Attivazione Optogenetic di zebrafish neuroni somatosensoriali con Chef-tdTomato

Neuroscience

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Summary

Optogenetic tecniche hanno permesso di studiare il contributo dei neuroni specifici comportamenti. Descriviamo un metodo in zebrafish larvale per l'attivazione di singoli neuroni somatosensoriali che esprimono una variante channelrhodopsin (Chef) con un diodo-pompato allo stato solido (DPSS) laser e registrare i comportamenti suscitate con una telecamera ad alta velocità video.

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Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (71), e50184, doi:10.3791/50184 (2013).

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Abstract

Zebrafish larvali stanno emergendo come modello per descrivere lo sviluppo e la funzione di semplici circuiti neurali. Grazie alla loro fecondazione esterna, rapido sviluppo, e la traslucenza, zebrafish sono particolarmente adatti per gli approcci optogenetic indagare funzione neurale circuito. In questo approccio, fotosensibili canali ionici sono espressi in neuroni specifici, consentendo lo sperimentatore per attivare o inibire a volontà e quindi valutare il loro contributo a specifici comportamenti. L'applicazione di questi metodi in zebrafish larvale è concettualmente semplice, ma richiede l'ottimizzazione dei dettagli tecnici. Qui mostriamo una procedura per esprimere una variante channelrhodopsin in larve di zebrafish neuroni somatosensoriali, singole cellule foto-attivazione, e la registrazione dei comportamenti che ne derivano. Introducendo alcune modifiche ai metodi precedentemente stabiliti, questo approccio può essere utilizzato per ottenere risposte comportamentali da singoli neuroni attivati ​​finoad almeno 4 giorni dopo la fecondazione (DPF). In particolare, abbiamo creato un transgene con un neurone somatosensoriale enhancer, CREST3, per guidare l'espressione del tag channelrhodopsin variante, lo chef-tdTomato. Iniettando questo transgene in 1-cell risultati embrioni allo stadio di espressione mosaico nei neuroni somatosensoriali, che può essere ripreso con microscopia confocale. Illuminante identificato le cellule di questi animali con la luce di un laser 473 nm DPSS, guidati attraverso un cavo in fibra ottica, suscita comportamenti che possono essere registrati con una telecamera ad alta velocità e video analizzati quantitativamente. Questa tecnica potrebbe essere adattato per i comportamenti di studio suscitato attivando ogni neurone zebrafish. La combinazione di questo approccio con perturbazioni genetiche o farmacologici sarà un potente strumento per studiare la formazione di circuiti e la funzione.

Introduction

Lo sviluppo di metodi optogenetic per promuovere o inibire l'eccitabilità neuronale con lunghezze d'onda definite di luce ha permesso di studiare la funzione di distinte popolazioni di neuroni nei circuiti neurali che controllano il comportamento 1, 19, 21. Questa tecnica viene spesso utilizzato per attivare gruppi di neuroni, ma può anche essere utilizzato per attivare i singoli neuroni. Larve Zebrafish sono particolarmente suscettibili di questi metodi in quanto sono trasparenti, il loro sistema nervoso si sviluppa rapidamente, e la creazione di animali transgenici è veloce e di routine. Tuttavia, notevoli ostacoli tecnici da superare per ottenere l'attivazione affidabile singolo neurone.

Per ottimizzare la procedura per l'attivazione dei neuroni optogenetic zebrafish singoli, ci siamo concentrati sui neuroni somatosensoriali. Larve Zebrafish rilevare una varietà di stimoli somatosensoriali con due popolazioni di neuroni: i neuroni del trigemino, che innervano la testa, e ROHON-Beard (Rb) neuroni che innervano il resto del corpo. Ogni neurone trigeminale e RB proietta un assone periferico che si dirama lungo in pelle di individuare stimoli e un assone centrale che si connette a valle circuiti neurali. Animali risponde al tocco Già il 21 ore post-fecondazione (HPF), indicando che i circuiti coerenti somatosensoriali si sono formati 5, 18. Durante lo sviluppo larvale, almeno un po 'di sinapsi del trigemino e RB neuroni sulla cellula di Mauthner di attivare risposte di fuga classici, ma accumulando evidenza suggerisce che ci sono più classi di neuroni somatosensoriali con diversi modelli di connettività che possono suscitare variazioni sul comportamento di fuga 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. La motivazione per lo sviluppo di questo metodo è di caratterizzare la funzione del comportamento di diverse classi di neuroni somatosensoriali, ma questo approccio potrebbe in linea di principio essere usato per studiare la funzione del neurone o qualsiasi popolazione di neuroni in larval zebrafish.

Douglass et al. Precedentemente descritto un metodo per l'attivazione channelrhodopsin-2-esprimono neuroni somatosensoriali con luce blu, suscitando comportamento di fuga 3. Il loro approccio utilizzato un elemento enhancer del gene isl1 per guidare l'espressione di CHR2-EYFP nei neuroni somatosensoriali. Questo transgene, tuttavia, è stato segnalato per visualizzare fluorescenza relativamente debole, richiedendo co-iniezione di un secondo reporter, UAS :: GFP, per permettere la visualizzazione di cellule esprimenti CHR2-EYFP. Questo approccio è stato utilizzato per ottenere risposte comportamentali tra 24-48 HPF, ma non potrebbe mai ottenere una risposta Dopo 72 HPF. Così, mentre questo metodo funziona per studiare circuiti neurali nelle fasi larvali molto precoci (24-48 HPF), è inadeguato per la caratterizzazione di circuiti neurali e le risposte comportamentali in età superiore larve, quando più risposte diverse comportamentali sono evidenti e circuiti neurali sono più maturi.

Abbiamo cercato dimigliorare la sensibilità di questa tecnica per caratterizzare la funzione delle sottopopolazioni di neuroni RB larvali. Per migliorare l'espressione abbiamo utilizzato un somatosensoriale-specifico enhancer (CREST3) 20 per guidare l'espressione di LexA-VP16 e un tratto di sequenze operatore lexA (4xLexAop) 11 per amplificare l'espressione di una fluorescenza etichettato fotoattivabile canale. Questa configurazione amplificato espressione del canale, eliminando la necessità di co-esprimere un secondo reporter e che ci permette di determinare direttamente l'abbondanza relativa del canale in ogni neurone. Utilizzando il LexA / LexAop sequenza avuto l'ulteriore vantaggio di consentire di introdurre il transgene in linee reporter di zebrafish che utilizzano il sistema Gal4/UAS. Espressione transitoria di questo transgene portato a diversi livelli di espressione, ma di solito era abbastanza robusto per visualizzare sia il corpo cellulare e le proiezioni assonali dei singoli neuroni per diversi giorni. Per ottimizzare la sensibilitàlità alla luce abbiamo usato la luce attivata canale chef, una variante channelrhodopsin costituito da una chimera di channelopsin-1 (Chop1) e channelopsin-2 (Chop2) con un sito di crossover a elica ciclo EF 13. Questo canale è attivato alla stessa lunghezza d'onda CHR2, ma richiede una minore intensità di luce per l'attivazione, il che rende più sensibili di altri canali comunemente utilizzati, compresi CHR2. La proteina chef era fusa alla proteina fluorescente rossa, tdTomato, che ci permette di selezionare per l'espressione della proteina senza attivare il canale. Come sorgente luminosa, abbiamo utilizzato un diodo pompato a stato solido (DPSS) laser accoppiato ad un cavo in fibra ottica per fornire una precisa, potente impulso di luce blu per una regione specifica delle larve. Questo ha permesso di concentrare la luce laser sui neuroni individuali, eliminando la necessità di trovare rare animali transgenici che esprimono il canale in un singolo neurone. Usando questo approccio, siamo stati in grado di attivare i neuroni RB singoli, registrare risposta comportamentales con una telecamera ad alta velocità video e immagine i neuroni attivati ​​ad alta risoluzione con microscopia confocale.

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Protocol

Preparare la seguente prima del tempo.

1. Preparare Optic Cable

  1. Creare un contenitore per il cavo ottico fondendo il collo rastremata di una pipetta Pasteur di vetro su un becco Bunsen per creare un angolo di ~ 150 °.
  2. Utilizzando un cutter filo o una lametta, tagliare con cautela il cavo ottico in due pezzi. Ogni pezzo deve avere una estremità con un FC / adattatore PC ed una estremità esposta. Conservare un pezzo come un cavo di riserva.
  3. Spelare il cavo ottico verso il rivestimento rimuovendo la giacca fibre e le fibre di rinforzo (Figura 1A) da 5,0 centimetri di fine taglio del cavo.
  4. Inserire il cavo ottico in preparato pipetta Pasteur. Assicurarsi cavo può facilmente muoversi dentro e fuori della punta della pipetta.
  5. Con cavo ottico che sporge dalla punta della pipetta Pasteur, tagliare con attenzione e rimuovere rivestimenti in fibra di tutto in fibra di vetro, ~ 2 mm dal fine taglio.
  6. Utilizzando una penna / vetro tagliatore di diamanti, nick la fibra di vetro e rompere off fine di creare un taglio netto / superficie alla fine della fibra (Figura 1B).
  7. Ritrarre ottica in pipetta Pasteur per la conservazione. Ripetere il punto (1,6), se punta della fibra ottica viene tagliato o si rompe in modo non uniforme.
  8. Cavo ottico in posizione pipetta Pasteur utilizzando un micromanipolatore (Figura 1C).

Procedure 2-8 descrivono un metodo per l'iniezione di transgeni in embrioni in generale da molti esperimenti zebrafish. Variazioni su questo metodo, come quelli descritti in altri video jove 6, 7, 8, 9, 22 sono ugualmente efficaci.

2. Tirare aghi da iniezione

  1. Utilizzando un estrattore ago, tirare tubi in vetro borosilicato in due aghi da iniezione con una punta gradualmente ridotta. Impostazioni Puller varia. (Su un estrattore ago Sutter Instruments usiamo impostazioni: P = 500, calore = 720, Pull = 50, = 70 Velocità e Tempo = 150). Ogni estrattore ago è diverso, quindi ottimizzare le impostazioni puller emempiricamente. Per ulteriori aghi conici, aumentare il calore e / o Pull. Per aghi meno conici, aumentare il tempo e / o Pull diminuzione.
  2. Aghi Conservare in un contenitore sicuro (ad esempio una piastra di Petri con nastro laminato, fuori lato adesivo).

3. Versare stampi ad iniezione

  1. Sciogliere 0,5 g di agarosio in 30 ml embrione / acqua blu, fino agarosio si è completamente sciolto.
  2. Versare in metà inferiore di una piastra di Petri.
  3. Posizionare stampo rettangolare con montaggio pozzetti (Figura 2) in agarosio, facendo attenzione a limitare la formazione di bolle intorno ai pozzi.
  4. Lasciare agarosio a solidificare.
  5. Rimuovere stampo e riempire piastra di Petri con blu / acqua embrione.
  6. Conservare in posizione verticale, riempita con acqua pulita, a temperatura ambiente per il giorno stesso o a 4 ° C per un uso futuro.

4. Fare Mix plasmide DNA per preparazioni iniettabili

  1. Diluire DNA plasmidico ad una concentrazione di 50 ng / ml con 1:10 rosso fenolo in DDH 2 O. PerEsempio:
    1,0 ml DNA plasmidico (250 ng / ml)
    0,5 ml rosso fenolo
    3,5 ml DDH 2 O
  2. Mix DNA può essere conservato a temperatura ambiente se utilizzare immediatamente o conservato a 4 ° C per diversi giorni.

5. Impostare Coppie di accoppiamento

Questo dovrebbe essere fatto la sera prima avete intenzione di fare iniezioni.

  1. Riempire vasche di allevamento con l'acqua del sistema e luogo pesci di sesso maschile e femminile insieme. Se le iniezioni non può essere eseguita appena luci accende nella struttura, separata pesce maschio e femmina con un divisore.

6. Preparati per iniezioni (può essere fatto in attesa di embrioni)

  1. Accendere la pressione dell'iniettore rig. Assicurarsi che il sistema è impostato su DC. Inizia con il set di durata dell'impulso a 1.
  2. Aprire la valvola AIR eRegolare la pressione iniettore a ~ 20 psi.
  3. Utilizzando un ambito dissezione con il massimo ingrandimento, rompere punta dell'ago con una pinza o un poker per creare un 2 micron di apertura ~ (Figura 3, Movie 1).
  4. Riempire aghi con mix di DNA: 1. Posizionando il, lato punta dell'ago in alto, nel mix DNA e lasciando l'ago riempire per azione capillare o 2. Utilizzando un lungo raggiungere punta di pipettare 1-2 microlitri del DNA miscelare direttamente nell'ago.
  5. Luogo pieno ago in un luogo sicuro fino al momento di iniettare.

7. Raccogliere embrioni

  1. Dopo impianto luci si sono rivolti, rimuovere divisori (se applicabile). Raccogliere gli embrioni con un colino / setaccio piccolo e trasferirli in una capsula di Petri con blu dolce / acqua embrione.

8. Iniettare embrioni allo Stage cella 1-2

  1. Trasferimento embrioni raccolti per stampi ad iniezione con una pipetta di plastica.
  2. Utilizzando un microscopio da dissezione, spingere delicatamente embrioni inpozzetti con forcipe o un poker smussato (Figura 4, Movie 2).
  3. Inserire l'ago caricato in un micromanipolatore e la posizione più embrioni.
  4. Calibrare volume di iniezione regolando la durata dell'impulso di 1 step con incrementi fino a raggiungere il volume desiderato (~ 1 nl). Questo potrebbe essere tarato con un vetrino micrometrico, come descritto in un video precedenti Giove 8, 22, ma per questo esperimento precisione non è necessaria, poiché una vasta gamma di volumi di iniezione comporterà espressione adeguata.
  5. Iniettare ~ 1 nl DNA miscelare direttamente nella cella e ripetere per tutti gli embrioni. DNA può anche essere iniettato nel tuorlo, ma tende ad essere meno efficiente (Figura 5, Movie 3).
  6. Rimuovere gli embrioni iniettati da stampo con una leggera corrente di blu / acqua embrione.
  7. Conservare iniettato embrioni a 28,5 ° C al buio.
  8. Rimuovere non fecondate, gli embrioni morti o periodicamente.
  9. Trattare embrioni with PTU tra 18-24 HPF per prevenire la pigmentazione.

9. Schermo per espressione del transgene

  1. Manualmente dechorionate 24-48 embrioni HPF con pinze.
  2. Anestetizzare larve con 0,02% tricaine.
  3. Utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione, identificare larve con RB o un'espressione neurone trigeminale e trasferirli in un nuovo piatto fresco con PTU blu / embrione acqua. Embrioni con scarsa espressione in cellule facilmente identificabili sono ottimali, ma singoli neuroni saranno destinati per l'attivazione di un cavo a fibre ottiche così un'ampia gamma di densità espressione è accettabile.
  4. Embrioni Conservare a 28.5 ° C al buio fino a quando desiderato fase sperimentale.

10. Montare larve per esperimenti di comportamento

  1. Fai 1,5% bassa fusione agarosio in DDH 2 O e conservare in un blocco termico 42 ° C per evitare che la solidificazione.
  2. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, trasferimento uno dei pre-screening larve in una vascae del 1,5% di agarosio a bassa fusione con un minimo di blu / embrione acqua possibile.
  3. Trasferire larve in una goccia di agarosio su una piccola scatola di Petri.
  4. Sotto un microscopio da dissezione, posizione larva fino dorsale.
  5. Quando agarosio si è solidificato, tagliare via la agarosio con una lama di rasoio sottile (bisturi # 11), lasciando un cuneo di agar intorno alla larva intera.
  6. Fare due tagli diagonali ai lati del tuorlo, prendere attenzione a non intaccare la larva.
  7. Riempire l'area circostante l'agarosio con embrione / acqua blu.
  8. Tirare agarosio lontano dal tronco e coda della larva (Figura 6).

11. Preparare ad alta velocità della fotocamera e software di imaging

  1. Montare ad alta velocità, fotocamera sulla dissezione portata.
  2. Collegare la fotocamera al computer.
  3. Accendere il computer.
  4. Attiva telecamera ad alta velocità.
  5. Apri video / software di imaging (Usiamo software di imaging AOS e descrivere le procedure per l'utilizzo di qui, ma imagingIl software è ugualmente accettabile).
  6. Regolare le impostazioni della fotocamera di conseguenza (vale a dire 1.000 fotogrammi al secondo (fps), tampone di trigger 50% o altre impostazioni preferite).
  7. Avviare la registrazione.

12. Attivare singoli neuroni con un laser 473 nm

  1. Allega stimolatore, laser e ottica.
  2. Accendere stimolatore.
  3. Impostare stimolatore ad un massimo di 5 volt e una durata di impulso di 5 msec.
  4. Accendere il laser secondo le istruzioni del produttore.
  5. Utilizzare un microscopio da dissezione per posizionare la punta del cavo ottico vicino al corpo cellulare di un neurone con lo chef-tdTomato espressione (Figura 6).
  6. Consegnare impulso di luce blu per attivare neurone sensoriale.
  7. Record comportamento utilizzando un telecamera ad alta velocità fissato a 500 o 1.000 fotogrammi al secondo.
  8. Ripetere esperimento come desiderato, in attesa 1 minuto tra ogni attivazione per evitare assuefazione. (Si registra un minimo di tre risposte per ogni neurone).
  9. Alarve di rilascio, indagare separatamente agarosio con una pinza, facendo attenzione a non ferire l'animale. Questo animale può essere consentito di sviluppare ulteriormente e la procedura può essere ripetuta in una fase precedente per caratterizzare sviluppo del comportamento. L'embrione può anche essere rimontato per alta risoluzione confocale della cella attivata per correlare il comportamento con struttura cellulare, come descritto di seguito.
  10. Trasferimento larva di piastra di coltura con il blu dolce / acqua embrione. Usiamo una piastra a 24 pozzetti per tenere traccia delle larve individuale.

13. Immagine Neuron (s) con un microscopio confocale

  1. Anestetizzare larve con 0,02% tricaine.
  2. Monte larve, dorso alto, in basso fuso 1,2% agarosio o in uno stampo dorsale.
  3. Immagine chef-tdTomato neuroni con un laser a 543 nm e filtro equo ed obiettivo. Usiamo un obiettivo 20x.
  4. Rimuovere larve di agarosio e tornare al benessere individuale con il blu / acqua embrione.
  5. Conservare a 28.5 ° C al buio per il further analisi.

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Representative Results

Figura 1
Figura 1. Cavo ottico impostato. (A) Livelli di un cavo in fibra ottica. (B) cavo in fibra ottica in Stripped una pipetta Pasteur. (C) del cavo in fibra ottica in pipetta Pasteur posizionata utilizzando un micromanipolatore.

Figura 2
Figura 2. Iniezione stampo modello.

Figura 3
Figura 3. (Movie 1). Rompere l'ago.

Figura 4
Figura 4. (Movie 2). Posizionamento embrioni nello stampo ad iniezione.

ther.within-page = "always"> Figura 5
Figura 5. (Movie 3). Iniettando 1 nl mix DNA in 1 embrione unicellulare stadio.

Figura 6
Figura 6. Schema di una larva di zebrafish montato e neuroni di rappresentanza coinvolti nella risposta al tocco larvale. Larve Zebrafish sono stati parzialmente montati in 1,5% di agarosio a bassa fusione (rappresentati da linee tratteggiate che circondano la porzione rostrale della larva). Un neurone trigeminale (nella testa) e un ROHON-Beard neurone (nel bagagliaio) sono rappresentati in rosso. Cellule Mauthner sono delineati da linee tratteggiate nella larva. Il cavo ottico (bianco) viene posizionato sopra il corpo RB neurone.

oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Figura 7 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figura 7. (Filmato 4). Attivazione di un singolo neurone RB expressingChEF provoca una risposta comportamentale. (A) Ancora cornici raffigurante l'attivazione di un singolo neurone RB esprimere Chef-tdTomato. Singoli neuroni sono stati attivati ​​da un impulso di 5 msec da un laser a 473 nm blu tramite un cavo a fibra ottica 200 micron. Tensione guida del laser blu è stato fissato a un massimo di 5 volt. Il comportamento risultante è stata registrata a 1.000 fotogrammi al secondo da una telecamera ad alta velocità. (B) la microscopia confocale è stato utilizzato per l'immagine del neurone attivato RB. Arrow mostra regione stimolata in alambicchi di comportamento. (C) l'immagine ingrandita di RB neurone indicato in (B). Bar Scala, 100 micron. (Film 5 e 6) stesso pesce, (Movie 5) attivazione trigemino, (Film 6) RB neurone su estensione tuorlo.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

Figura 8
Figura 8. Latenza del comportamento in condizioni variabili. Per la maggior parte degli esperimenti abbiamo attivato un singolo neurone in ~ 35 larve hpf esprimere chef-tdTomato con un 5 msec impulso da un laser a 473 nm blu guidato da una sorgente di tensione di 5 V (Figura 6). Per comprendere meglio le dinamiche di attivazione Chef, abbiamo variato i parametri per determinare il loro effetto sul comportamento. (A) La durata della stimolazione della luce (5 msec rispetto a 10 msec) non ha alterato la latenza quando quantificata dall'inizio di impulso di luce. (B) A ~ 35 HPF, tensione colpisce inversamente latenza. Tensioni inferiori comportato un aumento della latenza di movimento. Per i nostri esperimenti, abbiamo utilizzato la massima tensione (5 V) permissible per il nostro apparato laser, che ha suscitato i comportamenti stereotipati affidabile dalla maggior parte dei neuroni che esprimono vivacemente RB.

Figura 9
Figura 9. (Film 7). Attivazione di chef-tdTomato esprimere neuroni RB a 60 larve HPF. (A) Still fotogrammi raffiguranti l'attivazione dei neuroni che esprimono RB chef-tdTomato da un msec 10 impulsi di un laser 473 nm blu tramite un cavo in fibra ottica 200 micron. Il comportamento risultante è stata registrata a 1.000 fotogrammi al secondo da una telecamera ad alta velocità. (B) La microscopia confocale è stato utilizzato per l'immagine attivata RB neurone (s). Arrow mostra regione stimolata in alambicchi di comportamento. Bar Scala, 100 micron.

Figura 10 o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figura 10. (Film 8). Attivazione di chef-tdTomato esprimere neuroni RB in 4 larve dpf. Fotogrammi che ritraggono l'attivazione dei neuroni che esprimono RB chef-tdTomato da 20 msec impulso da un laser a 473 nm blu tramite un cavo in fibra ottica 200 micron. Il comportamento risultante è stata registrata a 1.000 fotogrammi al secondo con una telecamera ad alta velocità.

Movie 1. Clicca qui per visualizzare filmati .

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Movie 4.ttp "target =" :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg _blank "> Clicca qui per visualizzare filmati.

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Movie 7. Clicca qui per visualizzare filmati .

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Discussion

Abbiamo descritto un approccio per l'attivazione dei neuroni optogenetic RB singole in zebrafish vivo. Il nostro metodo utilizza transgenesi transitoria per esprimere una variante fluorescente tag channelrhodopsin, chef-tdTomato 13, in specifici neuroni somatosensoriali. Questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l'uso nelle popolazioni larvali zebrafish altre cellule.

Utilizzando questo approccio abbiamo costantemente suscitato risposte comportamentali 34-48 larve hpf esprimere Chef-tdTomato. Utilizzo di un 5 msec impulso di luce blu a 5 V, siamo stati in grado di attivare i neuroni RB singoli (Figura 7). Posizionando la fibra ottica in diversi punti lungo l'animale, abbiamo trovato che era necessario per dirigere la luce blu direttamente in un corpo cellulare per provocare una risposta comportamentale. La luce lampeggia non ha provocato una risposta da larve che non Chef Express. Inoltre, non impulsi di luce lungo l'assone centrale o periferico l'assone tratto una risposta, enche in larve giovani (dati non mostrati). Questa struttura era vantaggioso perché abbiamo potuto tranquillamente attivare singoli neuroni negli animali in cui sono stati etichettati i neuroni più, anche se gli assoni centrali di altri neuroni passato vicino corpo cellulare del neurone bersaglio di (Film 4-6).

Per verificare l'affidabilità del metodo di valutazione parametri cinematici, abbiamo determinato la latenza della risposta di fuga (il tempo di attivazione luce di risposta comportamentale) tra 40 e 48 HPF, un parametro che è noto per essere altamente stereotipato. Per determinare se la durata dello stimolo luce influenza l'attivazione dei neuroni, abbiamo illuminato neuroni bersaglio per 5 o 10 msec (Figura 8A). Poiché la latenza comportamentale in entrambe le condizioni erano le stesse quando calcolato dall'inizio dell'impulso luce, abbiamo concluso che la durata dell'impulso di luce non influenza la latenza del comportamento. Tuttavia, abbiamo trovato che la riduzione della tensione aumentata °latenza e di un comportamento (Figura 8B). A 5 V, tuttavia, molte risposte (9 su 16 pesci) erano 20 ± 5 msec, simile a quello riportato per latenza risposte di fuga naturali. Pertanto, attivando i neuroni con 5 V avvicina attivazione massima.

Parametri per l'efficace suscitare risposte comportamentali di attivare neuroni RB singoli variavano in età superiore larve. Abbiamo successo suscitato risposte comportamentali da animali come vecchio come 4 dpf, sostanzialmente in ritardo rispetto alla precedentemente riportato. Tuttavia, mentre l'attivazione dei neuroni RB singole con un impulso di 5 msec luce a 5 V costantemente portato ad una risposta comportamentale prima 48 HPF, attivazione di larve anziani (> 60 HPF) non era coerente. Impulsi più lunghi (10-100 msec) di luce erano spesso necessaria l'attivazione di neuroni in larve di età superiore (Figura 9 e 10, Movie 7 e 8, rispettivamente). Pertanto, parametri di attivazione può essere necessarioessere ottimizzato / calibrato in base allo stadio sperimentale.

L'approccio che descriviamo qui può essere usato per molte applicazioni potenziali. Stiamo usando questo metodo per definire le risposte comportamentali indotte da differenti sottotipi di neuroni, ma potrebbe anche essere utilizzato per caratterizzare lo sviluppo delle risposte comportamentali come l'animale matura, gli effetti dei farmaci o mutanti sul comportamento, o, in combinazione con la fisiologia o imaging, per caratterizzare circuiti a valle attivate da un neurone identificato. Viceversa, i canali inibitori, come halorhodopsin, potrebbe essere utilizzato per inibire neuroni specifici all'interno di una rete neurale.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Acknowledgements

Ringraziamo Fumi Kubo, Tod Thiele e HerwigBaier (UCSF / Max-Planck-Institut) per un parere sulla sperimentazione dei comportamenti e di laser DPSS impostati; Heesoo Kim e Chiara Cerri dal Corso di MBL Neurobiologia per l'assistenza nella Chef-tdTomato esperimenti; PetronellaKettunen (Università di Göteborg ) per la collaborazione iniziale di esperimenti optogenetic, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca e John Milligan (UCLA) per un parere tecnico, e Roger Tsien (UCSD) per il cuoco-tdTomato costruire. Questo lavoro è stato supportato da una (5F31NS064817) premio NRSA a AMSP e una borsa di studio dalla NSF (RIG: 0.819.010) ad AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Glass Pasteur pipette Fisher 1367820B or equivalent (10-15 mm diameter)
200 μm optic fiber ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
Adjustable Stripping Tool ThorLabs AFS900 or Three-Hole Stripping Tool (FTS4)
Diamond Wedge scribe ThorLabs S90W
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 or equivalent
Borosilicate glass tubing with filament Sutter Instruments BF-100-78-10
Injection mold n/a n/a Figure 5
1.5 ml centrifuge tubes Any Any
Petri dish (100x15 mm) Any Any
Petri dish (60x15 mm) Any Any
Pressure injector ASI MPPI-3 or equivalent
Micromanipulator and metal stand Narashige M152 or equivalent
Disposable plastic pipettes Fisherbrand 13-711-7 or equivalent
Poker (Pin holder and Insect pin) Fine Science Tools, Inc. 26018-17 and 26000-70 or equivalent
Forceps Fine Science Tools, Inc. 11255-20 or equivalent
Microloader pipette tips Eppendorf 9300001007
28.5 °C incubator any any
42 °C heat block Any Any
Non-Sterile scalpel blades #11 Fine Scientific Tools, Inc. 10011-00 or equivalent
Dissecting scope Zeiss Stemi or equivalent
Fluorescent dissecting scope with standard filter Any any or equivalent
Confocal microscope Zeiss LSM 510 or 710 or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives
High speed camera AOS Technologies, Inc. X-PRI (130025-10) or equivalent
473 nm portable laser Crystal lasers CL-473-050 or higher power, with TTL option
S48 Stimulator Astro-Med, Inc. Grass Instrument division S48K or equivalent
FC/PC to FC/PC mating sleeve ThorLabs ADAFC1 May need for optic cable connection
Laser Safety Glasses ThorLabs LG10 or equivalent
24 culture plates Genesee 25-102 or equivalent
Single depression slides Fisher S175201 Or equivalent
Reagent
Instant ocean Aquatic Ecosystems IS50
Methylene blue Fisher S71325
Phenol red Sigma P4758
Agarose EMD 2125 or equivalent
Low Melt agarose Sigma A9045 or equivalent
PTU Sigma P7629
Tricaine Sigma A5040
blue/embryo water 10 L ddH2O
0.6 g Instant Ocean
6 drops methylene blue
phenol red (5 mg/ml in 0.2 M KCl)
100x PTU 0.150 g PTU
50 ml ddH2O
dissolve at 70 °C, shake often
aliquot and store at -20 °C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml blue/fish water
Tricaine stock solution 400 mg tricaine
97.9 ddH2O
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 adjust pH to ~7.0
store in 4 °C or -20 °C for long term storage

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References

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