Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (

Neuroscience

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Summary

Neste protocolo, mostramos como condição aproveitado abelhas aos estímulos táteis e introduzir uma técnica de captura de movimento 2D para analisar a cinemática de multa escala padrão de amostragem antenal.

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Mujagić, S., Würth, S. M., Hellbach, S., Dürr, V. Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.). J. Vis. Exp. (70), e50179, doi:10.3791/50179 (2012).

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Abstract

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são insetos eussociais e bem conhecidos por sua complexa divisão do trabalho e capacidade de aprendizagem associativa 1, 2. As abelhas operárias passar a primeira metade de sua vida dentro da colméia escuro, onde estão as larvas de enfermagem ou a construção dos favos hexagonal regular de alimentos (por exemplo, pólen ou néctar) e prole 3. As antenas são extraordinários antenas multissensoriais e desempenham um papel fundamental em diversas funções táteis mediadas 4, incluindo a construção colméia 5 e 6 de reconhecimento de padrões. Mais tarde na vida, cada única abelha deixa a colméia para procurar alimentos. Em seguida, uma abelha tem que aprender a discriminar fontes de alimento rentáveis, memorizar a sua localização, e comunicar a seus companheiros de ninho 7. As abelhas utilizam diferentes sinais florais como cores ou odores 7, 8, mas também pistas tácteis da superfície pétala 9 para formar memórias multissensoriais da fonte de alimentação. Em laboratório conditions, as abelhas podem ser treinadas em um paradigma de aprendizagem apetitiva discriminar características do objeto tátil, como bordas ou sulcos com suas antenas 10, 11, 12, 13. Este paradigma da aprendizagem é estreitamente relacionado com o condicionamento clássico olfactory extensão da resposta tromba (PER) em abelhas encapsuladas 14. A vantagem do modelo de aprendizagem tátil no laboratório é a possibilidade de combinar as experiências comportamentais na aprendizagem com várias medições fisiológicas, incluindo a análise do padrão de movimento da antena.

Protocol

1. Preparando as abelhas

  1. Forrageiras néctar ou pólen são capturados no campo a partir de um alimentador de sacarose ou diretamente a partir da entrada colméia ao retornar de uma viagem de forrageamento. Cada única abelha é capturado dentro de um frasco de vidro, que é fechada com um tampão de espuma e levado imediatamente para o laboratório para posterior manipulação.
  2. No laboratório, as abelhas capturados são brevemente arrefecida no frigorífico a 4 ° C até se mostrar os primeiros sinais de imobilidade.
  3. Cada abelha única imobilizada é montado em um pequeno tubo de metal com fita adesiva entre a cabeça e no tórax e sobre o abdómen. Cuidados devem ser tomados para que a tromba e antenas são livremente móvel.
  4. Pinte os olhos compostos e ocelos da abelha fixo com tinta branca (por exemplo, livre de solvente Tipp-Ex) para ocluir visão.
  5. Adicionar uma pequena gota de cera derretida por trás da cabeça da abelha para corrigi-lo para a fita entre a cabeça eo tórax para evitar movimentos da cabeça durante as gravações.
  6. Marcar cada abelha com um número único na fita para facilitar a identificação e colocar o tubo com a abelha fixo em uma atmosfera húmida para evitar a desidratação.
  7. Alimentar cada abelha único durante 5 segundos, com gotículas de uma solução de sacarose a 30% apresentaram uma seringa e que todas as abelhas recuperar durante 30 min antes de iniciar o protocolo de condicionamento táctil.

2. Condicionado tátil

  1. Antes de condicionamento, cada abelha individual tem de ser testado para a resposta da extensão da probóscide (PER) a um estímulo de 30% de sacarose aplicada às antenas. Deste modo, a ponta do nariz tem de atravessar uma linha virtual entre as mandíbulas abertas. Descartar todas as abelhas que não respondem com um PER para o estímulo de sacarose.
  2. Para o condicionamento táctil utilizar um cubo de metal (por exemplo, 3 x 5 mm) com uma superfície lisa ou um padrão gravado, por exemplo, horizontal ou ranhuras verticais que formam uma grade com comprimento de onda de 150 um, como o estímulo condicionado (CS). Fou o estímulo não condicionado (EUA) utilizar uma solução de sacarose a 30% (açúcar doméstico, diluído em água).
  3. O cubo de latão (CS) é colocado sobre um suporte de um micromanipulador (por exemplo, Märzhäuser MM33) para garantir o posicionamento exacto durante o processo de condicionamento. Os EUA é apresentada ao abelha com uma seringa cheia com uma solução de sacarose a 30%.
  4. O procedimento de condicionamento consiste em cinco pares de estímulo táctil (CS) e uma solução de sacarose (EUA), com um intervalo inter-ensaio (ITI) de 5 min. Colocar uma única abelha em frente do micromanipulador com o estímulo táctil montado (CS). Posicionar o CS lentamente, de tal modo que a superfície do estímulo táctil é paralela à cabeça da abelha (Figura 1 A e B). A distância entre o animal e o objeto tátil deve estar no intervalo de o raio da antena de trabalho da abelha testado, isto é, a abelha deve ser capaz de verificar o estímulo táctil numa posição confortável wantenas tanto de ordem i. No exemplo mostrado na Figura 1, a distância era de 3 mm. Deixe a abelha digitalizar o estímulo tátil (CS) por 5 seg. Após o primeiro 3 seg, apresentar uma gotícula da sacarose a 30% (EUA) com uma solução de uma seringa sob a tromba. Utilize a ponta da seringa para levantar suavemente as tromba. Estimulação de sacarose sob a tromba vai provocar o incondicionado PER 15. Permitir que a abelha a lamber a recompensa de sacarose. Usar um cronometro com um sinal de alarme para manter os intervalos exactos de tempo durante o condicionamento.
  5. O PER condicionado é usada como uma medida para o sucesso da aprendizagem de uma abelha. Após os sorteios primeiro recompensados, as abelhas começam a responder a CS apresentação por extensão de seus probóscides, indicando que eles esperam a recompensa futura. A tromba totalmente estendida observados a qualquer momento durante a janela de tempo de 3 segundos de apresentação do estímulo tátil e antes da apresentação de sacarose é classificada como uma resposta positiva. Nenhuma resposta é contado negativo. O occurrence do PER tem de ser observado pelo experimentador. O percentual de abelhas que mostram o PER durante a apresentação CS é traçado para cada tentativa.

3. Gravações cinemáticas

  1. Movimentos antenais de uma única abelha aproveitado são gravados com uma câmera de vídeo digital com uma lente macro adequado (por exemplo Basler A602f-2 equipado com TechSpec VZM 200, operado a 50 fps através de uma conexão de fio de fogo). A câmara é posicionada acima do animal numa vista de cima para baixo (Figura 1 A). Na Figura 1, a resolução espacial das gravações é de 0,02 mm / pixel.
  2. Calibrar a câmera gravando imagens únicas de um tabuleiro de xadrez 10 mm x 10 com uma aresta de comprimento 1 mm diferentes orientações no âmbito do objectivo da câmara. A calibração pode ser feita com a caixa de ferramentas da câmara de calibração Matlab 16.
  3. Coloque uma única abelha fixa abaixo da lente da câmera. Apresentar o estímulo táctil, fixada a um micromanipulador, Para o animal. Proceder do mesmo modo como descrito para o condicionamento táctil, e gravar o movimento da antena enquanto a abelha é digitalizar o objeto. É importante que o intervalo de trabalho completo e antenal do estímulo táctil são visíveis. As escolhas de padrões de estímulo testado e números de ensaios dependem do projeto experimental.

4. Análise de Dados

  1. O cálculo da imagem de fundo é feito em Matlab. Primeiro, o valor médio tons de cinza ao longo do tempo tem que ser calculado para cada pixel. Objetos estáticos, como a cabeça fixa da abelha e do estímulo tátil, irá constituir o fundo da imagem. Os objectos em movimento, como a duas antenas, não irá fazer parte do fundo.
  2. Cada quadro do vídeo gravado deve ser carregada sequencialmente, e a diferença entre a imagem actual e a imagem de fundo tem de ser calculada. O resultado desta subtração enfatiza as partes da imagem que está se movendo de um quadro para outro. Ideally, as antenas da abelha são as únicas áreas de valores diferentes de zero (Figura 1C).
  3. Para processamento adicional, as duas maiores áreas com valores diferentes de zero de pixel são assumidos como sendo as antenas. Para ambas as antenas de uma máscara binária deve ser gerado para cada pixel contendo um valor de 1, se o pixel pertence à antena e 0 valor de outra forma. Esta máscara serve como uma base para a localização das pontas antenais mais tarde. Para ganhar uma máscara preliminar para a totalidade da imagem do cinzento-valor de cada pixel da imagem de diferença é comparada com um limiar pré-definido. Desde que cuidar de ruído ainda este limiar é escolhido para ser bastante baixa. A máscara de preliminar, então ainda tem dois tipos de erros: em primeiro lugar, devido a regiões da imagem de ruído pequenas ainda fazem parte da máscara. Em segundo lugar, as superfícies que pertencem à antena pode não ser necessariamente totalmente ligado. A última ocorre principalmente quando o fundo tem aproximadamente a mesma que a luminescência da antena. Para eliminar esses artefatos, padrãooperação de processamento de imagem morfológica são aplicadas, ou seja, uma combinação de imagem erosão e dilatação, contando com as funções padrão do Matlab imerode e imdilate respectivamente (ver 17 pp 158-205 para mais explicações). Após o processo de suavização das hipóteses antenas estão ainda contidos no interior da mesma máscara. Assim, como um próximo passo a máscara binária é agrupado para áreas disjuntas usando o padrão Matlab função bwlabel (veja 17 pp 40-48 para mais detalhes sobre o algoritmo de segmentação de imagem).
  4. O número de pixels por cluster é contado e os dois maiores grupos são selecionados. O centro de gravidade é calculada para distinguir entre a antena do lado esquerdo e direito (Figura 1D).
  5. A ponta da antena para cada antena pode ser definida como o pixel de um agrupamento com o valor mais elevado na direcção proximal para distal (ver Figura 1D).

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Representative Results

No experimento seguinte estudou como o aprendizado afeta o comportamento tátil amostragem antenais de abelhas. Para isso, é monitorado o movimento da ponta da antena de abelhas naive e condicionado antes e durante a apresentação de um estímulo táctil.

Em primeiro lugar, o movimento espontâneo antenal de um grupo de forrageadoras pólen (N = 42) foi registado durante 1 min. Metade das abelhas (N = 21) foi, em seguida, condicionado por emparelhamento cinco vezes um estímulo táctil com uma recompensa de sacarose a 30%. Este foi o grupo condicionado. O estímulo táctil foi a superfície de 30 x 50 mm de um cubo de metal com uma grade gravado horizontal (λ = 150 mm). A outra metade das abelhas (N = 21) não foi condicionada e utilizada como um grupo ingénuo. Figura 2 mostra a curva média de aprendizagem do grupo condicionado de abelhas. A percentagem de PER condicionado após a primeira recompensa é significativamente diferente do comportamento espontâneo (Figura 2 º.

Depois disso, o movimento da ponta da antena tanto no condicionado e o grupo ingénuo foi gravado novamente durante 1 minuto na presença do estímulo táctil Figura 3 A 1 -. B 2 mostra a distribuição dos locais de ponta da antena em ambos os grupos, antes e durante a apresentação do objeto tátil. Ambos, a ingenuidade e o grupo condicionado mudado o seu padrão de movimento da antena na presença de um estímulo táctil em comparação com o comportamento espontâneo. A probabilidade da ponta da antena de pesquisa e / ou amostra a área do estímulo é significativamente aumentada se o estímulo estava presente, demonstrando que a amostragem tátil envolve uma mudança significativa no padrão de movimento da antena em relação ao movimento espontâneo antenal. Isto é verdadeiro para os dois grupos de abelhas (Figura 3 C 1 e C (Figura 3 C 1 e C 2, de Mann-Whitney U, P <0,05; não houve diferença significativa entre os dois períodos de referência A na Figura 3C). Assim, o condicionamento táctil leva a um aumento do movimento antenal activa perto do objecto de amostragem e táctil da superfície do objecto, como anteriormente mostrado na Erber (2012) 18. Comparado com o grupo ingênuo, a distribuição espacial durante a apresentação do estímulo foi muito mais suave após o condicionamento (Compare Figura 3 B 1 e B 2).

Em resumo, os resultados desta experiência mostram que as abelhas podem ser formados de forma muito eficaz para responder a um estímulo táctil, e que a aprendizagem táctil é acompanhado por aumento da active busca e amostragem comportamento.

Figura 1
Figura de gravação de vídeo e um procedimento de rastreamento antenal A:.. Top-down vista de uma abelha fixa e o estímulo tátil. O estímulo táctil é posicionada na frente da cabeça da abelha fixo com os olhos ocluídos. Ele está localizado dentro da faixa de trabalho antenal. d e p indicam os locais distal e proximal em relação ao animal, B:. Vista lateral da mesma abelha e o estímulo táctil. A superfície do estímulo táctil e a cabeça da abelha (azul linhas pontilhadas) são paralelos um ao outro C:. Distintivas pixels que se deslocam a partir de pixels estáticos em uma sequência de vídeo. Subtraindo cada imagem a partir de um modelo de fundo permite a identificação das partes móveis, ou seja, a umntennae. A cabeça fixa da abelha e do estímulo tátil (indicado aqui como linhas pontilhadas vermelhas) são estáticos e não visível após a subtração D:. Definição de esquerda e direita e na ponta da antena. Os dois maiores grupos de pixels após subtracção são identificados como antenas. Cálculo do centro de gravidade permite distinguir entre o lado esquerdo (vermelho) e a antena (verde) para a direita. A ponta da antena, para cada antena (preto cruzada) pode ser definida como o pixel de um agrupamento com o maior valor no sentido distal.

Figura 2
Figura 2. Curva de aprendizado do condicionamento PER tátil. Forrageiras de pólen foram treinados usando cinco pares do CS (estímulo tátil) e dos EUA (solução de sacarose), com intervalo inter-julgamento de 5 min. A percentagem de respostas positivas de 21 animais é traçado para o comportamento espontâneo (espont) e duapresentação anel do CS após cada tentativa de condicionamento. A percentagem de PER observada após o primeiro e todos os seguintes recompensas é significativamente diferente do comportamento espontâneo (teste de Fisher exacto de probabilidade, p <0,001).

Figura 3
Figura 3. Normalizados distribuições médias de posição da ponta da antena, durante um período de 1 min. A distribuição da ponta da antena de cada abelha foi normalizada para o número total de pontos de dados por animal. Os painéis mostram os resultados de naïve (esquerda, n = 21) e as abelhas condicionado (direita, n = 21), antes (A) e durante a apresentação do estímulo (B) A 1 e A 2:.. Movimento espontâneo antenal antes da apresentação de estímulo A abscissa mostra a posição lateral da ponta da antena em relação ao the centro da cabeça (comparar com a Figura 1C e D). O eixo das ordenadas mostra a posição distai da ponta da antena. A escala de cores indica o percentual de tempo que a ponta da antena gasto em qualquer local. O período de gravação de 1 min foi equivalente a 3.000 quadros de vídeo B 1 e B 2:. Mesmo que em um 1,2, mas, durante a apresentação do estímulo C 1 e C 2:. Número médio de quadros em que a ponta da antena foi localizado dentro a área do objecto, isto é, ± 3 caixas relativas distal ou proximal para a superfície do estímulo. C1: grupo ingênuo; C2: grupo condicionado. As parcelas Box-Whisker mostrar a mediana, média, quartis, e varia de percentis 5-95% do número de quadros por minuto. Em ambos os grupos de abelhas, há uma diferença significativa entre o "estímulo não '(A) e" com estímulo' (B, C; teste de Wilcoxon Signed Rank-, C 1: P = 5,39 * 10 -4; C 2 -5). O número médio de quadros durante a apresentação do estímulo tátil é significativamente maior do que em abelhas condicionado em abelhas ingênuo (Mann-Whitney U, C 1 - C 2: P = 0,007). Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

Preparação das abelhas: Coleta e fixação das abelhas deve ser feito rapidamente, a fim de manter o nível de estresse do baixo animal. O stress tem um efeito sobre a capacidade de resposta PER-e, portanto, pode ter um efeito indirecto sobre o desempenho da aprendizagem em abelhas 19, 20. O nível de tensão pode ser reduzida ao colocar os frascos de vidro com as abelhas directamente em gelo imediatamente após a colheita para imobilizá-los rapidamente. Tem que ser tido em conta que as abelhas precisam de mais tempo para se recuperar o mais longo for o período de anestesia é antes.

Visão tem um efeito negativo sobre a aprendizagem tátil em abelhas 18. Portanto, é importante para ocluir visão pintando os olhos do animal. A fim de aumentar o contraste visual das gravações de vídeo, é recomendado o uso de tinta branca (por exemplo, a Tipp-Ex). Cuidados devem ser tomados para não começar o antenas em contato com a tinta.

Aprendering desempenho: Estudos anteriores em laboratório e de campo mostraram que a sensibilidade sacarose em forrageiras de abelhas afetar sua capacidade de aprendizagem associativa 21, 22. Sensibilidade sacarose alta está positivamente correlacionada com melhor aquisição tátil e performances de discriminação. Forrageiras de pólen de uma colônia de abelhas são, em média, mais sensível à sacarose do que na maioria dos coletores de néctar semana de uma temporada de forrageamento 23. Eles podem ser facilmente identificados pelas cargas de pólen em suas patas traseiras e pegou na entrada colméia. Forrageadoras de néctar com sensibilidade elevada de sacarose pode ser capturado no final de uma temporada de forrageamento, entre setembro e outubro. Eles podem ser seleccionados com alimentadores artificiais cheios com água de baixa concentração de açúcar colocado, aproximadamente, 20 m de distância da ramificação 23.

O desempenho de aprendizagem e formação da memória depende muito do estado de saciedade de uma abelha durante o condicionamento 25. A peri mais fomeod antes do condicionamento, por exemplo, durante a noite, podem melhorar o comportamento de aprendizagem associativa e aumentar o nível de motivação de um animal.

Condicionado táctil: A PER é usado como a resposta não condicionada de uma aprendizagem apetitivo protocolo 14. Portanto, é fundamental que todas as abelhas testados estão mostrando um totalmente estendido PER para o estímulo incondicionado (estímulo açúcar) antes do condicionamento. As abelhas que não respondem ao estímulo de açúcar deve ser descartado, assim como as abelhas, que respondem com um PER durante o contato antenal com o estímulo tátil antes do condicionamento. Caso contrário, a capacidade de resposta extremamente baixo ou extremamente elevados destes animais vai confundir a curva de aprendizado.

O estímulo tátil usado neste protocolo (cubo de bronze com grades horizontais) foi escolhido aleatoriamente. Mel de abelhas também pode ser condicionada a diferentes estímulos táteis com várias formas e texturas (ver 10).

Para comparar aquisição em diferentes grupos de abelhas forrageiras (por exemplo, pólen versus-Nectar), uma pontuação de aquisição pode ser calculado 21. Este resultado é o número total de respostas condicionadas para o CS e que tem um intervalo entre 0 (nenhum condicionados PER) e 5 (PER condicionado após cada ensaio de condicionamento).

Análise de vídeo: análises métodos de vídeo diferentes foram usadas no passado para quantificar as mudanças no comportamento do movimento antenais de abelhas 26, 27. O nosso método tem a vantagem de analisar os movimentos antenais sem a necessidade de marcadores reflectores nas antenas e vantagens a partir da variedade de ferramentas de processamento de imagem em Matlab. Como exemplo, pode-se também analisar a temporização de antenncontatos ai para com um objeto, determinar a velocidade do movimento da antena, calcular as posições angulares das antenas em relação aos eixos do corpo ou discriminar entre esquerda e direita movimento antenal.

A PER que ocorre durante a gravação de resposta antenal ao objecto em abelhas condicionado poderia interferir posteriormente com a detecção automática das antenas. Neste caso, é necessário modificar o filme, por exemplo, no VirtualDub, e para mascarar o objeto que interfere com o processo de detecção, por exemplo cobrindo o ponto onde a tromba aparece com uma camada de cinza com a mesma forma.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos Joachim Erber por nos apresentar o paradigma de aprendizagem tátil em abelhas. Este trabalho foi apoiado pelo Cluster de Excelência 277 CITEC, financiado no âmbito da Iniciativa de Excelência alemão.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pollen foragers, Apis mellifera L. Private hives
Glass vials (22 x 45 mm) Carl Roth GmbH Co X655.1
Brass tubes, 10 x 30 mm Self-produced
Brass cube, 3 x 5 mm Self-produced
Tipp-Ex (solvent-free) Tipp-Ex GmbH Co KG
Sucrose solution (30%) Household suger diluted in water
Ethanol (70%) Carl Roth GmbH Co 9065.3
Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) Carl Roth GmbH Co 59.1
Stop Watch Carl Roth GmbH Co L423.1
Micromanipulator Märzhäuser MM33 00-42-101-0000
Digital video camera Basler A602f-2
Macro lens for camera TechSpec VZM 200
Matlab R2009b The MathWorks

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References

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Comments

1 Comment

  1. can this protocol apply in other kinds of stimulus,such as vision cues or sound?

    Reply
    Posted by: Hong en T.
    April 26, 2014 - 12:54 AM

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