP, ville RBP reseptoren spiller ingen rolle i retinol opptak hvis retinol er fritt til å begynne med (som foreslått av feil definisjonen av holo -RBP).

Den nylige identifikasjonen av RBP reseptor som multitransmembrane domene protein kalt STRA636 og dens funksjon i vitamin A opptak fra Holo-RBP 36-43 sterkt argumenterer mot hypotesen om at RBP ikketrenger en reseptor for å levere vitamin A. Detaljerte analyser avslørte at STRA6 har 9 transmembrane domener med N-terminus plassert ekstracellulært og C-terminus lokalisert intracellulært 40. Ligger mellom transmembran 6 og 7 er en essensiell RBP bindende domene 39. STRA6 er koblet til både LRAT og CRBP-I i vitamin A opptak fra Holo-RBP, men verken LRAT eller CRBP-I er absolutt nødvendig for bedre STRA6 aktivitet 41. STRA6 evne til å katalysere retinol utgivelse fra holo-RBP er nøkkelen til sitt vitamin A opptak aktivitet 41. Ved å stole på STRA6 å slippe sin retinol, vitamin A levering av RBP transportere vitamin A til målceller i perifere vev med høy spesifisitet og effektivitet.

Den kritiske viktigheten av holo-RBP definisjon og forberedelse er illustrert ikke bare av historisk debatt om eksistensen av RBP reseptoren, men også av tre beslektede siste papirene basert på holo-RBP definisjoner difskjellige fra den opprinnelige og riktige definisjonen 44-46. Den første papiret brukte holo-RBP definisjon som ble brukt til å godkjenne eksistensen av RBP reseptoren å studere RBP reseptoren 44. Den andre og tredje papirer kom opp med en tredje definisjon av holo-RBP som gjorde det enda mindre sannsynlig for retinol å bli undersøkt for å danne en skikkelig kompleks med RBP 45,46. Disse studiene fremstilles 3 H-retinol/RBP ved blanding holo-RBP (ikke engang apo-RBP) med 3 H-retinol. Siden denne analysen ikke har 3 H-retinol/RBP dannet og ikke fjerne overdreven frie 3 H-retinol 45,46, er det ikke en assay for 3H-retinol opptak fra 3 H-retinol/RBP, men er en fri 3 H-retinol diffusjon analysen. Det har blitt vist tidligere at STRA6 ikke forbedre cellulært opptak av fritt retinol etter LRAT 38 eller CRBP-I 41. Nesten all retinol er bundet til RBP i blodet, og det er ingen påviselig free retinol. En hovedfunksjon RBP reseptoren er å katalysere retinol utgivelse fra Holo-RBP under retinol opptak fra Holo-RBP 41. Dersom retinol er kunstig frigis eller er i fri form til å begynne med 45,46, er RBP reseptoren ikke nødvendig. De dramatisk forskjellige resultater innhentet fra gratis retinol diffusjon analysen i forhold til analyser basert på riktig forberedt holo-RBP illustrere at riktig tilberedning av RBP er avgjørende for sine funksjonelle analyser.

RBP kan bli renset fra humant serum 41, men prosedyren er kompleks og utbyttet er lavt. En alternativ tilnærming er å produsere RBP i E. coli. Fordi E. coli har ikke evnen til å fullstendig folde pattedyr utskilte proteiner med mer enn ett par av disulfidbindinger som RBP, er det viktig å refold RBP og rense fullstendig foldet protein. Misfolded proteiner ikke bare oppfører seg annerledes enn korrigert brettet RBP i ulike analyser,men også forårsake proteinaggregering under lagring. Av samme grunn er apo-RBP bare produsert av høy kvalitet holo-RBP. Vi beskriver her en optimalisert protokoll for å produsere høy kvalitet RBP 100% lastet med retinol gjennom bakteriell uttrykk, refolding, og HPLC rensing. HPLC-rensing ikke bare fjerner feil foldet RBP men også betydelig bakteriell forurensning som kan forårsake alvorlige gjenstander hvis RBP brukes i signaltransduksjon analyser. Vi beskriver også to sensitive sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere retinol transport av STRA6. Begge teknikkene avhenge av høy kvalitet RBP. På grunn av plassbegrensninger, de klassiske teknikker for radioaktivt retinoid-baserte og HPLC-baserte vitamin A opptak analysene ikke er beskrevet her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produksjon, refolding, og HPLC rensing av Holo-RBP

  1. Transform BL-21cells med pET3a vektor harboring cDNA for menneskelig RBP med 6x Hans koden på N-terminus. Dyrke transformerte BL-21 celler i en risteapparat ved 37 ° C i 40 ml LB-medium med Carbenicillin inntil OD ved 600 nm når 0,5. Indusere RBP protein uttrykk ved å legge IPTG til 1mm. Dyrke bakterier ved 37 ° C ytterligere 5 hr.
  2. RBP produsert i E.coli er mest til stede i uløselige inkludering organer. Å berike inkludering organer, pellet celler på 10.000 xg i 20 min. Deretter sonicate cellene på is i 5 ml PBS med proteasehemmere, etterfulgt av to sykluser med frysing og tining. Pellet ned inklusjonslegemer ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatant og holde pelleten på isen.
  3. Oppløse inklusjonslegeme pelleten ved sonikering i 10 ml 7,5 M guanidin-hydroklorid. Legg til en halvt volum (5 ml) av 25 mM Tris-buffer, pH 9,0 og DTT til en endelig concentration på 10 mm. Kraftig bland løsning på en virvelblander natten ved romtemperatur for å redusere og fullt denaturere proteiner.
  4. Sentrifuger proteinoppløsningen for å fjerne uløselig materiale ved 18.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Etter sentrifugering, overføre supernatanten til et nytt rør og plassere røret på is.
  5. Forbered fire volumer (60 ml) av refolding buffer (25 mM Tris, 9,0 pH, 0,3 mM cystin, 3,0 mM cystein, 1 mM EDTA). Degas den refolding buffer. Også forberede 600 pl 10 mM retinol i etanol under svakt rødt lys. Oppbevar den i mørket på isen. Både refolding buffer og retinol løsning må være nylaget.
  6. Avkjøl både proteinløsningen og refolding buffer på is i minst 30 min. Høyere temperatur reduserer trolig kvaliteten på refolded RBP. Tilsett 1 ml refolding buffer dråpevis og 10 ul retinol løsning i sin tur mens protein løsning kraftig blandet i et beger på is. Gjenta dette trinnet til alle refolding buffer og retinoler lagt til. Rør reaksjonsblandingen på is i mørket i 5 timer.
  7. Spinn ned refolding reaksjonen ved 24.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Det er viktig å fjerne aggregatene rett etter refolding reaksjon.
  8. Konsentrer den overliggende oppløsning bruker Amicon Ultra 15 konsentrator (MWCO 10 K) til ca 10 ml. Ikke konsentrere refolded løsningen mer enn dette nivået. Konsentrerer seg for mye vil føre til protein aggregering og senker den endelige avling og kvalitet av riktig brettet RBP. Fortynn den konsentrerte prøven med kaldt PBS til 100 ml. Formålet med dette trinnet er å fjerne komponentene i refolding reaksjonen som forstyrrer nikkel rensing.
  9. Spinn løsningen en gang ved 24.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Det er viktig å fjerne bunnfall. Overfør supernatanten til to 50 ml rør som hver inneholder 1 ml Ni-NTA slurry som er blitt vasket med PBS. Roter rørene ved 4 ° C i én time. Ruger fortynnet løsning feller 1 hr kan forårsake utfelling av misfolded proteiner som må fjernes.
  10. Spinn ned rør ved 500 xg i 3 min. Fjern supernatanten forsiktig. Noe flytende bør fjernes. Legg kaldt PBS til 30 ml for hvert rør. Spinne igjen og fjern supernatanten. Gjenta denne prosessen til du ser ingenting, men perler i røret.
  11. Overfør Ni-NTA harpiks til en tom kolonne. Vask harpiksen med 20 kolonnevolumer av 10 mM imidazol, 500 mM NaCl i PBS. Eluere His-RBP i 5 kolonnevolumer av 100 mM imidazol i PBS. Ikke oppbevar dette for en lengre periode, og frysing reduserer endelige utbytte og kvalitet. For best resultat, rense RBP ved HPLC umiddelbart.
  12. Dialyser Hans-RBP renset fra Ni-NTA harpiks mot 25 mM Tris, 8,4 pH, og 120 mM NaCl. En konsentrator kan også brukes for buffer utveksling. Klare prøver for HPLC ved sentrifugering ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C rett før hver kjøring.
  13. Rens holo-RBP på HPLC med en ionutveksling kolonne AX-300 ved en NaCl trinngradient (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, og 1,000 mM 15 min) ved hjelp av 25 mM Tris, 8,4 pH som mobil fase ved 1 ml / min. Som NaCl konsentrasjon stiger, er holo-His-RBP utgitt mens apo-RBP og misfolded RBP bo bundet til kolonnen (figur 1). Hvis RBP refolding ikke gjøres optimalt, misfolded RBP (f.eks misfolded RBP-I i figur 1) kan dominerer hele preparatet.
  14. Gjenopprette riktig brettet holo-RBP fra toppen fraksjonene på 360 mM NaCl. Nøye overvåke elueringsprofilen riktig brettet og misfolded Hans-RBP. På 1000 mM NaCl, misfolded fleste av His-RBP bli løslatt.
  15. Fraksjoner inneholdende holo-RBP blir oppsamlet, konsentrert og dialysert mot PBS over natten ved 4 ° C. Sjekk den endelige avling og kvalitet (330 nm/280 nm) ved spektrofotometer. Fullstendig foldet produkt bør ha en 330 nm/280 nm forholdet noe høyere enn 1 (figur 1).
  16. Til produksjone apo-RBP, tilsett samme volum av heptan til det rensede holo-RBP og bland forsiktig ved å rotere over natten ved 4 ° C. Sentrifuger ved 16.000 g i 10 minutter ved 4 ° C og forsiktig overføre nederste vandige fase til et nytt rør (unngå utfellingen på grensesnittet). Gjenta prosessen tre ganger med en 3 timers inkubasjon for hver. Sjekk absorpsjon på en NanoDrop spektrofotometer å sørge for at 330 nm peak har sunket til bakgrunnsnivået.

2. Real-time overvåkning av STRA6-katalysert Retinol År og Retinol Laster

  1. Blokkere en svart 96-brønns Microfluor-2 plate (Thermo Scientific) med 200 pl Blocker kasein (Pierce) over natten ved 4 ° C for å unngå ikke-spesifikk klebing av holo-RBP til plast. Blocker Kasein gir best blokkerer effekten av alle de blokkerer løsninger vi har testet.
  2. Membraner tilberedes fra celler som uttrykker STRA6 eller kontrollceller er vasket med PBS og passert gjennom en Hamilton sprøyte (GastiGHT # 1710) 6 ganger for å produsere en enhetlig suspensjon i PBS. Vi bruker vanligvis membraner avledet fra 1/100 til 1/20 av celler dyrket på en 100 mm parabolen per reaksjon.
  3. Vask de belagte brønnene i Microfluor-2 plate en gang med 200 pl PBS. Avkjøl platen på isen før tilsetning av membransuspensjon (50 pl per brønn).
  4. Sanntids overvåkning av retinol fluorescensen måles med fluorescens optikk POLARstar Omega (BMG Labtech) med eksitasjon filteret 320ex og utslipp filteret 460-10. Programmet er satt til Endpoint lesemodus. The Plate modus kan også brukes til å måle en tid selvfølgelig hvis tidsintervallene ikke variert. Signalet fra hvert tidspunkt er gjennomsnittet av 10 målinger (orbital gjennomsnitt med en diameter på 2 mm), og gevinsten er satt til 1800. Platen er ristet i 10 sekunder på 500 rpm med dobbel-orbital risting før hver måling.
  5. Å starte retinol release-analysen, er brønnene lest en gang ved hjelp av Endpoint lesing mode før holo-RBP (typisk 1 pM sluttkonsentrasjon) blir tilsatt ved 0 min. Så snart holo-RBP tilsettes, blir reaksjonen overvåkes kontinuerlig hver 5-10 min for 1-3 hr. Å starte retinol lasting analysen, all-trans retinol (typisk 1 pM sluttkonsentrasjon) tilsettes til brønnene i henhold svakt rødt lys. Platen blir lest én gang før apo-RBP er lagt på 0 min. Så snart apo-RBP tilsettes, blir reaksjonen overvåkes kontinuerlig hver 5-10 min for 1-3 hr.
  6. Etter at alle målingene er gjort, laste ned rådata (f.eks vist i figur 2) fra Omega Dataanalyse programvare (BMG Labtech) til Microsoft Excel for dataanalyse. Hvert tidspunkt genererer en fil som inneholder målinger av alle eksperimentelle betingelser. For eksempel, hvis det er 20 tidspunkter, konsolidere 20 filer i et Excel-fil for dataanalyse.
  7. For dataanalyse, blir fluorescens signalene før tilsetning av retinol eller holo-RBP på 0 min betraktes bakgrunnssignaler end trekkes fra den endelige fluorescens signaler ved alle tidspunkter. Selv om bakgrunnssignaler er lave sammenlignet med retinol fluorescens i holo-RBP, subtrahere bakgrunnen eliminerer uspesifikke innflytelse lysspredning ved membranene og gjør det mulig å fokusere på retinol fluorescensen av holo-RBP eller retinol tilsatt ved 0 min.

3. Real-time overvåkning av STRA6-katalysert Transport av Retinol Fra Holo-RBP til CRBP-I

  1. Retinol-EGFP er en ny fluorescens resonans transfer (FRET) par som nylig har blitt etablert 41. STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til EGFP-CRBP-I overvåkes i sanntid ved å måle retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I fusjonsprotein med 6XHis tag (EGFP-CRBP-I) er produsert i pattedyrceller, og renses på Ni-NTA harpiks før eksperimentet. EGFP-CRBP-jeg kan lagres i PBS med proteasehemmere for en kort periode av tid ved 4 ° C. Alternativt fusjonsproteinet jegs frosset i -80 ° C i små aliquoter.
  2. Før reaksjonene, forberede en blokkert Microfluor-2 plate og membraner som beskrevet ovenfor. Vask de belagte brønnene i Microfluor-2 plate en gang med 200 ul PBS før tilsetning av membransuspensjon (50 pl per brønn).
  3. Real-time retinol-EGFP FRET måles ved hjelp POLARstar Omega med eksitasjon filter 320ex og utslipp filtre 460-10 og 510-10 bruker samtidige duell utslipp fluorescens optikk. Programmet er satt til Endpoint lesemodus. The Plate modus kan også brukes til å måle en tid selvfølgelig hvis tidsintervallene ikke variert. Signalet fra hvert tidspunkt er gjennomsnittet av 10 målinger (orbital gjennomsnitt med en diameter på 2 mm), og gevinsten er satt til 1800 per kanal. Platen er ristet i 10 sekunder på 500 rpm med dobbel-orbital risting før hver måling.
  4. Å starte reaksjonene, EGFP-CRBP-I (typisk 1 pM sluttkonsentrasjon) tilsettes til brønnene. Platen avleses påce med Endpoint lesemodus før holo-RBP er lagt på 0 min. Så snart holo-RBP tilsettes, blir reaksjonen overvåkes kontinuerlig ved måling hver 5-10 min for 1-2 hr.
  5. Etter at alle målingene er gjort, laste ned rådata (f.eks vist i figur 3) fra Omega Dataanalyse programvare til Microsoft Excel for dataanalyse som beskrevet ovenfor.
  6. Retinol-EGFP FRET beregnes av dynamisk endring i forholdet mellom akseptor / donor utslipp topper 47. Ligningen 41 å beregne dette forholdet er [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], der 510 t, 510 b, 460 t, og 460 b representerer utslippene på 510 nm etter initiering av reaksjonen ( t = tid punkt), er ved 510 nm før retinol eller holo-RBP tilsatt (b = bakgrunn), ved 460 nm etter initiering av reaksjonen (t = tidspunkt), og ved 460 nm før retinol eller holo-RBP tilsettes (b = bakgrunn), henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi presenterer her representative resultater for Holo-RBP produksjon og rensing av HPLC (figur 1), real-time analyse av STRA6-katalysert retinol utgivelse fra Holo-RBP og retinol lasting i apo-RBP (figur 2) og real-time analyse av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til EGFP-CRBP-I (figur 3).

Uten refolding, produsert RBP i bakterier er nesten helt misfolded grunnet tilstedeværelsen av mange uriktige disulfidbindinger. Derfor, refolding i nærvær av liganden retinol er kritisk viktig i å skaffe godt foldet RBP. Vi fant ut at hvis refolding reaksjonen ikke blir gjort riktig, misfolded RBP arter (f.eks misfolded RBP-I i figur 1) kan dominere hele forberedelse og utbyttet av høy kvalitet holo-RBP kan være svært lav etter HPLC rensing. Derfor kan HPLC ikke løse problemet med dårlig refolding. Som vist i (figur 1). Selv delvis misfolded RBP fortsatt binder retinol, er retinol / RBP kompleks mye mindre stabil, og RBP lettere slipper bundet retinol. Misfolded RBP kan føre til uriktige konklusjoner fra RBP eller vitamin A-relaterte eksperimenter. En annen forskjell mellom fullstendig foldet RBP og misfolded RBP er at fullstendig foldet holo-RBP er stabil i år ved 4 ° C i PBS. Dersomholo-RBP forberedelse har misfolded RBP forurensning, vil uløselige materialer oppstå etter en tids lagring. Uløselige materialer kan observeres etter spinning ned løsningen ved høy hastighet ved 4 ° C. Apo-RBP er kun produsert av høy kvalitet holo-RBP.

Gang renset høykvalitets holo-RBP eller apo-RBP er tilgjengelig, kan det brukes til å studere STRA6-katalysert retinol transport. Både sanntid retinol release-analysen og retinol lasting analysen avhenger overvåking retinol fluorescens. En kilde av kunstig nedgang av retinol fluorescens er uspesifikk binding av RBP til plast parabolen (gang RBP er bundet til plastvegg, kan det ikke lenger måles i løsning). Vi har testet mange blokkerer forhold og funnet ut at Blocker Kasein (Pierce) er mest effektiv i å redusere denne uspesifikke og reseptor-uavhengig nedgang på retinol fluorescens. En annen kilde til kunstig nedgang av retinol fluorescens er dårlig kvalitet av RBP, som drøftetovenfor.

STRA6-katalysert retinol utgivelse, retinol lasting og retinol transport er relativt langsomme begivenheter, som vist i de representative data i figurene 2 og 3. Reaksjonene er relativt treg fordi hver RBP bare binder ett molekyl av vitamin A og alle STRA6-katalysert reaksjoner avhenger både RBP binding og RBP dissosiasjon å fortsette. For STRA6-katalysert retinol frigivelsesreaksjoner å fortsette, kan holo-RBP bare binde etter apo-RBP dissosierer. For STRA6-katalysert retinol lasting reaksjon å fortsette, kan apo-RBP bare binde etter Holo-RBP dissosierer. For alle de sanntidsovervåkingssystemer teknikker beskrevet her, fant vi ut at den ideelle frekvensen av måling er en måling hver 5 min eller 10 min. Selv hyppigere målinger kan skape høyere tidsoppløsning, vil de resulterende datafiler være ekstremt store fordi hvert tidspunkt skaper en Excel-fil.

Figur 1 telt-width = "5.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
Figur 1. Rensing av refolded RBP på HPLC for å få holo-RBP 100% lastet med retinol. Nikkel harpiks-renset refolded RBP påføres ionebytterkolonne AX-300 ved en NaCl trinngradient (220 mM 10 min, 360 mM 15 min, og 1,000 mM 15 min). Den riktig brettet holo-His-RBP frigjøres og elueres ved 360 nM NaCl. Absorpsjonsspektra (250 nm-400 nm) av toppene tilsvarende fullstendig foldet holo-RBP, misfolded RBP-1, misfolded RBP-2, og forurensning er også vist (protein peak angis av en blå vertikal linje og retinol peak indikeres av røde vertikale linjen). Klikk her for å se større figur .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Figur 2. Real-time overvåkning av STRA6-katalysert retinol lasting i apo-RBP og retinol utgivelse fra Holo-RBP. Denne analysen spilt en viktig rolle i å avsløre hva STRA6 kan gjøre av seg selv uten LRAT eller CRBP-IA Et eksempel på rå datafil for STRA6-catalzyed retinol lasting og retinol utgivelse som vist på Omega Dataanalyse programvare. Å starte retinol frigivelsesreaksjoner er holo-RBP lagt til STRA6 membran eller kontroll membran på 0 min. Å starte retinol lasting reaksjon, er retinol lagt til STRA6 membran eller kontroll membran ferdigblandet med apo-RBP ved 0 min. Fluorescens målinger for 320 nm eksitasjon og 460 nm emisjon avslørte tidsforløpet av reaksjonene. Reaksjoner 1-6 monitor retinol loading inn apo-RBP (1, 3, og 5 er STRA6 reaksjon, 2, 4, og 6 er-reaksjonene). Reaksjoner 7-12 monitor retinol loading inn apo-RBP (7, 9, og 11 er STRA6 reaksjon, 8, 10, og 12 er-reaksjonene). B. De endelige beregnede signaler for reaksjoner som er vist i A. Den venstre graf ble beregnet basert på reaksjoner 1-6. Høyre grafen ble beregnet basert på reaksjoner 7-12. Høyest fluorescens signalet er definert som 1 i den venstre grafen. Fluorescens av holo-RBP lagt ved 0 min er definert som en i riktig grafen. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Real-time overvåkning av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til CRBP-IA Et eksempel på rå datafil som overvåker FRET mellom retinol og EGFP som vist på Omega Dataanalyse programvare. Ved 0 min, er holo-RBP tilsatt til reaksjonene inneholdende STRA6 membran (reaksjoner 1, 3 og 5) eller kontroll membran med EGFP-CRBP-Jeg å initiere reaksjonene (reaksjonene 2, 4 og 6). Samtidige duell utslippsmålinger for eksitasjon ved 320 nm avslørte grønne kurven som 460-10 utsendelsen kurs og blå strek som 510-10 utsendelsen kurset. B. Den endelige beregnet FRET signaler for reaksjoner vist i A. fret signalene ble beregnet i henhold til metodene i trinn 3.6. Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi deler her en optimalisert RBP produksjon protokoll fordi RBP produksjon og rensing prosedyrer er avgjørende for å generere riktig brettet RBP. Gitt muligheten for misfolded RBP arter og tilstedeværelsen av spormengder av bakterielle proteiner selv i HPLC renset bakterier produserte RBP, er det nyttig å bruke innfødt RBP fra serum å bekrefte en konklusjon relatert til RBP. Urin RBP, som er kommersielt tilgjengelig, er en kompleks blanding av mange arter av RBP inkludert apo-RBP og holo-RBP 48,49.

De sanntidsovervåkingssystemer teknikker beskrevet her er basert på den iboende fluorescens av retinol. Den opprinnelige drivkraften for å utvikle disse analysene var at vi var begrenset av den informasjonen som kan bli avslørt av de klassiske radioaktive analyser og HPLC-baserte analyser. For eksempel fant vi at STRA6 har lite vitamin A opptak aktivitet av seg selv på vitamin A opptak analyser, men vi kan ikke lett å forklare den lave aktiviteten STRA6 på vitamin A opptak uten LRAT eller CRBP-I 41. I retinylpalmitat ester-baserte analyser, er det lett å forstå at STRA6 av seg selv ikke gjør retinylpalmitat ester fordi STRA6 er ikke et enzym som har LRAT aktivitet. Men selv i retinol-baserte analyser, har STRA6 fortsatt lite aktivitet i seg selv. Har STRA6 noen vitamin A opptak aktivitet i det hele tatt? Hvis den ikke gjør det, hvordan kan CRBP-I eller LRAT akselerere sin aktivitet? Hvis den gjør det, hvorfor det trenger CRBP-I eller LRAT? Selv radioaktive analyser og HPLC-baserte analyser ikke svare på disse spørsmålene, begrunnet vi at STRA6 bør ha evnen til å løslate retinol fra RBP. Vi har også begrunnet at en retinol fluorescens analysen kan avsløre denne aktiviteten. Retinol fluorescens måling har gjort det mulig å studere bevegelsen av fri retinol i hvirveldyr fotoreseptorcellene etter lett bleking av visuelle pigmenter i sanntid 50,51. Hvordan kan RBP reseptor aktivitet overvåkes ved å måle retinol fluorescens? Den ble oppdaget itidlig på 1970-tallet med to forskningsgrupper som retinol har dramatisk forbedret fluorescens når bundet til RBP 52,53. Vi fant ut at STRA6-katalysert retinol utgivelse fra Holo-RBP fører til en reduksjon i retinol fluorescens, mens STRA6-katalysert retinol lasting i apo-RBP fører til en økning i retinol fluorescens. Selv radioaktive analyser og HPLC-baserte assays har blitt brukt i stor utstrekning for å studere vitamin A opptak hadde fluorescens analysene ikke blitt brukt til å studere RBP reseptoraktivitet inntil nylig, sannsynligvis fordi de endogene membraner som brukes som kilde for reseptoren har svært høy bakgrunnsfluorescens og har en kompleks blanding av retinoid proteiner / enzymer som gjør det vanskelig å tolke bidraget av hvert protein. De tilgjengelige følsomme instrumenter er også det som gjør disse teknikkene mer gjennomførbart. I tillegg til direkte fluorescens måling, den nye retinol-EGFP FRET paret 41 kombinert med samtidige duell utslipp optikkgjør det mulig å studere retinol transport til retinol bindende proteiner i sanntid og i flere reaksjoner samtidig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Støttet av National Institutes of Health tilskudd R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300, (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305, (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics