2-Gemi Tıkanıklığı / Hipotansiyon: Küresel Beyin İskemi Rat Modeli

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sistemik hipotansiyon ile birlikte iki taraflı karotis tıkanıklığı tekrarlanabilir şiddeti ile hipokampus hasar görebilir, sıçan küresel beyin iskemi üretir. Hayvanlar üzerinde beyin hasarı tahmin modelleri ile engelli, onlar expediently kurtarmak ve ölüm oranları nispeten düşüktür.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sanderson, T. H., Wider, J. M. 2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia. J. Vis. Exp. (76), e50173, doi:10.3791/50173 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Resüsitasyon takip Kardiyak arrest genellikle iskemi ve beynin sonraki reperfüzyon kaynaklanan dramatik beyin hasarı ile sonuçlanır. Küresel beyin iskemi iskemi 1 son derece duyarlı olduğu gösterilmiştir belirli beyin bölgelerinin zarar üretir. Hipokampal nöronlar özellikle diğer hücre popülasyonlarının ve göre iskemik hakaret daha yüksek duyarlılığa sahip, hipokampus CA1 bölgesinde iskemi / reperfüzyon 2 özellikle savunmasızdır.

Terapötik girişimlerin, ya da beyin hasarı dahil mekanizmalarının çalışması, tasarımı klinik durumu benzer ve tekrarlanabilir bir şekilde zarar üreten bir model gerektirir. Hipotansiyon ile iki taraflı karotis damar tıkanıklığı (2VOH) kardiyak arrest ve resüsitasyon sırasında oluşabilir serebral olaylar taklit, geri ön beyin iskemi üreten bir modeldir. Biz, Smith ve ark değiştirilmiş bir modeli açıklar. (1984) 2, Ilk olarak Sanderson ve ark. (2008) 3, seçici hassas beyin bölgelerinde 3-6 tekrarlanabilir yaralanma üreten mevcut haliyle sunulmaktadır. Bu modelin güvenilirliği uygulanan hipotansiyon, iskemi süresi, yakın sıcaklık kontrolü, belirli bir anestezi rejimi ve çalışkan ameliyat sonrası bakım sırasında sistemik kan basıncı hassas kontrolü ile belirlenir. Daha az hassas beyin bölgelerinde kurtulmuş ise 8 dakikalık bir iskemik hakaret, reperfüzyon 6 ile 24 saat boyunca ilerler CA1 hipokampal nöron hücre ölümü üretir. Bu aşamalı hücre ölümü kolayca CA1 nöronlarının yakın tam kaybı bu zamanda belirgin olduğu gibi, reperfüzyon ile 7-14 gün sonra ölçülür.

Bu beyin hasarı modele ek olarak, basit ama kapsamlı, metodoloji kullanılarak CA1 zarar miktarının tayini için bir yöntem mevcut. Önemlisi, miktar bir, basit bir kamera monte mikroskop kullanılarak gerçekleştirilebilirda ücretsiz ImageJ (NIH) yazılım eklentisi, maliyet-engelleyici stereology yazılım programları için ihtiyaç ve hasar tespit için motorlu bir mikroskobik sahne kalmayabilir.

Introduction

Kalp durması ve inme bir sonucu olarak beyin hasarı ölüm ve uzun süreli sakatlık önde gelen nedenidir. Kardiyak arrest kurbanları için kardiyopulmoner resüsitasyon bu hastaların% 60 daha sonra hastanede ölen en az kapsamlı beyin hasarı sonucunda ABD'de 7,8 yılda yaklaşık 70.000 hastalarda spontan dolaşımı sağlayacak başarılı ve ise sadece 3-10% yeniden hayata hastaların 9,10 eski yaşam devam edebilirsiniz. Açıkçası, küresel beyin iskemi sonrasında ve nörolojik travma en aza indirmek için tedavi yaklaşımları tasarımı beyin hasarına yol mekanizmalarını anlamak kritik önem taşımaktadır.

Beyin iskemi birden çok yöntem kullanılarak modellenebilir. En sık olarak, beyin iskemisi, böylece bir odak iskemik inme 11,12 üreten, beyin, orta serebral arterin büyük bir damar oklüzyonu ile kemirgen üretilir. Klinik olarak önemli iken,fokal beyin iskemi kardiyak arrest / resüsitasyon tarafından üretilen beyin hasarı incelemek için doğru bir yöntem değildir. Bu klinik paradigma modellemek için bütün iskemik beyin kan akışının yeniden yerleştirilmesi, ardından yapılmalıdır. Yakından klinik taklit etmek için, araştırmacılar deneysel CPR ve defibrilasyon 13,14 ile resüsitasyon ardından kardiyak arrest neden. Bu model klinik, ancak öngörülemeyen resüsitasyon kez değişkenliği artırabilir ve yorumlamak için veri analizi zor hale getirebilir. Ayrıca, bu model daha bir hipotezi test etmek gerekli hayvan sayısının artırılması, yüksek ölüm oranı ile ilişkilidir. Daha, tekrarlanabilir tutarlı, ve hayatta hakaret küresel iskemi ve / veya reperfüzyon için serebral yanıt incelenmesi tercih edilebilir.

Sistemik kan akışını korurken global iskemi beyinde uyarılabilir. Investigatio izin verirken Bu, ölüm azaltırN beyin 2'de doku hasarının mekanizmaları. Küresel beyin iskemi üretmek için, kesme veya büyük ölçüde beyin, internal karotid arter ve vertebral arter tedarik dört damarlarındaki akışı sınırlamak için gereklidir. Bu gemiler bir anastomoz döngü oluşturur Willis, Çemberi adı verilen bir damar yapısı ile kan akımı ile beyin kaynağı. Bu mimari, beyin damar proksimal damar tıkanması durumunda perfüzyon korumak sağlar. Bu nedenle, tüm katkı damarları aracılığıyla beyin, kan akışının tam iskemi ikna etmek için gerçekleşmelidir. Karotis arter tıkanıklığı istenen bir süre için anevrizma klip bir minimal invaziv ventral boyun cut-down ve uygulamasını kullanarak gerçekleştirilebilir. Onlar omurga enine foramen içinde incased olarak vertebral arter yoluyla kan akımının kesilmesi, zor olabilir. Araştırmacılar karotis önce vertebral arterler 24-48 saat electrocauterizing bu ele sahiptıkanıklığı ve beyin iskemi (4VO modeli) 15. Bu yaklaşımın aksine, Smith ve ark. Azaltarak küresel beyin iskemi uyararak kan akımı 2 kayıp ya da büyük ölçüde azalır bir noktaya vertebral damar yoluyla perfüzyon azaltmak için 40 mmHg için sistemik kan basıncı (MAP) ortalama bir yöntem geliştirdi . Karotis tıkanıklığı ile birleştiğinde, bu yöntem yakın kardiyak arrest hayatta bu taklit beyin hasarı bir model ile sonuçlanan, ön beyin boyunca iskemi üretir. Bu yöntemin daha rafine, biz burada mevcut modeli 30 mmHg sıkı HARİTASI düzenleme ± 1mHg iskemi tüm 8 dakika boyunca gerektirir. Biz Smith ve arkadaşları tarafından tasarlanan özgün tekniğin düşük ölüm oranı koruyarak bu değişiklik bu model neden olduğu beyin hasarı tekrarlanabilirlik artırır bulundu.

Hücre ölümü ve doku hasarının genel ölçüde hassas fenotipi nedenBurada sunulan model iskemik süresi 16 doğrudan bağlıdır. CA1 nöronlar reperfüzyon aşamasında 15,17 sırasında terapötik müdahale için geçici bir pencere olduğunu düşündüren, hücre ölümü gecikmiş, iskemi 8 dk sergilenirken ardından. Reperfüzyon başlangıcında, nöronlar hızlı fonksiyonu yeniden ve hemen bir hücre ölümü 18 saptanabilir. Ancak bu hakaret neden hücre ölümü şelaleden indüksiyon (apoptoz) bu reperfüzyon 3,19 4-6 saat arasında sitokrom-c, dahil olmak üzere mitokondri gelen apoptogenic proteinlerin açıklaması, sonuçlanan. Reperfüzyon saat 6 ila 24, CA1 hipokampus nöron hücre ölümü işledikleri ve apoptotik hücre ölümü programı 19 yürütülür. Iskemik hasar sorumlu hücre ölümü fenotipi yüksek tartışmalı olduğu not edilmelidir. Diğer diğer apopt rapor ise ilk çalışmalarda, nekroz birincil hücre ölümü fenotip 20,21 olduğunu ileri sürmüşlerdirtemel mekanizma 22,23 olarak osis. Toplamda, mevcut kanıtlar hücreleri klasik apoptoz gelen nekroz arasında değişen hücre ölümü fenotipleri bir spektrum ölmek öneririz. Hücre ölümü belirli modu her fenotip katkı derecesini diğer faktörler 24,25 arasında, hakaret şiddetine bağlı olarak, birçok faktöre bağlıdır. Reperfüzyon 24 saat olarak, ölen hücrelerin piknotik çekirdekleri, toplu hücresel içeriğinin açık kanıtlar ile yoğun sitozolde ve fonksiyonel mitokondriyal morfolojisi kaybı sahip. Ölü hücreleri daha fazla, bozuldu gibi makrofajlar ve / veya mikroglia gibi bağışıklık hücreleri tarafından yuttu ve CA1 hipokampal bölgeden temizlenir. Reperfüzyon 4-7 gün ile, ölü hücreleri kaldırılmış ve bütün bu kalıntılar inflamatuar hücreler ve glial hücreler 17,26 aktif hale gelir. Bu nedenle, reperfüzyon ile 7 gün CA1 hippokampal nöronal ölümde, basit, spesifik olmayan hücre lekeleri kullanılarak belirlenebilir optimal zamanı temsil ederkresil mor veya hemotoksilen-eozin cluding ve morfolojik dahil kriterlere göre sayılır. Bu geç reperfüzyon aralıkta kalan hücreleri böylece beyin hasarı bir dizin sağlayarak, hayatta kalan hücreler olarak sayılabilir.

Bu modeli tedavi yöntemlerinin belirlenmesi için kullanılmak üzere ise, deneysel tasarım MERDİVEN kriterleri (İnme Tedavi Akademik Sanayi Yuvarlak Masa) 27 takip önerilmektedir. Tasarımı ve bir çalışma yaparken bu yönergeleri takip edilmelidir, ancak burada ele değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hazırlık

Tüm hayvan deneyleri kurumsal kurallarına uygun ve önce başlatılması için ilgili hayvan bakım komitesi tarafından onay almak gerekir. Burada sunulan tüm işlemler Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım ve için ABD Hükümeti İlkeleri Kılavuzu'nda ortaya koymak olarak Komitesi kullanın ve hayvanların etik tedavi yönergeleri izleyin edilmiştir Test, Araştırma ve Eğitim Kullanılan Omurgalı Hayvanların Kullanımı ve Bakımı. Ameliyat başlamadan önce, gerekli cerrahi malzeme ve bir ameliyat kurtarma kafes hazırlar. Bu prosedür, bir hayatta kalma cerrahi ve bu yüzden, steril bir teknik uygulama için gereklidir.

  1. Bir vasküler kateter yapmak için, polietilen 50 (PE50) boru bir 8 inç uzunluğunda kesilir ve bir ucunu bir künt 23 iğne takın. Kateterler önceden sterilize veya b satın ayrı ayrı satın alınabilirGerektiğinde ulk ve daha sonra etilen glikol ile sterilize edilir.
  2. Üç yollu bir bağlantı noktası üzerine bu iğne Güvenli ve karşı liman başka bir üç yollu yerleştirin. Ile heparin serum fizyolojik çalıştırarak stopcocks ve kateter Heparinize. Musluk dik ve kateter distalinde üzerine 10 ml serum fizyolojik şırınga bağlayın. Basınç dönüştürücü tüp kateter distalinde musluk bağlayın, tuzlu su ile sistem doldurmak ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak.
  3. Hayvan kullanımı yönetmeliklere uygun olarak kurtarma kafesi Kur. Uyanma odasında sessiz ve düşük trafik olmalıdır. Buharlaşmış izofluran filtrelemek için aşağı hava akışı tablo veya benzeri gazı tahliye sistemi üzerinde ÖNEMLİ açın başında ameliyat öncesi.

2. Cerrahi Hazırlık

Sprague-Dawley sıçanları (300-350 g), küresel bir ön beyin iskemi 2VOH modeli kullanılmaktadır. Anestezi bağlı ve bakımı izofluran ve destek olanketamin bir alt dissosiyatif doz ile uygulandığın. Biz yalnız izofluran tarafından sürdürülen anestezi ameliyat sonrası kurtarma sırasında nöbet artan bir olay neden olduğunu gözlemledik. Nöbetler bu modelin tekrarlanabilirliği etkileyecek sinir hasarı ve ölüm, katkıda bulunabilir. Ketamin ile anestezi ilave izofluran çok daha düşük dozda anestezi cerrahi sınıf ulaşmasını sağlar. Bir homeostatik termal battaniye kullanarak çekirdek sıcaklığının sıkı düzenleme sağlar. Cerrahi işlem karotid arter cut-down ve izolasyon ve femoral arter cut-down ve kateterizasyon gerektirir.

Bu, her bireyin cerrahi işlem sırasında ayrıntılı kayıtlarını tutmak önemlidir NOT. Göbek ısısı, kan basıncı, ya da ameliyat sırasında veya öncesinde ortaya başka fizyolojik değişkenler değişiklikler ölçüde sonuçları değiştirebilir ve kayıtları bireyler ve gruplar arasında prosedürel tutarlılık sağlamak için analiz edilebilir. Tutarlılıkhayvanın fizyolojik parametreleri ameliyat öncesinde hayvanların oruç geliştirilebilir. Deneyci en tutarlı öncesi çalışan hemodinamik ve çalışmaları için serum glukoz konsantrasyonu neden bu yöntem belirlemek için teşvik edilmektedir.

  1. Bir indüksiyon odasına sıçan yerleştirerek anestezi neden ve% 5 izofluran az% 30 oxygen/70% azot oksit karışımı ile doldurun. % 2.5 izofluran ile 30% oxygen/70% azot oksit karışımı ile bir kemirgen laringoskop ve havalandırın kullanarak, bir 12 gauge kateter ile entübe. Havalandırma oranı nefes başına 2.5 ml dakikada 80 nefes olmalıdır.
  2. Tuzlu su içinde ketamin içi-periton enjeksiyon (20 mg / kg) verin ve% 1.5 izofluran azaltır. ÖNEMLİ anestezi yeterli cerrahi düzlemine sağlamak için işlem boyunca anestezi seviyesini ölçmek için zorunludur. Pedal refleks izlerken, arka-bacak basamak arasında anestezi, tutam derinliği kontrol etmek. Refleks iseyok, anestezi yeterlidir. Femoral arter kanülasyonu sonra, kan basıncı anestezi seviyesinin bir göstergesi olarak da kullanılabilir. Sonrası iskemik nöbet olasılığını en aza indirmek için anestezi cerrahi bir uçak korurken kadar düşük izofluran dozu mümkün tutun.
  3. Kesikler boyun ve pelvik bölgede yapılacaktır. Uyluk karın karşılayan boyun ve sağ pelvis, tıraş. Orient homeostatik termo-battaniye üzerinde yatar pozisyonda sıçan ve cerrahi yağ kullanarak rektal termometre yerleştirin. Koruyucu göz yağları kullanınız. Bir 60 watt ampul sıcaklığını düzenleyen yardımcı olabilir. Ampul hayvandan 8 inç daha yakın olmamalıdır. Normal fizyolojik sıcaklığı altında veya üstünde ÖNEMLİ sıcaklıklar (37 ° C) büyük ölçüde son nörolojik hasar etkileyebilir. 37 çekirdek sıcaklığı korumak ° C ± 0.5 ° C
  4. Betadin ile kesi alanları fırçalayın ve% 70 etanol ile yıkayın. Bu tw tekrarlayınkez daha o. Sıçan üzerinde bir cerrahi alan yerleştirin ve kesi alanları ortaya çıkarmak için delik kesti. ÖNEMLİ Karotis ve femoral arter kurtarma ve postoperatif analjezi için minimize sonraki ihtiyacı artıracaktır çevreleyen kas, herhangi bir travma olmaksızın izole edilebilir.
  5. Yeterli anestezi bekleyen, açık açık sternohyoid kas, trakea kapsayan önemli orta hat kas grubu ulaşana kadar tükürük bezleri arasında incelemek hemostat kullanarak, daha sonra, boyun boyunca orta hat kesi yapmak için neşter bir No 10 kullanın. Yine dikkatli künt diseksiyon tekniği kullanılarak, iki taraflı, sternomastoid gelen sternohyoid en büyük kas gruplarını ayırmak. Bu iki kas grupları karotid arter içeren nörovasküler bulmak için bir dönüm noktası olarak kullanılabilir üçgen bir girinti oluşturur. Iç ve dış karotid arterler içine karotid dalları. Bi proksimalinde karotis arter izoleFurkasyon.
  6. Yavaşça bu iki kas ayrı ve karotis arter bulun. Bir darbe için bu geminin bir görünüm tanımlamak yardımcı olmak için. Teknenin alt 3-0 ipek sütür ~ 5 inç uzunluğunda geçirerek her iki tarafta da karotid arter izole edin. . Gemilerden fasya temizlemek vagus siniri ve sempatik zincirleri servikal nörovasküler demet dahildir DİKKAT ve bakım karotis arter izole zaman zarar önlemek için alınmalıdır.
  7. Arka-bacak uyluk kasları karın karşılayan girinti boyunca, kasık ikinci bir kesi yapmak için makas kullanın. Eğer inguinal ligament ulaşana kadar uyluk kasları boyunca, karın kas altında incelemek. Bu femur nörovasküler demet gösterecektir. Dikkatle geminin altında 3-0 ipek sütür bir ~ 5 inç uzunluğunda geçerek femoral arter izole. Maruz kalan geminin 5-7 mm bırakarak fasya temizlemek.
  8. Maruz arterin distal ucunda kalıcı bir düğüm.
  9. Öğretilen dikişler çekerek, kan akışını tıkamak için arterin proksimal sonunda dikiş çekiş uygulayın. Oftalmik makas ile geminin üst kısmında küçük bir kesi yapmak. Gemide yetersiz çekiş ağır çekiş uygulanarak durdurulabilir hangi, kanama neden olur. Musluk de kateter kapatın.
  10. Vasküler bir introducer kullanarak, geminin kesi geçmiş ve orta hat doğru, kabına 7-9 mm kateter boru yerleştirin. Kateter istenilen mesafede yerleştirilir sonra, yerine sabitlemek için gemi ve kateter etrafında gevşek düğüm. Kabından çekiş çıkarın ve doğal yalan sağlar.
  11. Intravenöz 0.3 ml heparin (serum fizyolojik içinde 100U/ml), yönetmek. Herhangi yıkayınpıhtılaşmasını önlemek için tuzlu su, küçük bir miktar ile kateter kan. Basınç monitörü açın ve ekipmanları kalibre. Dönüştürücü kan basıncı algılamak için izin vermek için stopcocks açın. Kan basıncı hassas ölçümler elde etmek için, sistemin konumlandırma kalibrasyon sonra değiştirilmemelidir.
  12. Izofluran dozu 130 mmHg 110 mmHg kan basıncı (MAP) elde etmek için ayarlanmalıdır. Bu MAP anestezi yeterli cerrahi uçak göstergesi olmalıdır.

3. İskemi Protokolü

Daha önce belirtildiği gibi, dört gemi beyne perfüzyon kaynağı. Vertebral arter Willis poligonu ile telafi edecek, çünkü iki karotid arterlerin proksimal tıkanıklığı beyin iskemi neden olmaz. Bu neden olduğu sistemik hipotansiyon ile birlikte karotis tıkanma, beyin iskemisi ile sonuçlanan vertebral arter boyunca perfüzyon sınırlayacaktır olduğu gösterilmiştir. Burada descrhipotansiyon üretmek için kan çekilmesi ve kontrollü, tersinir iskemi üretmek üzere karotid arter sıkıştırma için protokol ibe. Şekil 1'e bakınız.

Kan oksijen ve karbon dioksit, glukoz konsantrasyonu ve pH örneklem grubuna bireyler arasında değişir ve yaralanmalara değişim neden olabilir. Bu fizyolojik değişkenlerin izlenmesi enfarktüsü değişkenliği azaltabilir. Belirtildiği gibi, sıcaklık perfüzyon büyük ölçüde deney iskemi 28 sırasında sınırlı olduğu gibi, düzenleyen ancak beyin sıcaklığı çekirdek sıcaklığı uygun olmayabilir önemli olan diğer bir parametredir. Beyindeki sıcaklık değişiklikleri bölgesinde özel cerrahi kurulum sonuçlar iskemi sırasında çekirdek sıcaklığı ayna değişir. Ancak, ısıl işlem ile ya da standartlaştırılması için başka araçlar tarafından beyin sıcaklığı izleme Bu deneysel belirleme deneyi için önemlidir. Çekirdek sıcaklığı beyin tem ayna yoksasıcaklık, bu çekirdek sıcaklığı ne olursa olsun, tüm işlem sırasında beyin sıcaklığını normotermik korumak için önemlidir.

Randomizasyon, cerrah bu noktada iskemi veya sham kontrol grubu hayvanları randomizes olduğunu belirler. Sham cerrahi kan basıncı ve karotis arter tıkanıklığı herhangi bir azalma hariç iskemik hayvanlar tam olarak aynı tüm prosedürleri takip edecektir. Bu sham kontrol grubu hayvanları arasında olduğu iskemik eşleşen bir süre boyunca anestezi aynı dozun altında olması önemlidir. Iskemi öncesi veya sonrasında anestezi gerektiren içeren bir tedavi grubu, var ise, sahte ve tedavi dk'lık anestezi dozu ve tedavi süresini grubunun aynı olmalıdır.

  1. Hazır hemostatik klipler ve klip aplikatör. Klipler tamamen herhangi bir travma olmaksızın geminin tıkamak gerekir. Hemodinamik tutarlı hale geldiğinde iskeminin neden olabilir. 10 ml heparinli syri bağlayınmusluk, dik ve kateter proksimalinde üzerine NGE. Çekilmiş kan pıhtılaşmasını önlemek için şırınga içinde heparinize tuzlu su, 0.3 ml (30 adet) olmalıdır.
  2. 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ve heparinli şırınga için musluk açık, kan geri böylece.
  3. Şırınga pistonu çekerek kan çekin. Çok fazla emme uygulanırsa, gemi daraltmak veya kateter açılış karşı sızdırmazlık ve kan çekilecek olacaktır. Bu, 1 dakika içinde kan 7-9 ml kaldırmak mümkün olmalıdır. Bu durumda değilse, arter içine daha fazla kateter gelişmiş ve yeniden deneyin. Biz kan 7-9 ml 30 mmHg, iskemi elde etmek için hedef kan basıncı yakın MAP azaltmak için kaldırılması gerektiğini bulmak. ÖNEMLİ geri kan ° C kan infüzyonla geri verilmesini sırasında soğutma önlemek için 37 tutulur emin olun.
  4. Bir dakika kan beraberlik (7-9 ml kan çekilmiş olmalıdır), karotis arterler için hemostatik klipler uygulamak ve bir başladıktan sonra8 dakika zamanlayıcı. Hemen kan basıncını kontrol edin. MAP 30 mmHg değilse, aşılamak ya da yavaş yavaş 30 mmHg ± 1 mmHg elde etmek için kan geri. 30 mmHg MAP korumak için iskemi boyunca bu uygulama devam ediyor. Tüm iskemi protokol boyunca ÖNEMLİ Kayıt tansiyon. 30 mmHg kan basıncı azaltmak için başarısızlık iskemi sınırlayabilir. Monitör çekirdek ve / veya beyin sıcaklığı yakından artar veya sıcaklık azaldıkça infüzyonla geri verilmesini sırasında beyin hasarı etkileyebilir.
  5. 8 dakika sonunda, hemostatik klip kaldırılması ve yavaş yavaş, dakika başına 2 mL kan yeniden infüze reperfüzyon başlar.
  6. Kan reinfused edildiğinde kanül femoral artere kaldırılabilir. Arter üzerinde kesi proksimalinde ameliyat sonrası, güvenli iki ayrı knot sırasında herhangi bir kanama önlemek için.
  7. 5-0 Vicryl dikiş ile, ters bir kesici iğne kullanarak süreksiz desenli kesiler dikin. Bu dikiş eriyecektir, bu yüzden r olmazkaldırma equire. NOT işlemi sırasında, yeterli anestezi izofluran düzeyi düşük ile ulaşılamazsa eğer, ketamin ek bir doz yönetmek.

4. Analjezi ve Kurtarma

Hayvan refahı kurtarma hem de cerrahi işlem sırasında önceliktir. Post-operatif bakım kurumun belirli kurallara uymak gerekir. Küresel beyin iskemi geçmesi Hayvanlar nöbetler duyarlıdır. Nöbet oluşumunu en aza indirmek için bu kurtarma oda minimal stimülasyon, yani sesler ve görme bozuklukları olması önemlidir. Bu amaç için tenha bir odada 72 saat bizim hayvan kullanımı protokol kapsamında, biz ev ameliyat sonrası hayvanlar.

  1. Kesiler dikildi edildikten sonra sıçan ventilatör kapalı sütten olabilir. Izofluran kapatın ve sıçan ventilatör karşı nefes başlayana kadar% 30 oxygen/70% azot oksit de havalandırma devam ediyor.
  2. 0.5 mg / k yönetmeksubkutan kürek kemikleri arasında 5 ml serum fizyolojik g butorfanol,.
  3. Hızla kan yeniden infüze sağ ventrikül ön yükünü artırabilir. Bu pulmoner dolaşım basıncı artar ve pulmoner ödem neden olabilir. Bu dahil belirtileri solunum sırasında solunum ve çatırtı sesleri yorucu. Pozitif ekspirasyon sonu basınç uygulayarak akciğer ödemi geliştirmemize yardımcı olacaktır.
  4. Solunum gönüllü kontrolü ele geçirdi olduğunda, Tüpü, termometre çıkarın ve ısıtma battaniye kapatın. Bu noktada, hayvanın bir kurtarma kafes içine yerleştirilebilir. Kafesin yarısı reperfüzyon sonrası ilk 24 saat boyunca bir su sirkülasyon örtü (34 ° C) üstünde, böylece geri kafes konumlandırılmalıdır. Sıcaklık muhafaza yardımcı olması için ısıtma battaniyesi üzerine kafesin parçası üzerinde hayvan yerleştirin. Hayvan anestezi ve analjezi kurtarmak için başladığında, kendini thermoregulate için kafes hareket edecek. Hayvanlar post-op sırasında ayrı ayrı yer olacak.
  5. Hayvan suya sınırsız erişimi olmalıdır. İki gün post-operatif, bu suyu 4 mg / kg sıvı Tylenol çözeltisi içermelidir. Kemirgen ek olarak, şekerli kahvaltı tahıl yemek uyarmak ve kilo kaybını önlemek için, kafes içinde sağlanmaktadır.
  6. Bir örtü ile kafesin yarısını kapsayacak ve yakından ameliyat sonrası iyileşme izlemek.
  7. Hayvan anestezi kurtarır gibi sıkıntı belirtileri izlemek için önemlidir. Yorucu veya tutarsız solunum muhtemelen entübasyon sırasında akciğer ödemi ya da hava yolu tahrişe neden sıkıntı bir işareti, olabilir. Butorphenol, ancak hafif aktivite 1 saat içinde faaliyet azaltarak sakin hayvan, geri alınmalıdır olacaktır. Biz hayvan davranır yeme ve ekstübasyon 4 saat içinde içme başlayacak bulabilirsiniz. 12 saatin sonunda, normal davranış ve beslenme aktivitesi devam edilmelidir. Sıkıntı bir diğer işareti kilo kaybı, bir hayvan herhangi bir 48 saat sürede orijinal vücut ağırlığının en fazla 20% kaybetmek gerekir, aşırı kilo kaybı varsa is hayvan ötenazi edilmelidir görülmektedir.
  8. Nöbetler meydana gelmesi halinde insani müdahale gereklidir. Nöbet aktivitesi Bu tür genellikle reperfüzyon sonra 24 ila 48 saat görülmektedir. Nöbetler başına iskemik hakaret bağımsızdır artan beyin hasarına neden olabilir, bu nedenle nöbet aktivitesi çalışmadan önceki 29 başlatılması için yerinde ayarlanmış bir dışlama kriterleri olarak kabul edilmelidir. Hiç kimse mevcut olduğunda nöbetler ortaya çıkabilir, bu nedenle işaretleri tanımak önemlidir. Yatak kafes rahatsız ve muhtemelen ihraç edilecektir. Bir postiktal sıçan, hızlı bir durgun eğilim var nefes ve / yorucu veya yara bere veya kanama burun olacaktır.

Ağrı veya sıkıntı izi NOT hemen analjezikler ile ortadan kalkar. Sympotoms analjezik bir doz ile kontrol altına veya analjezi üst üste dördüncü dozdan sonra devam değilseniz, hayvan ötenazi ve çalışma dışı olacaktır. Cerrahi wounds sekiz gün ameliyat sonrası için uygun şifa için kontrol edilmelidir.

5. Doku Toplama ve İşleme

Beyin paraformaldehidin transcardial infüzyonu ile sabitlenir. Brüt kesit ve cryoprotection sonra, bir kriyostat üzerinde beyin ve bölüm dondurma oturtun. Bu beyin bölümleri kresil violet ile boyandı ve ışık mikroskobu ile görüntülü.

  1. Indüksiyon odasına hayvan yerleştirerek ve% 5 izofluran ile% 30 oksijen /% 70 azot protoksit ile doldurarak anestezi neden. Hayvan entübe ve% 5 izofluran ile% 30 oksijen /% 70 azot protoksit da havalandırın.
  2. Perfüzyon işlemi için malzeme hazırlayın. 1x fosfat 100 ml 'si ile bir kabı doldurmak 4 de salin (PBS) tamponlu 4 ° C de ve% 4 paraformaldehid, 100 ml (PFA) ile birlikte bir deney şişesi ° C PBS, bir perfüzyon pompası aracılığıyla, PFA ile ardından beyin temizlendi. Boru her behere yerleştirilir ve bir bir üç yollu ile bağlı olacakPBS den PFA perfüzyon için yumuşak bir geçiş llow. Boru üzerine künt 18 iğne yerleştirin ve PBS ile hat doldurun. Iğne ve hava gibi tüp hava kabarcığı olmamasına dikkat edin perfüzyon engelleyebilir bir emboli, oluşturabilir. Ayrıca, beynin daldırma tespiti için PFA ile hazır bir küçük kap.
  3. Sıvı, en az 200 ml tutmak için yeterli kapasiteye sahip, bir sıvı toplama tepsisi kullanın. Bu noktada hayvan derin anestezi ulaşmak için (en az 3 dakika) yeterince uzun izofluran ile havalandırılmış olmalıdır.
  4. ÖNEMLİ anestezi cerrahi düzlemine ulaşılır olun.
  5. Bir kesi karın ile göğüs boşluğu erişmek için yaparak devam edin. Inen aorta Kelepçe. Kalp maruz kaldığı zaman, aort içine kalbin apeks ile körlestirilmiş 18 iğne yerleştirin. Perfüzat hayvan çıkmak için izin vermek için doğru kulak küçük bir kesim olun.
  6. PBS ile başlayarak, 50 mL / dk 'da pompa açın. Pumpi sonraPBS ng 100 ml, PFA 100 ml serpmek için musluk geçin.
  7. Doku zarar vermemeye dikkat ederek, beyin çıkarın.
  8. Bir doku matriks içine beyin yerleştirin ve beyincik ve beyin arasında kesti. Bölüm ön beyin, serebral korteksin ön ve arka ~ 3 milimetre. Bu üç bölümden üretecek, orta bölüm, hipokampus içerecektir.
  9. Tam daldırma için yeterli PFA ile bir kavanoza beyin bölümleri yerleştirin. Daldırma tam 2 saat için beyin düzeltmek.
  10. Donma verdiği zararlara karşı doku korumak için, beyin PBS içinde% 30 sakaroz ile PFA değiştirerek cryoproteced edilir. Doku örnekleri sakaroz çözeltisini (~ 24-48 saat) lavabo ile cryoprotection tamamlandı.
  11. Beyin bölümleri dondurmak snap, kuru buz bir beher koyun ve on dakika 2-metilbütanolü ile doldurun. 5 dakika boyunca metilbütanolü içine beyin dilimleri yerleştirin, sonra cryost kadar -80 bir yapışmalı konteyner ve mağaza ° C içine aktarmakkesit de.
  12. 20 mikron Kriyostat bölümünde beyin, 3 beyin atlas koordinatları (Stereotaksik Koordinatlar içinde Rat Beyin. Paxinos ve Watson, plaka bölümleri 29, 31, 33 veya bregma -2.8 mm, -3.3 mm ve -3.8 en az 3 bölüm toplama mm). Bölümler ücret mikroskop slaytlar yerleştirilir ve -80 ° C'de depolamadan önce kurumaya bırakılır
  13. Cresyl menekşe (pH 3.5 de% 0.1) her beyin atlası koordinat az 9 beyin bölümleri, 3 leke.
  14. Bir mikroskop ile 40x de hipokampus görüntü CA1 bölgesinde kamera monte ve CA1 nöronal uçağı ile 300 mikron ölçek çubuğu paralel yerleştirin. TIFF dosyaları olarak kaydet.

6. Brain Damage miktar tayini

ImageJ, Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından sunulan ücretsiz bir program, beyin hasarı ölçüde temsil edecek uygun nöronlar, saymak ve ölçmek için kullanılabilir.

  1. ImageJ 'hücre sayıcı' eklentisi ile açık mikroskop TIFF görüntüleri. Bir seçinölçek çubuğu sınırları içinde renk ve sayısı nöronlar işaretleme. Nöronlar astrosit / mikrogliyal morfolojisi (küçük yuvarlak veya uzun boru şeklinde) için nöronal morfoloji (büyük, piramit şekli) veya dışlanma kriterlerine göre basit dahil kriterlere göre sayılır.
    ÖNEMLİ içerme / dışlama slaytlar arasında kriterleri ve nöronlar sayma bireyler ile tutarlı olun.
  2. Kayıt nöron sayıları ve hücre sayıcı pencere kaydedin.
  3. Nöron sayıları tutarlı, doğru nöron sayıları elde etmek için iki ayrı kişi tarafından tamamlanmalıdır.
  4. Her hayvan için tüm 9 görüntüleri ortalama istatistiksel analizde kullanılmak üzere CA1 hipokampal hasar kantitatif ölçüsüdür tek bir ortalama "nöron sayısı", sağlayacaktır. Gruplar statik normallik testi başarısız bir Tukey HSD post hoc analizi test, ya da,, Dunn po takip saflarında bir Kruskal-Wallis tek yönlü ANOVA ardından tek yönlü ANOVA ile karşılaştırılabilirst hoc analiz istatistiksel olarak gruplar arasında farklılık değerlendirmek için. Özel istatistiksel analiz bireysel çalışma tasarım tarafından dikte edilmelidir, burada sunulan bir test edilen belirli hipotezler için uygun olmayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genel bir beyin iskemi / reperfüzyon 2VOH modeli hipokampusun CA1 bölgesinde nöronal ölüme neden olur. Şekil 2, 14 gün sonra, reperfüzyon işleme genel bir beyin iskemisi 8 dak, tarafından üretilen hasarı temsil eder. Şekiller 2A ve 2B, plasebo arasındaki hipokampi karşılaştırarak kresil violet ile boyandı sonrası iskemik beyin,. Şekil 2A sağlam CA1 dahil olmak üzere, normal morfoloji sergileyen bir sahte operasyona sıçan bir hipokampus gösterir. Şekil 2B iskemi / reperfüzyon için hipokampus konu, gösteriyor nerede dentat girus, CA2 ve CA3 minimal morfolojisi etkilemiştir. CA1 hipokampus seçici hassas nöronlar iskemi / reperfüzyon hasarı hayatta olmayan ve sadece dağınık nöronlar kalır. Bununla birlikte, infiltre eden makrofaj ve / veya mikroglia (IBA-1-pozitif hücreleri), ve reaktif astrositler (GFAP-pozitif hücreleri) önemli bir artış, CA1 saat belirgindirippocampal alanı. Neun, makrofaj / mikroglia Iba-1 ile etiketleme ve GFAP ile astrosit etiketleme ile nöronların belirli immunofluorescent etiketleme bu bulguları doğrulamıştır.

Şekil 2C 40x büyütme CA1 bir mikroskop görüntüleri için pencere sayma örnek nöron sunar. Üst panelde yer alan sahte operasyona kontrolünden CA1 gösterir ve alt panel iskemi / reperfüzyon CA1 aşağıdaki gösterir. Yaralı CA1 mikroglia ve küçük ve boru veya şekilli gözyaşı görünür astrositlerin, içeren bir boyama görüntüler. Bunlar şekli ile nöronlar ayırt edilebilir. Bozulmamış hipokampal nöronlar, dentat girus olsun, CA2 veya CA1, dairesel veya piramit şekli ile büyüktür.

Rakam 2D CA1 nöronal sayıları ile ölçülebilir 2VOH bağlı yaralanma bir grafik analizidir. Bu 2VOH modeli tarafından üretilen iskemi 8 dk neden olduğu söylenebilir tutarlı ve reproduciblE yaralanma öncelikle CA1 hipokampus izole edilmesini.

Şekil 1
Şekil 1. Deneysel Timeline. Deneysel çizelgesi cerrahi adımları ve doku işleme bir temsilidir.

Şekil 2,
Şekil 2. Temsilcisi Sonuçlar. Işlenmemiş bir sıçan hipokampus hasar sham kontrol sıçan (A) göre I / R (B) tabi. Cresyl mor lekeli hipokampus (10X) [Surround] 40X CA1 bir büyütme, CA2, CA3, hilus ve DG (üst Lefta saat yönünde). (B) Hasar CA1 hipokampusunda lokalizeCA1 bir kampüsün. (C) nöron sayımı ve hasar miktar sahte çalışan kontrolü hayvan (üst, kontrol) ve küresel beyin iskemi maruz kalan bir hayvan için kullanılan Temsilcisi sayma pencereler (alt, I / R). (D) Temsilcisi kantitatif yayınlanmamış bir çalışma hipokampal nöron sayıları (+ standart sapma;, n = 8, p <0.05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan modeli insanlarda bulunan benzer bir yaralanma sağlayan, kalp durması ve canlandırma bir sonucu olarak ortaya çıkabilir beyin İşemi üretir. Genel beyin iskemisinde üretmek için bu yöntem birden fazla protokol biridir. Biz, nispeten düşük ölüm oranı, hızlı iyileşme ve tekrarlanabilir sonuçlar için en önemli bu protokolü kullanır. Kardiyak arrest / resüsitasyon modeli ancak teknik olarak, belki sürekli yeniden en zor klinik olarak en uygun modeldir. Küresel beyin iskemi 4VO modeli dört katkıda gemi iskemi sırasında tıkalı olduğu aslında değerli başka bir yaygın olarak kullanılan protokoldür. Bu model aynı zamanda birden fazla cerrahi ve nöroprotektif önkoşullandırma olasılığı dahil sakıncaları vardır. 4VO Model bir işlem sırasında dört gemilerin geçici oklüzyonu iskemi üretmek için izin, adapte edilmiştir, ancak cerrahi teknik kalırly 30 talep.

2VOH Üzerine Çeşitlemeler sonuçları 31,32 bir dizi üretmek için gösterilmiştir. Iskemi ve hipotansiyon derecesi Süresi sonucunu etkileyebilecek önemli değişkenlerdir. Raporlar kan basıncı yeterli azalır değilse üretilen yaralanma sıçanlarda 30 tutarsız veya tek taraflı olabilir göstermiştir. Biz önemli çevresel zarar vermeden güvenilir iskemi üretir çünkü hipotansiyon optimum derecede olduğu 30 mmHg bulduk. Bu paradigma ancak bizim protokol komplikasyonların başka şansının artması azaltacaktır ardından şiddetli olarak karakterize iskemi üretir. Hakaret şiddetli doğası genellikle yaralanma tutarlılık etkilemez hayvanlar arasındaki fizyolojik parametrelerinde nedeni hafif bir değişiklik olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ç mali çatışmalar var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting Ethicon J391H
Scalpel, No.10 Swann-Morton 6601
Gauze Sponges Fisher 22-362-178
18G x 1 ½ in needle BD 305201
23G x 1 in needle BD 305145
26 G x 3/8 in needle BD 305110
18 G x 1 ¼ catheter EXEL 26735
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
60 ml syringe BD 309653
Surgilube Henry Schein 1152666
.9% Saline, plastic IV bag Henry Schein 1537468
Suture 3-0 Silk Henry Schein 1007842
Puralube Ophthalmic Ointment Henry Schein 3390017
Betadine Henry Schein 6903564
Sterile Towel Drape Moore Medical 14170
Polyethylene Tubing, 50 Intramedic 427411
Stopcock, 3 way Smiths medical MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane) Henry Schein 2091966
Mapap Liquid (Tylenol) Major Pharmaceuticals 1556
Kedavet (ketamine) Ketathesia Butney NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol) Lloyd Labs 4881
Heparin APP Pharmaceuticals 504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills Elecron Microscopy Sci. 19202
2-methylbutane Sigma 270342
Cresyl Violet Acetate Sigma C5042
Sucrose Sigma S9378
Software
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
  2. Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
  3. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
  4. Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
  5. Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
  6. Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
  7. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
  8. Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
  9. Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
  10. Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
  12. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
  13. Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
  14. Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. (2012).
  15. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
  16. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
  17. Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
  18. Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
  19. Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
  20. Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
  21. Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
  22. Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
  23. Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
  24. Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
  25. Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
  26. Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
  27. Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
  28. Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
  29. Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
  30. Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
  31. Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
  32. Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics