Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (

Neuroscience

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Summary

En este protocolo se muestra cómo acondicionar aprovechado las abejas a los estímulos táctiles e introducir una técnica de captura de movimiento 2D para analizar la cinemática de escala fina patrón de muestreo antenal.

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Mujagić, S., Würth, S. M., Hellbach, S., Dürr, V. Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.). J. Vis. Exp. (70), e50179, doi:10.3791/50179 (2012).

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Abstract

Las abejas de miel (Apis mellifera L.) son insectos eusociales y bien conocido por su compleja división del trabajo y la capacidad de aprendizaje asociativo 1, 2. Las abejas obreras pasar la primera mitad de su vida en el interior de la colmena oscura, donde se está cuidando las larvas o la construcción de la regular peines hexagonales para la alimentación (por ejemplo polen o néctar) y cría 3. Las antenas son antenas multi-sensoriales extraordinarias y desempeñan un papel fundamental en diversas tareas táctiles mediadas por 4, incluyendo la construcción de la colmena 5 y reconocimiento de patrones 6. Más tarde en la vida, cada abeja sale de la colmena para buscar comida. A continuación, una abeja tiene que aprender a discriminar fuentes rentables de alimentos, memorizar su ubicación, y la comunicará a sus compañeros de nido 7. Las abejas utilizan diferentes señales florales como colores u olores 7, 8, sino también señales táctiles de la superficie del pétalo 9 para formar memorias multisensoriales de la fuente de alimento. En virtud de laboratorio conditions, las abejas pueden ser entrenados en un paradigma de aprendizaje apetitivo para discriminar las características táctiles de objetos, tales como bordes o surcos con sus antenas 10, 11, 12, 13. Este paradigma de aprendizaje está estrechamente relacionada con el condicionamiento clásico de la respuesta olfativa de extensión proboscis (PER) en abejas enjaezados 14. La ventaja del modelo de aprendizaje táctil en el laboratorio es la posibilidad de combinar los experimentos de comportamiento en el aprendizaje con diversas mediciones fisiológicas, incluyendo el análisis del patrón de movimiento antenal.

Protocol

1. Preparación de las abejas

  1. Recolectoras de néctar o polen son capturados en el campo ya sea desde un alimentador de sacarosa o directamente desde la entrada de la colmena cuando regresaba de un viaje de forrajeo. Cada abeja es capturado en un vial de vidrio que se cierra con un tapón de espuma y se lleva inmediatamente al laboratorio para su posterior manipulación.
  2. En el laboratorio, las abejas se capturaron brevemente enfrió en el refrigerador a 4 ° C hasta que muestren signos primera de inmovilidad.
  3. Cada abeja inmovilizado está montado en un pequeño tubo de metal con cinta adhesiva entre la cabeza y el tórax y en el abdomen. Se debe tener cuidado de que la trompa y las antenas se mueven libremente.
  4. Pintar los ojos compuestos y ocelos de la abeja fijo con pintura blanca (por ejemplo, libre de solventes Tipp-Ex) para ocluir la visión.
  5. Agregar una pequeña gota de cera derretida detrás de la cabeza de la abeja para fijarlo a la cinta entre la cabeza y el tórax para evitar movimientos de la cabeza durante las grabaciones.
  6. Marque cada abeja con un número en la cinta para una mejor identificación y coloque el tubo con la abeja fijo en un ambiente húmedo para evitar la deshidratación.
  7. Alimentar cada sola abeja durante 5 segundos con gotitas de una solución de sacarosa al 30% se presentaron con una jeringa y dejar que todas las abejas recuperar durante 30 min antes de comenzar con el protocolo acondicionado táctil.

2. Aire Táctil

  1. Antes de acondicionamiento, cada abeja tiene que ser probada por la respuesta de extensión probóscide (PER) a un estímulo de sacarosa al 30% aplicado a las antenas. De esta manera la punta de la trompa tiene que cruzar una línea virtual entre las mandíbulas abiertas. Deseche todas las abejas que no responden con un PER para el estímulo de sacarosa.
  2. Para el acondicionamiento táctil utilizar un cubo de latón (por ejemplo, 3 x 5 mm) con una superficie lisa o un patrón de grabado, por ejemplo, horizontal o ranuras verticales que forman una rejilla con 150 micras de longitud de onda, como el estímulo condicionado (CS). Fo el estímulo no condicionado (EE.UU.) utilizar una solución de sacarosa al 30% (azúcar doméstico, diluido en agua).
  3. El cubo de latón (CS) se coloca en un soporte en un micromanipulador (por ejemplo, Märzhäuser MM33) para asegurar el posicionamiento exacto durante el procedimiento de acondicionado. Los EE.UU. se presenta a la abeja con una jeringa llena de una solución de sacarosa al 30%.
  4. El procedimiento de acondicionamiento se compone de cinco emparejamientos de la estímulo táctil (CS) y solución de sacarosa (EE.UU.), con un intervalo entre ensayos (ITI) de 5 min. Coloque una sola abeja en frente de la micromanipulador con el estímulo táctil montada (CS). Coloque la CS lentamente, de tal manera que la superficie del estímulo táctil es paralela a la cabeza de la abeja (Figura 1 A y B). La distancia entre el animal y el objeto táctil debe estar en el rango del radio antenal de trabajo de la abeja probado, es decir, la abeja debe ser capaz de escanear el estímulo táctil en una posición cómoda wi-ésimo ambas antenas. En el ejemplo mostrado en la Figura 1, la distancia era de 3 mm. Deje que la abeja escanear el estímulo táctil (CS) durante 5 segundos. Después de la primera sec 3, presentan una gotita de la sacarosa al 30% (EE.UU.) solución con una jeringa bajo la proboscis. Utilice la punta de la jeringa para elevar suavemente la probóscide. Estimulación sacarosa bajo la probóscide provocará la incondicionado PER 15. Deje que la abeja a lamer la recompensa sacarosa. Use un cronómetro con una señal de alarma para mantener los intervalos de tiempo exactos durante el acondicionamiento.
  5. El PER acondicionado se usa como una medida para el éxito de aprendizaje de una abeja. Después de que los emparejamientos primera recompensa, las abejas comienzan a responder a la presentación CS, por extensión, de su trompa, lo que indica que esperan que la recompensa futura. A probóscide completamente extendidas observadas en cualquier momento durante la ventana de tiempo de 3 segundos de presentación del estímulo táctil y antes de la presentación de sacarosa se obtuvo una respuesta positiva. No hay respuesta se cuenta negativa. El occurrence de la PER ha de señalar por el experimentador. El porcentaje de abejas que muestran el PER durante la presentación de CS se traza para cada ensayo.

3. Grabaciones cinemáticos

  1. Movimientos antenales de una sola abeja aprovechada se graban con una cámara de vídeo digital con un lente macro adecuada (por ejemplo Basler A602f-2 equipado con TechSpec VZM 200, funciona a 50 fps a través de una conexión de cable de fuego). La cámara se coloca por encima del animal en una vista de arriba hacia abajo (Figura 1 A). En la Figura 1, la resolución espacial de las grabaciones es 0,02 mm / pixel.
  2. Calibrar la cámara mediante la grabación de imágenes individuales de un tablero de ajedrez 10 x 10 mm con una longitud de arista de 1 mm a partir de diferentes orientaciones en el marco del objetivo de la cámara. La calibración se puede hacer con la caja de la cámara herramienta de calibración 16 Matlab.
  3. Coloque una sola abeja fijo por debajo del objetivo de la cámara. Presentar el estímulo táctil, fijado a un micromanipulador, Para el animal. Proceder de la misma manera como se describe para el acondicionamiento táctil, y registrar el movimiento antenal mientras que la abeja se analizó el objeto. Es importante que toda la gama de trabajo antenal y el estímulo táctil son visibles. Las opciones de los patrones de estímulos probados y números de ensayo dependerá del diseño experimental.

4. Análisis de Datos

  1. El cálculo de la imagen de fondo se realiza en Matlab. En primer lugar, el valor medio de escala de grises en el tiempo tiene que ser calculado para cada píxel. Los objetos estáticos, como la cabeza fija de la abeja y el estímulo táctil, constituirán el fondo de la imagen. Los objetos en movimiento, como las dos antenas, no será parte de los antecedentes.
  2. Cada fotograma de la grabación de vídeo tiene que ser cargado de forma secuencial, y la diferencia entre la trama actual y la imagen de fondo tiene que ser calculado. El resultado de esta resta hace hincapié en las partes de la imagen que se están moviendo de marco a marco. Identificacióneally, las antenas de las abejas son las únicas áreas de valores distintos de cero (Figura 1 C).
  3. Para el tratamiento posterior, las dos mayores áreas con valores de los píxeles que no son cero se supone que son las antenas. Para ambas antenas una máscara binaria se ha de generar para cada píxel que contiene un valor de 1, si el píxel pertenece a la antena y el valor 0 de lo contrario. Esta máscara sirve de base para la localización de las puntas antenales más tarde. Para obtener una máscara preliminar para toda la imagen gris del valor de cada píxel de la imagen de diferencia se compara con un umbral predefinido. Dado que nosotros nos encargamos de ruido a finales de este umbral se elige para ser bastante baja. La máscara preliminar entonces todavía lleva dos tipos de errores: En primer lugar, debido al ruido de la imagen pequeñas regiones son todavía parte de la máscara. En segundo lugar, las zonas que pertenecen a la antena podría no ser necesariamente completamente conectada. En estas últimas, se produce si el fondo tiene aproximadamente la misma luminiscencia como la antena. Para eliminar estos artefactos, estándaroperación de procesamiento de imagen morfológica se aplican, es decir, una combinación de erosión y dilatación imagen, confiando en las funciones estándar de Matlab imerode y imdilate respectivamente (ver 17 pp 158-205 para una explicación más detallada). Después de que el proceso de eliminación de ruido de las hipótesis antenas son todavía contenido dentro de la misma máscara. Por lo tanto, como paso siguiente la máscara binaria está agrupado por áreas disjuntas utilizando el estándar de Matlab función bwlabel (ver 17 pp 40-48 para más detalles sobre el algoritmo de segmentación de imágenes).
  4. El número de píxeles por racimo se cuenta y los dos mayores grupos seleccionados. El centro de gravedad se calcula para distinguir entre la antena izquierda y derecha (Figura 1D).
  5. La punta antenal para cada antena puede ser definido como el píxel en un grupo con el valor más alto en la dirección proximal a distal (véase la Figura 1D).

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Representative Results

En el siguiente experimento estudiamos cómo afecta la conducta de aprendizaje táctil muestreo antenal en las abejas melíferas. Para ello, se monitoreó el movimiento de la punta antenal en abejas naïve y acondicionado antes y durante la presentación de un estímulo táctil.

En primer lugar, el movimiento espontáneo antenal de un grupo de recolectoras de polen (N = 42) fue registrada por 1 min. Una media de las abejas (N = 21) se acondicionó a continuación, por el emparejamiento de cinco veces un estímulo táctil con una recompensa de sacarosa al 30%. Este fue el grupo acondicionado. El estímulo táctil fue el de 30 x 50 mm superficie de un cubo de latón con una rejilla grabado horizontal (λ = 150 mm). La otra mitad de las abejas (N = 21) no se acondicionó y se utiliza como un grupo ingenuo. Figura 2 muestra la curva de aprendizaje de la media acondicionado grupo de abejas. El porcentaje de PER acondicionado después de la primera recompensa es significativamente diferente de la conducta espontánea (Figura 2 ª.

Después, el movimiento de la punta antenal tanto en el condicionado y el grupo ingenuo se registró de nuevo durante 1 min en presencia del estímulo táctil Figura 3 A 1 -. B 2 muestra la distribución de las ubicaciones de punta antenales en ambos grupos, antes y durante la presentación del objeto táctil. Tanto, la ingenuidad y el grupo acondicionado cambiado su patrón de movimiento antenal en presencia de un estímulo táctil en comparación con el comportamiento espontáneo. La probabilidad de que la punta antenal de búsqueda y / o muestra de la zona del estímulo se incrementa significativamente si el estímulo estaba presente, que muestra que el muestreo táctil implica un cambio notable en el patrón de movimiento antenal en comparación con el movimiento espontáneo antenal. Esto es cierto para ambos grupos de abejas (Figura 3 C 1 y C (Figura 3 C 1 y C 2, Mann-Whitney U test, P <0,05; no hubo diferencia significativa entre los dos períodos de referencia A en la Figura 3C). Así, acondicionado táctil conduce a un incremento de movimiento antenal activo cerca del objeto y de muestreo táctil de la superficie del objeto como se indica anteriormente en Erber (2012) 18. En comparación con el grupo ingenuo, la distribución espacial durante la presentación del estímulo fue mucho más suave después del acondicionamiento (comparar Figura 3 B 1 y B 2).

En resumen, los resultados de este experimento muestran que las abejas puede ser entrenado muy eficaz en la respuesta a un estímulo táctil, y que el aprendizaje táctil está acompañado por un aumento de actihe buscando y probando el comportamiento.

Figura 1
. Figura 1 La grabación de vídeo y el procedimiento de seguimiento antenal A:. Vista cenital de una abeja fijo y el estímulo táctil. El estímulo táctil se coloca delante de la cabeza de la abeja fija con los ojos ocluidos. Se encuentra dentro de la gama de trabajo antenal. d y p indican la ubicación distal y proximal en relación con el animal B:. Vista lateral de la misma abeja y el estímulo táctil. La superficie del estímulo táctil y la cabeza de la abeja (líneas azules punteadas) son paralelos entre sí C:. Distintivas pixeles movimiento de pixeles de imagen estática en una secuencia de vídeo. Restando cada imagen a partir de un modelo de fondo permite la identificación de las partes móviles, es decir, la Antennae. El cabezal fijo de la abeja y el estímulo táctil (indicado aquí como líneas de puntos rojos) son estáticas y no es visible después de la resta D:. Definición de izquierda y derecha y la punta de la antena. Los dos principales grupos de píxeles después de la resta se identifican como antenas. Cálculo del centro de gravedad permite distinguir entre la izquierda (rojo) y la antena derecha (verde). La punta antenal para cada antena (negro cruz) se puede definir como el píxel en un grupo con el valor más grande en la dirección distal.

Figura 2
Figura 2. Curva de aprendizaje del condicionamiento POR táctil. Recolectoras de polen fueron entrenados usando cinco emparejamientos de la CS (estímulo táctil) y los EE.UU. (solución de sacarosa) con un intervalo inter-ensayo de 5 min. El porcentaje de respuestas positivas de 21 animales se traza para el comportamiento espontáneo (SPONT) y duanillo presentación del CS después de cada ensayo de condicionamiento. El porcentaje de PER observó después de la primera y todas las siguientes recompensas es significativamente diferente de la conducta espontánea (prueba de probabilidad exacta de Fisher, p <0,001).

Figura 3
Figura 3. Normalizados distribuciones medias de la localización de la punta antenal durante un período de 1 min. La distribución punta antenal de cada abeja se normalizó para el número total de puntos de datos por animal. Los paneles muestran los resultados de ingenuo (a la izquierda, N = 21) y las abejas acondicionado (derecho, N = 21) antes (A) y durante la presentación del estímulo (B) A 1 y A 2:.. Antenal movimiento espontáneo antes de la presentación del estímulo El eje de abscisas muestra la posición lateral de la punta antenal relativa a the centro de la cabeza (comparar con la figura 1C y D). El eje de ordenadas muestra la posición distal de la punta de la antena. La escala de color indica el porcentaje de tiempo que la punta antenal gastado en cualquier localización dada. El período de registro de 1 minuto fue equivalente a 3.000 fotogramas B 1 y B 2:. Igual que en un 1,2, pero durante la presentación del estímulo C 1 y C 2:. Número medio de cuadros en los que se encuentran en el interior de la punta antenal el área del objeto, es decir, ± 3 contenedores relativos distal o proximal a la superficie de estímulo. C1: grupo ingenuo C2: Grupo acondicionado. Las parcelas bigotes de caja muestra la mediana, media, cuartiles y rangos percentiles 5-95% del número de fotogramas por minuto. En ambos grupos de abejas, hay una diferencia significativa entre 'ningún estímulo' (A) y 'con estímulo' (B, C; Wilcoxon signed rank test, C 1: P = 5,39 * 10 -4; 2 C -5). El número medio de fotogramas durante la presentación del estímulo táctil es significativamente mayor en las abejas acondicionado, que en las abejas no tratados previamente (U de Mann-Whitney U test, C 1 - C 2: P = 0,007). Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Discussion

Preparación de las abejas: Recogida y se fijan las abejas debe hacerse rápidamente, con el fin de mantener el nivel de estrés de la baja animal. El estrés tiene un efecto sobre la capacidad de respuesta PER-y, por lo tanto, podría tener un efecto indirecto en el rendimiento de aprendizaje en las abejas 19, 20. El nivel de estrés se puede disminuir mediante la colocación de los viales de vidrio con las abejas directamente en hielo inmediatamente después de la recolección para inmovilizarlos rápidamente. Ha de tenerse en cuenta que las abejas necesitan más tiempo para recuperar el más largo es el período de anestesia es antes.

La visión tiene un efecto negativo en el aprendizaje táctil en las abejas 18. Por lo tanto es importante para ocluir la visión por la pintura de los ojos de un animal. Con el fin de aumentar el contraste visual de las grabaciones de vídeo, se recomienda utilizar pintura blanca (por ejemplo, Tipp-Ex). Se debe tener cuidado de no obtener el antenas en contacto con la pintura.

Aprenderrendimiento ing: Ex estudios en el laboratorio y sobre el terreno mostraron que la sensibilidad de sacarosa en abejas pecoreadoras afectar su capacidad de aprendizaje asociativo 21, 22. Alta sensibilidad sacarosa se correlaciona positivamente con una mejor adquisición táctil y actuaciones de discriminación. Recolectoras de polen de una colonia de abejas de miel son en promedio más sensible a la sacarosa que recolectoras de néctar en la mayoría de semanas de una temporada de forrajeo 23. Ellos pueden ser fácilmente identificados por las cargas de polen en sus patas traseras y capturado en la entrada de la colmena. Recolectoras de néctar con sensibilidad alta sacarosa pueden ser capturados al final de la temporada de alimentación, entre septiembre y octubre. Pueden ser seleccionados en comederos artificiales llenos de agua baja en azúcar concentrada colocada aproximadamente a 20 m de distancia de la colmena 23.

El rendimiento de aprendizaje y formación de la memoria depende fuertemente del estado de saciedad de una abeja durante el acondicionamiento 25. Un hambre ya period antes de acondicionamiento, por ejemplo, durante la noche, se puede mejorar el comportamiento de aprendizaje asociativo y aumentar el nivel de motivación de un animal.

Acondicionado Táctil: La PER se utiliza como la respuesta condicionada en un aprendizaje apetitivo protocolo 14. Por lo tanto, es fundamental que todas las abejas ensayados se muestra un completamente extendido PER para el estímulo no condicionado (estímulo azúcar) antes de acondicionado. Las abejas que no responden al estímulo de azúcar debe desecharse así como abejas que responden con un PER durante el contacto antenal con el estímulo táctil antes de acondicionado. De lo contrario, la capacidad de respuesta extremadamente baja o extremadamente alta de estos animales se confunden la curva de aprendizaje.

El estímulo táctil utilizada en este protocolo (cubo de latón con rejillas horizontales) fue elegido al azar. Las abejas también pueden ser condicionado a diferentes estímulos táctiles con diferentes formas y texturas (ver 10).

Para comparar adquisición en diferentes grupos de abejas (por ejemplo, frente a polen-recolectoras de néctar), una puntuación de adquisición se puede calcular 21. Esta puntuación es el número total de respuestas condicionadas a la CS y tiene un rango entre 0 (no condicionado PER) y 5 (PER condicionada después de cada ensayo de condicionamiento).

Análisis del vídeo: Diferentes análisis de vídeo métodos se utilizaron en el pasado para cuantificar los cambios en el comportamiento de movimiento antenal en 26 abejas, 27. Nuestro método tiene la ventaja de analizar los movimientos antenales sin necesidad de marcadores reflectantes en las antenas y los beneficios de la variedad de herramientas de procesamiento de imágenes en Matlab. Como un ejemplo, también se pueden analizar el tiempo de Antenncontactos col hacia un objeto, determinar la velocidad de movimiento antenal, calcular las posiciones angulares de las antenas en referencia a los ejes del cuerpo o discriminar entre el movimiento antenal izquierda y derecha.

Un PER que se produce durante la grabación de la respuesta antenal al objeto en abejas acondicionado podría interferir posteriormente con la detección automática de las antenas. En este caso es necesario para editar la película, por ejemplo, en VirtualDub, y para enmascarar el objeto que interfiere con el proceso de detección, por ejemplo, cubriendo la sección donde la proboscis aparece con una capa de color gris de la misma forma.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Damos las gracias a Joachim Erber para introducirnos en el paradigma de aprendizaje táctil en las abejas melíferas. Este trabajo fue apoyado por el Cluster de Excelencia 277 CITEC, financiado en el marco de la Iniciativa de Excelencia alemán.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pollen foragers, Apis mellifera L. Private hives
Glass vials (22 x 45 mm) Carl Roth GmbH Co X655.1
Brass tubes, 10 x 30 mm Self-produced
Brass cube, 3 x 5 mm Self-produced
Tipp-Ex (solvent-free) Tipp-Ex GmbH Co KG
Sucrose solution (30%) Household suger diluted in water
Ethanol (70%) Carl Roth GmbH Co 9065.3
Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) Carl Roth GmbH Co 59.1
Stop Watch Carl Roth GmbH Co L423.1
Micromanipulator Märzhäuser MM33 00-42-101-0000
Digital video camera Basler A602f-2
Macro lens for camera TechSpec VZM 200
Matlab R2009b The MathWorks

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References

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Comments

1 Comment

  1. can this protocol apply in other kinds of stimulus,such as vision cues or sound?

    Reply
    Posted by: Hong en T.
    April 26, 2014 - 12:54 AM

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