Realtid Analyser av Retinol Transport från membranreceptor av plasma Retinol Binding Protein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi en optimerad teknik för att producera högkvalitativa vitamin A / RBP komplex och två realtid tekniker övervakning att studera vitamin A transport med STRA6, RBP-receptorn.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vitamin A är viktigt för vision och tillväxt / differentiering av nästan alla mänskliga organ. Plasma retinol-bindande protein (RBP) är principen och specifika bärare av vitamin A i blodet. Här beskriver vi en optimerad teknik för att producera och rena holo-RBP och två realtid tekniker övervakning för att studera transport av vitamin A som med hög affinitet RBP receptorn STRA6. Den första tekniken gör det möjligt att framställa en stor mängd av hög kvalitet holo-RBP (100% laddad med retinol) för vitamin A transport-analyser. Hög kvalitet RBP är viktigt för funktionella analyser eftersom felveckade RBP släpper vitamin A lätt och bakteriell förorening RBP förberedelse kan orsaka artefakter. Realtidsövervakning tekniker som elektrofysiologi har gjort avgörande bidrag till studier av membrantransport. RBP-receptormedierad retinol transporter har inte analyserats i realtid tills nyligen. Den andra tekniken som beskrivs här är reaL-time analys av STRA6-katalyserad retinol version eller lastning. Den tredje tekniken är realtidsanalys av STRA6-katalyserad retinol transport från holo-RBP till cellulär retinol bindande protein I (CRBP-I). Dessa tekniker ger hög känslighet och upplösning i avslöjande RBP receptorns vitamin A upptag mekanism.

Introduction

Vitamin A är en organisk molekyl som är nödvändigt för människors överlevnad och en väl fungerande nästan alla mänskliga organ. Vitamin A-derivat (retinoider) delta i olika biokemiska och cellulära händelser inklusive avkänning av ljus för vision 1,2 och reglering av genuttryck och protein översättning under embryonal utveckling och hos vuxna vävnader 3-6. Även retinol har förmågan att diffundera systemiskt, kom evolution upp med plasma retinol-bindande protein, ett specifikt bärarprotein för vitamin A transport i blodet för att uppnå hög effektivitet och specificitet och för att undvika toxicitet associerad med slumpmässig spridning 7-10. En receptor med hög affinitet som binder till RBP och tar upp vitamin A hypotes i 1970 11-13. Trots bevis samlats i tre decennier på förekomsten av RBP-receptorn 14-31, var receptorn hypotesen debatterats i många år på grund av existence av en felaktig definition av holo-RBP. Den korrekta definitionen av holo-RBP är att det är hög affinitet 1:1 komplex mellan retinol och RBP. Upprepad extraktion av holo-RBP av organiskt lösningsmedel är nödvändig för att producera Apo-RBP. Denna definition används av nästan alla laboratorier studerar RBP 7,9,32-35 eller RBP-receptorn 14-31,36-42. Den felaktiga definitionen av holo-RBP som användes för att motbevisa existensen av RBP-receptorn är den akuta blandningen av fri retinol med apo-RBP. Eftersom funktionen hos RBP-receptorn på vitamin A upptag från holo-RBP är att frigöra retinol från holo-RBP skulle RBP-receptorn spelar någon roll i retinol upptag om retinol är fri att börja med (som föreslås i felaktig definition av holo -RBP).

Den senaste identifieringen av RBP-receptorn som multitransmembrane domän protein som kallas STRA636 och dess funktion på vitamin A upptag från holo-RBP 36-43 starkt argumenterar mot hypotesen att RBP intebehöver en receptor för att leverera vitamin A. Detaljerade analyser avslöjade att STRA6 har 9 transmembrandomäner med N-terminalen belägna extracellulärt och C-terminala belägna intracellulärt 40. Ligger mellan transmembran 6 och 7 är en väsentlig RBP bindande domän 39. STRA6 är kopplad till både LRAT och CRBP-I i vitamin A upptag från holo-RBP, men varken LRAT eller CRBP-I är absolut nödvändig för ökad STRA6 aktivitet 41. STRA6 förmåga att katalysera retinol frisättning från holo-RBP är nyckeln till dess vitamin upptag aktivitet 41. Genom att förlita sig på STRA6 att släppa sin retinol kan vitamin A leverans av RBP transportera vitamin A till målceller i perifera vävnader med hög specificitet och effektivitet.

Den avgörande betydelsen av holo-RBP definition och förberedelser illustreras inte bara av historiska debatten om förekomsten av RBP-receptorn, men också av tre relaterade senaste artiklar baserade på holo-RBP definitioner DIFkanal än den ursprungliga och korrekt definition 44-46. Den första papper som används holo-RBP definition som användes för att underkänna förekomsten av RBP-receptorn för att studera RBP-receptorn 44. Den andra och tredje papper kom med tredjedel definition av holo-RBP som gjorde det ännu mindre troligt att retinol studeras för att bilda en riktig komplex med RBP 45,46. Dessa studier framställdes 3 H-retinol/RBP genom blandning holo-RBP (inte ens apo-RBP) med 3 H-retinol. Eftersom denna analys inte hade 3 H-retinol/RBP bildades och tog inte bort överdriven gratis 3 H-retinol 45,46, är det inte en analys för 3 H-retinol upptag från 3 H-retinol/RBP, men är en fri 3 H-retinol diffusionsanalys. Det har tidigare visats att STRA6 inte ökar cellulärt upptag av fri retinol från LRAT 38 eller CRBP-I 41. Praktiskt taget alla retinol är bunden till RBP i blodet och det finns ingen detekterbar frekvense retinol. En viktig funktion hos RBP-receptorn är att katalysera retinol befrielse från holo-RBP under retinol upptag från holo-RBP 41. Om retinol artificiellt frigörs eller är i fri form till att börja med 45,46, är RBP receptorn inte behövs. De dramatiskt olika resultat från den fria retinol diffusionsanalys jämfört med analyser baserade på korrekt beredd holo-RBP visar att korrekt beredning av RBP är avgörande för dess funktionella analyser.

RBP kan renas från humant serum 41, men proceduren är komplicerad och utbytet är lågt. Ett alternativt tillvägagångssätt är att producera RBP i E. coli. Eftersom E. E. coli har inte förmågan att korrekt vika däggdjur utsöndrade proteiner med mer än ett par av disulfidbindningar som RBP, är det viktigt att återveckning RBP och rena korrekt vikta proteinet. Felveckade proteiner inte bara beter sig annorlunda från korrigerade vikt RBP i olika analyser,utan också orsaka proteinaggregering under lagring. Av samma anledning är apo-RBP endast tillverkas av högkvalitativt holo-RBP. Vi beskriver här en optimerad protokoll för att producera högkvalitativa RBP 100% laddad med retinol genom bakteriell uttryck, återveckning och HPLC-rening. HPLC-rening inte bara tar bort fel vikta RBP utan också betydande bakteriell kontamination som kan orsaka allvarliga artefakter om RBP används i analyser signaltransduktion. Vi beskriver också två känsliga realtidsövervakning tekniker för att studera retinol transporter med STRA6. Båda teknikerna är beroende av hög kvalitet RBP. På grund av platsbrist, A upptag analyser de klassiska teknikerna för radioaktivt retinoid-baserade och HPLC-baserade vitamin inte beskrivs här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion, Återveckning och HPLC-rening av Holo-RBP

  1. Transform BL-21cells med pET3a vektorn härbärgerar den cDNA för humant RBP med 6x His-markör på N-terminalen. Odla transformerade BL-21-celler i en skakapparat vid 37 ° C i 40 medium ml LB med karbenicillin tills OD vid 600 nm når 0,5. Inducerar RBP proteinuttryck genom att lägga IPTG till 1 mM. Odla bakterierna vid 37 ° C ytterligare 5 timmar.
  2. RBP producerat i E. coli finns mestadels närvarande i olösliga inklusionskroppar. Att berika inklusionskroppar, Pelletera celler vid 10.000 x g under 20 minuter. Sedan sonikera cellerna på is i 5 ml PBS med proteashämmare, följt av 2 cykler av frysning och upptining. Pellets ner inklusionskroppar vid 20.000 xg i 30 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och hålla pelleten på is.
  3. Solubilisera pelleten inklusionskropp genom sonikering i 10 ml 7,5 M guanidinhydroklorid. Lägg en halv volym (5 ml) av 25 mM Tris-buffert, pH 9,0 och DTT till en slutlig Concentration av 10 mM. Kraftigt blanda lösningen på en virvelblandare natten vid rumstemperatur för att fullständigt reducera och denaturera proteiner.
  4. Centrifugera proteinlösningen att avlägsna olösligt material vid 18.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Efter spin, överföra supernatanten till ett nytt rör och placera röret på is.
  5. Bered fyra volymer (60 ml) för återveckning buffert (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystin, 3,0 mM cystein, 1 mM EDTA). Avgasa tillbakaveckande bufferten. Också förbereda 600 ul 10 mM retinol i etanol vid dåliga rött ljus. Håll det i mörkret på is. Både återveckning buffert och retinol lösning måste vara nyberedd.
  6. Kyl både proteinlösningen och den tillbakaveckande bufferten på is under åtminstone 30 minuter. Högre temperatur minskar sannolikt kvalitet återveckad RBP. Tillsätt 1 ml droppvis återveckning buffert och 10 pl retinol lösning i tur medan proteinlösningen blandas kraftigt i en bägare på is. Upprepa detta steg tills alla återveckning buffert och retinoltillsätts. Håll omrörning av reaktionen på is i mörker under 5 timmar.
  7. Centrifugera ner den tillbakaveckande reaktionen vid 24.000 xg i 30 minuter vid 4 ° C. Det är viktigt att avlägsna aggregaten direkt efter återveckning reaktionen.
  8. Koncentrera den överstående lösningen med användning av Amicon Ultra 15 koncentrator (MWCO 10 K) till omkring 10 ml. Koncentrera dig inte återveckade lösningen mer än denna nivå. Koncentrera för mycket kommer att leda till proteinaggregering och sänker den slutliga avkastning och kvalitet av korrekt vikt RBP. Späd det koncentrerade provet med kall PBS till 100 ml. Syftet med detta steg är att avlägsna komponenterna i den tillbakaveckande reaktionen som stör med nickel rening.
  9. Snurra lösningen en gång vid 24.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Det är viktigt att avlägsna eventuell fällning. Överför supernatanten till två 50 ml rör, vardera innehållande 1 ml Ni-NTA-uppslamning som har tvättats med PBS. Rotera rören vid 4 ° C under en timme. Inkubation utspädd lösning feller 1 timme kan orsaka utfällning av felveckade proteiner som måste avlägsnas.
  10. Centrifugera ner rören vid 500 xg under 3 minuter. Avlägsna supernatanten försiktigt. Något flytande bör avlägsnas. Lägg kall PBS till 30 ml för varje rör. Snurra igen och avlägsna supernatanten. Upprepa denna process tills du ser ingenting men pärlor i röret.
  11. Överför Ni-NTA-harts till en tom kolonn. Tvätta hartset med 20 kolonnvolymer av 10 mM imidazol, 500 mM NaCl i PBS. Eluera His-RBP i 5 kolonnvolymer av 100 mM imidazol i PBS. Förvara inte denna lösning under en längre tid, och frysning minskar den slutliga avkastning och kvalitet. För bästa resultat, rena RBP med HPLC omedelbart.
  12. Dialysera His-RBP renats från Ni-NTA-harts mot 25 mM Tris, pH 8,4, och 120 mM NaCl. En koncentrator kan också användas för buffertbyte. Tydliga prover för HPLC genom centrifugering vid 16.000 xg i 10 minuter vid 4 ° C precis innan varje körning.
  13. Rena holo-RBP på HPLC med användning av en jonbytarkolonn AX-300 med en NaCl-steggradient (220 mM 12 min, 360 mM 15 min och 1.000 mM 15 min) med användning av 25 mM Tris, pH 8,4 som mobil fas vid 1 ml / min. Som NaCl-koncentrationen stiger, är holo-His-RBP släpps medan apo-RBP och RBP felvikt stanna bundet till kolonnen (figur 1). Om RBP återveckning inte görs optimalt felveckade RBP (t.ex. felveckade RBP-I i figur 1) kan dominera hela beredningen.
  14. Återvinn korrekt vikta holo-RBP från toppfraktionerna vid 360 mM NaCl. Noggrant övervaka elueringsprofilen av korrekt vikt och felveckade His-RBP. Vid 1000 mM NaCl, felveckade De flesta av hans-RBP bör frisläppas.
  15. Fraktioner innehållande holo-RBP poolas, koncentreras och dialyseras mot PBS över natten vid 4 ° C. Kontrollera slutliga utbytet och kvaliteten (330 nm/280 nm) genom spektrofotometer. Korrekt veckad produkt bör ha en 330 nm/280 nm-förhållande av något högre än 1 (figur 1).
  16. Till produktione apo-RBP, tillsätt en lika stor volym av heptan till de renade holo-RBP och blanda försiktigt genom att rotera över natten vid 4 ° C. Centrifugera vid 16.000 g under 10 minuter vid 4 ° C och försiktigt överföra den nedre vattenfasen till ett nytt rör (undvika utfällning vid gränsytan). Upprepa processen tre gånger med en 3 timmars inkubation för varje. Kontrollera absorption på en NanoDrop spektrofotometer för att se till 330 nm toppen har minskat till bakgrundsnivån.

2. Realtidsövervakning av STRA6-katalyserad Retinol utsläpp och Retinol Laddar

  1. Blockera en svart 96-brunnars Microfluor-2 platta (Thermo Scientific) med 200 pl Blocker Casein (Pierce) över natt vid 4 ° C för att förhindra ospecifik vidhäftning av holo-RBP till plasten. Blocker Kasein ger bäst blockerande effekten av alla de blockerande lösningar vi testade.
  2. Membran nyberedda från celler som uttrycker STRA6 eller celler kontroll tvättas med användning av PBS och fick passera genom en Hamilton-spruta (Gastight # 1710) 6 gånger för att ge en enhetlig suspension i PBS. Vi använder typiskt membran härledda från 1/100 till 1/20 av celler odlade på en 100 mm skål per reaktion.
  3. Tvätta de belagda brunnarna i mikrofluorplattan-2 platta en gång med 200 ^ il PBS. Kyl plattan på is före tillsats av membransuspension (50 pl per brunn).
  4. Realtidsövervakning av retinol fluorescens mäts med användning av fluorescens optik POLARstar Omega (BMG Labtech) med excitationsfiltret 320ex och emissionsfiltret 460-10. Programmet är inställd på Endpoint läsläge. Plattan läget kan också användas för att mäta en tidsperiod om tidsintervallen inte varierar. Signalen från varje tidpunkt är medelvärdet av 10 mätningar (kretsande medelvärdesbildning med en diameter av 2 mm) och förstärkningen sätts till 1.800. Plattan skakas under 10 sekunder vid 500 rpm med användning av dubbel-orbital skakning före varje mätning.
  5. För att starta retinol frisättningsanalysen, brunnarna läses en gång använda Endpoint läsning mode före holo-RBP (typiskt 1 pM slutlig koncentration) tillsätts vid 0 minuter. Så snart holo-RBP tillsätts, reaktionen övervakas kontinuerligt varje 5-10 min för 1-3 timmar. För att starta retinol lastning analysen, all-trans-retinol (typiskt 1 pM slutlig koncentration) sättes till brunnarna enligt svagt rött ljus. Plattan avläses en gång innan apo-RBP tillsätts vid 0 minuter. Så snart apo-RBP tillsätts, reaktionen övervakas kontinuerligt varje 5-10 min för 1-3 timmar.
  6. Efter alla mätningar görs, hämta rådata (exempel visas i figur 2) från Omega Dataanalys programvara (BMG Labtech) till Microsoft Excel för dataanalys. Varje tidpunkt genererar en fil som innehåller avläsningar av samtliga experimentella förhållanden. Till exempel, om det finns 20 tidpunkter, konsolidera 20 filer till en Excel-fil för dataanalys.
  7. För dataanalys är fluorescenssignaler före tillsats av retinol eller holo-RBP vid 0 minuter betraktas bakgrundssignaler end subtraheras från de slutliga fluorescens signaler vid alla tidpunkter. Även om bakgrunden signalerna är låga jämfört med retinol fluorescens i holo-RBP, subtrahera bakgrunden eliminerar den ospecifika inflytande ljusspridning av membranen och gör det möjligt att inrikta sig på retinol fluorescens av holo-RBP eller retinol tillsattes vid 0 minuter.

3. Realtidsövervakning av STRA6-katalyserad transport av retinol från Holo-RBP till CRBP-I

  1. Retinol-EGFP är en ny fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)-par som nyligen har fastställts 41. STRA6-katalyserad retinol transport från holo-RBP till EGFP-CRBP-I övervakas i realtid genom att mäta retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I fusionsprotein med 6XHis tagg (EGFP-CRBP-I) framställs i däggdjursceller och renas på Ni-NTA-harts före experimentet. EGFP-CRBP-I kan lagras i PBS med proteashämmare för en kort tid vid 4 ° C. Alternativt fusionsproteinet is frysta i -80 ° C i små alikvoter.
  2. Före reaktionerna, förbereda en blockerad Microfluor-2 platta och membran, såsom beskrivits ovan. Tvätta de belagda brunnarna i mikrofluorplattan-2 platta en gång med 200 | il PBS före tillsats av membransuspension (50 pl per brunn).
  3. Realtids retinol-EGFP FRET mäts med hjälp av POLARstar Omega med excitationsfiltret 320ex och filtren utsläpp 460-10 och 510-10 med samtidiga duell utsläpp fluorescens optik. Programmet är inställd på Endpoint läsläge. Plattan läget kan också användas för att mäta en tidsperiod om tidsintervallen inte varierar. Signalen från varje tidpunkt är medelvärdet av 10 mätningar (kretsande medelvärdesbildning med en diameter av 2 mm) och förstärkningen är satt till 1.800 per kanal. Plattan skakas under 10 sekunder vid 500 rpm med användning av dubbel-orbital skakning före varje mätning.
  4. För att starta reaktionerna, EGFP-CRBP-I (typiskt 1 pM slutlig koncentration) tillsätts till brunnarna. Plattan avläses påce hjälp läget Endpoint behandlingen före holo-RBP tillsätts vid 0 minuter. Så snart holo-RBP tillsätts, reaktionen övervakas kontinuerligt genom mätning varje 5-10 min under 1-2 timmar.
  5. Efter alla mätningar görs, hämta rådata (exempel visas i figur 3) från Omega Dataanalys programvara till Microsoft Excel för analys av data som beskrivs ovan.
  6. Retinol-EGFP FRET beräknas av dynamisk förändring i förhållandet mellan acceptor / donator emissionstoppar 47. Ekvationen 41 att beräkna detta förhållande är [(510 ton -510 b) / (460 ton -460 b)], där 510 ton, 510 b, 460 ton, och 460 b representerar utsläppen vid 510 nm efter initiering av reaktionen ( t = tid punkt), är vid 510 nm före retinol eller holo-RBP tillsattes (b = bakgrund), vid 460 nm efter initiering av reaktionen (t = tidpunkt), och vid 460 nm före retinol eller holo-RBP tillsätts (b = bakgrund), respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi presenterar här representativa resultat för holo-RBP produktion och rening med HPLC (figur 1), i realtid analys av STRA6-katalyserad retinol frisättning från holo-RBP och retinol lastning i apo-RBP (figur 2) och realtid analys av STRA6-katalyserad retinol transport från holo-RBP till EGFP-CRBP-I (Figur 3).

Utan återveckning, producerade RBP i bakterier är nästan helt felvikt grund av närvaron av många felaktiga disulfidbindningar. Därför, återveckning i närvaro av liganden retinol är mycket viktigt att erhålla väl vikta RBP. Vi fann att om tillbakaveckande reaktionen inte görs korrekt, felveckade RBP arter (t.ex. felveckade RBP-I i figur 1) kan dominera hela beredningen och utbytet av hög kvalitet holo-RBP kan vara mycket låg efter HPLC-rening. Därför kan HPLC korrigera inte problemet med dålig återveckning. Såsom visas i (figur 1). Även delvis felveckade RBP fortfarande binder retinol, är retinol / RBP komplexet mycket mindre stabil och RBP lättare släpper bundet retinol. Felveckade RBP kan leda till felaktiga slutsatser från RBP eller vitamin A-relaterade experiment. En annan skillnad mellan korrekt veckad RBP och RBP felvikt är att korrekt veckade holo-RBP är stabil under år vid 4 ° C i PBS. Omholo-RBP preparatet har felveckade RBP föroreningar kommer olösliga material uppstår efter en tids lagring. Olösliga material kan observeras efter spinning ned lösningen vid hög hastighet vid 4 ° C. Apo-RBP endast tillverkas av högkvalitativt holo-RBP.

När renat högkvalitativ holo-RBP eller apo-RBP är tillgänglig, kan den användas för att studera STRA6-katalyserad retinol transporter. Både i realtid retinol frisättningsanalys och retinol lastning analys beror på att övervaka retinol fluorescens. En källa av artificiell minskning retinol fluorescens är den ospecifika bindningen av RBP till plastskål (när RBP binds till plastväggen, kan det inte längre mätas i lösning). Vi har testat många blockerande förhållanden och fann att blockeringen Kasein (Pierce) är mest effektiv för att minska denna ospecifika och receptor-oberoende minskning av retinol fluorescens. En annan källa av artificiell minskning retinol fluorescens är dålig kvalitet på RBP, såsom diskuteratsovan.

STRA6-katalyserad retinol release, retinol lastning och retinol transporter är relativt långsamma händelser, som visas i de representativa data i figur 2 och 3. Reaktionerna är relativt långsamt eftersom varje RBP endast binder en molekyl av vitamin A och alla STRA6-katalyserade reaktioner beror på både RBP bindning och RBP-dissociering att fortsätta. För STRA6-katalyserade retinol frisättning reaktionen fortsätta, kan holo-RBP binder först efter apo-RBP dissocierar. För STRA6-katalyserade retinol lastning reaktionen fortsätta, kan apo-RBP binder först efter holo-RBP dissocierar. För alla Realtidsövervakning metoder som beskrivs här, fann vi att den ideala frekvensen för mätningen är en mätning var 5 min eller 10 min. Även om mer frekventa mätningar kan skapa högre tidsmässig, kommer de resulterande datafiler vara extremt stor eftersom varje tidpunkt skapar en Excel-fil.

Figur 1 tält-width = "5.5in" FO: src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
Figur 1. Rening av återveckad RBP på HPLC för att erhålla holo-RBP 100% laddad med retinol. Nickel harts-renade återveckad RBP appliceras på jonbytarkolonnen AX-300 med en NaCl-steggradient (220 mM 10 min, 360 mM 15 min och 1.000 mM 15 minuter). Den korrekt veckade holo-His-RBP frigörs och eluerades vid 360 nM NaCl. Absorptionsspektra (250 nm-400 nm) av de toppar som motsvarar korrekt veckat holo-RBP, felvikt RBP-1, felvikt RBP-2 och kontaminering visas också (proteintopp indikeras med en blå vertikal linje och retinol topp indikeras av röd vertikal linje). Klicka här för att se större bild .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Figur 2. Realtidsövervakning av STRA6-katalyserad retinol lastning i apo-RBP och retinol frisättning från holo-RBP. Denna analys spelat en viktig roll i att avslöja vad STRA6 kan göra själv utan LRAT eller CRBP-IA Ett exempel på rådata-fil för STRA6-catalzyed retinol lastning och retinol utsläpp som visas på Omega dataanalys programvara. För att initiera retinol Release reaktion holo-RBP till STRA6 membran eller kontroll membran vid 0 min. För att initiera retinol lastning reaktion retinol till STRA6 membran eller kontroll membran förblandat med apo-RBP vid 0 min. Fluorescensmätningar för 320 nm excitation och 460 nm emission avslöjade tidsförloppet av reaktionerna. Reaktionerna 1 till 6 skärm retinol loading in apo-RBP (1, 3, och 5 är STRA6 reaktion, 2, 4, och 6 är kontrollreaktioner). Reaktioner från 7 till 12 monitor retinol laddning i apo-RBP (7, 9 och 11 är STRA6 reaktion, 8, 10 och 12 är kontrollreaktioner). B. De slutliga beräknade signaler för reaktioner som visas i A. Den vänstra diagrammet beräknades baserat på reaktionerna 1 till 6. Den högra grafen beräknades utifrån reaktionerna från 7 till 12. Den högsta fluorescens signalen definieras såsom 1 i den vänstra diagrammet. Fluorescensen av holo-RBP tillsätts vid 0 min definieras som 1 i den högra grafen. Klicka här för att se större bild .

Figur 3
Figur 3. Realtidsövervakning av STRA6-katalyserad retinol transport från holo-RBP till CRBP-IA Ett exempel på råa datafil som övervakar FRET mellan retinol och EGFP som visas på Omega dataanalys programvara. Vid 0 min, holo-RBP sattes till reaktionerna innehållande STRA6 membran (reaktionerna 1, 3, och 5) eller kontroll-membran med EGFP-CRBP-Jag att initiera reaktionerna (reaktionerna 2, 4, och 6). Samtidiga duell emissionsmätningar för excitation vid 320 nm visade det gröna spåret som 460-10 utsläpp tidsförloppet och den blå kurvan som 510-10 utsläpp tidsförloppet. B. Den slutliga beräknade FRET signaler för reaktioner som visas i A. FRET signaler beräknas enligt de metoder som i steg 3,6. Klicka här för att se större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi delar här en optimerad protokoll RBP produktion eftersom RBP produktion och rening förfaranden är avgörande för att skapa korrekt vikt RBP. Med tanke på risken för felveckade RBP arter och förekomsten av spårmängder av bakteriella proteiner även i HPLC-renade bakterier producerade RBP är det bra att använda inhemska RBP från serum för att bekräfta en slutsats relaterad till RBP. Urin RBP, som är kommersiellt tillgänglig, är en komplex blandning av många arter av RBP inklusive apo-RBP och holo-RBP 48,49.

De Realtidsövervakning tekniker som beskrivs här bygger på den inneboende fluorescensen av retinol. Den ursprungliga drivkraft att utveckla dessa analyser var att vi begränsas av information som kan avslöjas av den klassiska radioaktiva analyser och HPLC-analyser. Till exempel fann vi att STRA6 har lite vitamin A upptag aktivitet av sig själv i vitamin A upptag analyser, men vi kan inte enkelt förklara den låga aktiviteten av STRA6 på vitamin A upptag utan LRAT eller CRBP-I 41. I retinylester-baserade analyser, är det lätt att förstå att STRA6 i sig inte gör retinylester eftersom STRA6 inte ett enzym som har LRAT aktivitet. Men även i retinol-baserade analyser, har STRA6 föga aktivitet av sig själv. Har STRA6 någon vitamin A upptag aktivitet alls? Om den inte gör det, hur kan CRBP-I eller LRAT accelerera sin verksamhet? Om den gör det, varför det behöver CRBP-I eller LRAT? Även radioaktiva analyser och HPLC-analyser inte svara på dessa frågor, resonerade vi att STRA6 bör ha möjlighet att frigöra retinol från RBP. Vi resonerade också att en retinol fluorescensanalys kan avslöja denna verksamhet. Retinol fluorescens mätning har gjort det möjligt att studera rörelsen av fri retinol i ryggradsdjur fotoreceptorceller efter ljus blekning av visuella pigment i realtid 50,51. Hur kan RBP receptoraktivitet övervakas genom mätning retinol fluorescens? Det upptäcktes itidiga 1970-talet med två forskargrupper som retinol dramatiskt har förbättrat fluorescens när de är bundna till RBP 52,53. Vi fann att STRA6-katalyserad retinol frisättning från holo-RBP orsakar en minskning i fluorescens retinol, medan STRA6-katalyserad retinol lastning till apo-RBP orsakar en ökning i fluorescens retinol. Även radioaktiva analyser och HPLC-analyser har använts i stor utsträckning för att studera vitamin upptag hade fluorescensanalyser inte använts för att studera RBP receptoraktiviteten tills nyligen, sannolikt eftersom de endogena membran som används som källa av receptorn har mycket hög bakgrundsfluorescens och har en komplex blandning av retinoid bindande proteiner / enzymer som gör det svårt att tolka bidraget av varje protein. De för närvarande tillgängliga känsliga instrument är också det som gör dessa tekniker mer genomförbart. Förutom att rikta fluorescensmätning den nya retinol-EGFP FRET par 41 tillsammans med samtidiga optik duell utsläppgör det möjligt att studera retinol transport till retinol-bindande proteiner i realtid och i flera reaktioner samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Med stöd av National Institutes of Health bidrag R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300, (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305, (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics